Name: Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: למד ספקטרוסקופיית תנודות זריחה לחקירת אינטראקציות חלבון-חלבון בקשרים בין תאים בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת מחקר ישיר בתאים חיים ללא צורך בקיבוע או הרס תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן בחלקו על ידי דויטשה פתוח (DFG) להעניק 254850309. המחברים מודים Luckner מכירה את מאדלן על קריאה ביקורתית של כתב היד.

<ol><li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. <a target="_blank" href="https://www.goodreads.com/book/show/13400.Molecular_Biology_of_the_Cell">Molecular biology of the cell</a>. , Garland Science. (2002).</li>
<li>Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherins+in+embryonic+and+neural+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cadherins in embryonic and neural morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).</li>
<li>Harris, T. J. C., Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherens+junctions%3A+from+molecules+to+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adherens junctions: from molecules to morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (7), 502-514 (2010).</li>
<li>Hernández, J. M., Podbilewicz, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29254991">The hallmarks of cell-cell fusion.</a> Development. 144 (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse.</a> Nature Reviews Immunology. 3 (12), 973-983 (2003).</li>
<li>Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+and+dimerization+of+APLP1+are+strikingly+different+from+APP+and+APLP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2.</a> Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).</li>
<li>Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+and+believing%3A+recent+advances+in+imaging+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions.</a> F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273(2015).</li>
<li>Kashef, J., Franz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+for+analyzing+cell-cell+adhesion+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development.</a> Developmental Biology. 401 (1), 165-174 (2015).</li>
<li>Soba, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-+and+heterodimerization+of+APP+family+members+promotes+intercellular+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion.</a> The EMBO Journal. 24 (20), 3624-3634 (2005).</li>
<li>Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+dynamics+of+cadherin+interactions+at+cell-cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (24), 9857-9862 (2011).</li>
<li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+%28GRASP%29+Defines+Cell+Contacts+and+Synapses+in+Living+Nervous+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems.</a> Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).</li>
<li>Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+amyloid+precursor-like+protein+1+trans+interactions+in+cell-cell+adhesion+platforms+investigated+via+fluorescence+fluctuation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy.</a> Molecular biology of the cell. 28 (25), 3609-3620 (2017).</li>
<li>Schneider, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+lipids+and+GPI-anchored+proteins+in+actin-free+plasma+membrane+vesicles+measured+by+STED-FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1507-1518 (2017).</li>
<li>Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16432516">Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells.</a> Nature methods. 3 (2), 83-89 (2006).</li>
<li>Ries, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Slow+Membrane+Dynamics+with+Continuous+Wave+Scanning+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (5), 1915-1924 (2006).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Determination+of+Membrane+Dynamics+with+Line-Scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+membrane+structure+elucidation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (1), 225-233 (2009).</li>
<li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li>
<li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+research+and+technique%22%5BJournal%5D)">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy research and technique. 71 (1), 69-81 (2008).</li>
<li>Unruh, J. R., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Molecular+Concentration+and+Brightness+from+Fluorescence+Fluctuation+Data+with+an+Electron+Multiplied+CCD+Camera%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera.</a> Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).</li>
<li>Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+molecular+complexes+at+adhesions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2170-2175 (2009).</li>
<li>Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+brightness+image+analysis+reveals+ATF-induced+dimerization+kinetics+of+uPAR+in+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+journal+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane.</a> The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25 (9), 2883-2897 (2011).</li>
<li>Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+fluorescent+protein+tags+for+quantifying+protein+oligomerization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10634(2018).</li>
<li>Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+Protein+Interactions+and+Their+Stoichiometry+in+Living+Cells+by+Brightness+Analysis+of+Fluorescence+Fluctuation+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments.</a> Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).</li>
<li>Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf">https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf</a> (2010).</li>
<li>Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+quantification+of+biomolecular+interactions+by+fluorescence+cross-correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy.</a> Biophysical journal. 102 (5), 1174-1183 (2012).</li>
<li>Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieving+the+intracellular+topology+from+multi-scale+protein+mobility+mapping+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells.</a> Nature Communications. 5, 4494(2014).</li>
<li>Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11371471">The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophysical journal. 80 (6), 2987-2999 (2001).</li>
<li>Ries, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+suppression+of+sample-related+artifacts+in+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> Optics Express. 18 (11), 11073(2010).</li>
<li>Ries, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (24), 3487(2008).</li>
<li>Mayer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor-like+protein+1+%28APLP1%29+exhibits+stronger+zinc-dependent+neuronal+adhesion+than+amyloid+precursor+protein+and+APLP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (2), 266-276 (2016).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+limits+and+data+correction+in+number+of+molecules+and+brightness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis.</a> Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nandb-number+and+brightness+in+R+with+a+novel+automatic+detrending+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm.</a> Bioinformatics. 33 (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).</li>
<li>Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+binding+and+rapid+diffusion+of+proteins+in+complex+with+inositol+lipids+serves+to+coordinate+free+movement+with+spatial+information%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information.</a> The Journal of cell biology. 184 (2), 297-308 (2009).</li>
<li>Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbitrary-Region+Raster+Image+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy.</a> Biophysical journal. 111 (8), 1785-1796 (2016).</li>
<li>Hendrix, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+observation+of+cytosolic+HIV-1+assembly+onset+reveals+RNA-interacting+Gag+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers.</a> The Journal of cell biology. 210 (4), 629-646 (2015).</li>
<li>Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Interleaved+Excitation+Fluctuation+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging.</a> Biophysical Journal. 105 (4), 848-861 (2013).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5 (1), 5412(2014).</li>
<li>Chojnacki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Envelope+glycoprotein+mobility+on+HIV-1+particles+depends+on+the+virus+maturation+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state.</a> Nature Communications. 8 (1), 545(2017).</li>
<li>Godin, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+protein+oligomerization+and+densities+in+situ+using+spatial+intensity+distribution+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).</li>
<li>Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+Heterogeneity+on+the+Single+Molecular+Level+with+the+Photon-Counting+Histogram%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram.</a> Biophysical Journal. 78 (1), 474-486 (2000).</li>
<li>Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Cross-Correlation+Analysis+of+Intracellular+Reactions+with+Variable+Stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry.</a> Biophysical Journal. 88 (6), 4319-4336 (2005).</li>
<li>Jenkins, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+immune+cell+interactions+in+free-standing+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes.</a> Journal of cell science. 132 (4), (2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ההליך ניסיוני המתוארים כאן מאפשר החקירה של חלבון טרנס אינטראקציות תא-תא באנשי קשר, העסקת פלורסצנטיות תנודות ספקטרוסקופיה טכניקות, כלומר sFCCS, ccN & B. שיטות אלה כוללות ניתוח סטטיסטי של תנודות פלורסצנטיות הנפלטים על ידי שני FPs spectrally מופרדים דבוקה protein(s) עניין אצל איש קשר של שני תאים סמוכים, אחד אחד או את חלבון כימרי אחרים. הנוכחות של טרנס מתחמי לכמת על-ידי בודק את מידת שיתוף דיפוזיה של חלבונים ב- PMs שכנות. בנוסף פרוטוקולים מפורט על הכנת הדוגמא, רכישת נתונים וניתוח, מאמר זה מספק ראיות של יישום...

תהליכים ביולוגיים רבים להתרחש בכל האתרים של תא-תא אינטראקציות, למשל, תא-תא אדהזיה1,2,3, תא-cell fusion4 וזיהוי הסלולר5. אירועים כאלה חשובים במיוחד במהלך הפיתוח של אורגניזמים רב תאיים, תקשורת, למשל, במהלך תגובות מערכת החיסון. תהליכים אלה הם בדרך כלל בתיווך חלבונים אשר מותאמים על פני השטח, קרי, ב קרום פלזמה (PM) של תאים שכנים ומבצעת אינטראקציות ספציפיות-הקשר תא-תא כי הם בדיוק הזמן והמרחב מוסדר. במקרים רבים, אינטראקציות אלה ישירה הומו - או אינטראקציות חלבון heterotypic טרנס , אך עשוי גם לכלול יונים או ליגנדים מתנהג כמו linkers חוץ-תאי1. למרות חשיבות היסוד, יש מחסור של מבחני הבדיקה אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפי אלה ישירות בסביבה הטבעית של תאים חיים. שיטות רבות דורשות גם לשבירת תאים (למשל, הביוכימי מבחני כגון co-immunoprecipitation6), קיבעון (למשל, כמה טכניקות במיקרוסקופ אופטי סופר רזולוציה ו מיקרוסקופ אלקטרונים של תא-תא קשר7), או שאינם ספציפיים, כגון: צבירת / מבחני אדהזיה8,9. כדי להתגבר על בעיה זו, טכניקות קרינה פלואורסצנטית יושמו מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה העברה (סריג)10 או קרינה פלואורסצנטית קומפלמנטציה11. עם זאת, כדי להשיג מספיק קטן המרחקים בין fluorophores, שיטות אלה דורשים תוויות פלורסנט בצד חוץ-תאי של חלבונים10, פוטנציאל מתנגש עם טרנס אינטראקציות.
כאן, אנו מציגים חלופי המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית assay עבור אינטראקציות חלבון-חלבון תא-תא באנשי קשר. גישה זו משלבת גישות קרוס-המתאם קרינה פלואורסצנטית (סריקה קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה (sFCCS), מספר קרוס-המתאם ואת הבהירות (ccN &amp; B)), ערבוב של תאים המבטאים בונה פיוז'ן של החלבון של . עניין, למשל, קולטן אדהזיה. קולטני ובדוקים בתאים שמעצבת שני מסומנות עם שני חלבונים פלורסנט spectrally מופרדים (FPs), מתאיים הצד (ראה איור 1 א').
השיטות מועסקים מבוססים על ניתוח סטטיסטי של תנודות פלורסצנטיות המושרה על ידי התנועה דיפוזיה של פיוז'ן פלורסנט חלבונים דרך נפח מוקד של לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. יותר בפירוט, וזמינותו רגשים פעפוע שיתוף של החלבונים עניין במחזור שני שכנים תא-תא באנשי קשר. אם החלבונים עוברים אינטראקציות טרנס , אלה מתחמי טרנס ויישא חלבונים פלורוסנט פולטות בשני ערוצים ספקטרלי, גורם תנודות פלורסצנטיות מתואם של שנינו פולטים. מצד שני, אם הכריכה לא מתרחשת, מספר תנודות של חלבונים מול PMs תהיה עצמאית, גורם תנודות לא מתואם. הרכישה יכול להתבצע בשתי דרכים: 1) sFCCS מבוסס על סריקה בצורת קו לאורך הקשר תא-תא, רגשים ביעילות את האינטראקציות במקום הממוקמים באזור הקשר. דרך ניתוח הטמפורלי של תנודות פלורסצנטיות, sFCCS מספקת גם מידע dynamics, קרי, מקדמי דיפוזיה של מתחמי חלבון; 2) ccN &amp; B מבוססת על ניתוח pixel-wise של רצף של תמונות רכשה את האזורים קשר תא-תא. יש יכולת בדיקה של אינטראקציות מפה לאורך כל קשר עם איזור (ב מישור מוקד אחד), אך אינו מספק מידע על דינמיקה. שתי השיטות יכול להיות משולב עם ניתוח של הבהירות מולקולרית, קרי, האות הממוצע פלורסצנטיות הנפלטת ביחידת זמן אחת מתחמי חלבון באמצעי ולספק, לפיכך, הערכות של סטויכיומטריה של מתחמי חלבון- תא-תא אנשי קשר.
במאמר זה, אנו מספקים נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור הכנת הדוגמא, כיול המכשיר, רכישת נתונים וניתוח לבצע את הבדיקה הציג על לייזר קונפוקלי מסחרי מיקרוסקופ סורק. ניתן לבצע את הניסויים על כל כלי מצויד פוטון לספור או גלאי אנלוגי ולא אובייקטיבית עם מפתח נומרי גבוהה. אנו עוד יותר לדבר על שלבים קריטיים של הפרוטוקול, לספק ערכות תיקון עבור מספר תהליכי גורם תנודות אות artefactual, למשל, גלאי רעש, תנועה photobleaching או תא. פותח במקור כדי לחקור את האינטראקציות בין תאים חסיד, וזמינותו עשוי להיות שונה עבור השעיה תאים, או הותאם מודל ממברנה מערכות, למשל, unilamellar ענק שלפוחית (כשמרוגזים) או פלזמה ענקית קרום שלפוחית (GPMVs), המאפשר כימות של אינטראקציות בסביבות השומנים שונה או בהיעדר שלד התא מאורגן12,13.
סריקת קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה גירסה שונה של קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה14 , תוכננה במיוחד כדי לחקור דינמיקה דיפוזיה איטית השומנים ממברנות15. הוא מבוסס על רכישה סריקה קו בניצב רה מ המכיל את החלבונים פלואורסצנט עניין. כדי לחקור אינטראקציות של שני המינים חלבון שונה שכותרתו, הרכישה מתבצעת בשני ערוצים ספקטרלי באמצעות שני קווי לייזר, שני חלונות איתור עבור fluorophores spectrally מופרדים. בשל הדינמיקה דיפוזיה איטית של חלבונים ברה מ (D≤ ~ 1 /s2מיקרומטר), מידה קרוס-לדבר נטול יכול להתבצע על ידי לסירוגין את ערכת עירור משורת בשורה15. הניתוח מתחיל עם: 1) תיקון אלגוריתם יישור לתנועה לרוחב התא מבוסס על block-wise בממוצע של ~ 1000 שורות, 2) קביעת המיקום עם פלורסצנטיות המרביכלומר הממשלה מיקום האות, בכל בלוק, 3) הסטה של כל הבלוקים על נפוצות מקור12,15, בנפרד בכל אחד מהערוצים. לאחר מכן, מבחר אוטומטית של פיקסלים רה מ מתבצע על-ידי בחירה באזור המרכז התאמה לפי עקומת גאוס הסיכום של כל הקווים מיושר (קרי, מרכז ± 2.5σ). שילוב של האותות בכל שורה התשואות ממברנה פלורסצנטיות סדרת הזמן F(t) בכל אחד מהערוצים (g = ירוק ערוץ, r = הערוץ האדום). שים לב כי גודל פיקסל חייב להיות קטן מספיק, למשל, &lt; 200 ננומטר, לשחזר את צורת הנקודה להפיץ את הפונקציה ולמצוא את המרכז שלו, המתאים למיקום של ראש הממשלה. בנוכחות photobleaching משמעותית, סדרת הזמן פלורסצנטיות בכל אחד מהערוצים ייתכן המודל עם פונקציה מעריכית-כפול ויש לאחר מכן תוקן עם הנוסחה הבאה:16
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq2.jpg">.    (1)
חשוב לציין כי נוסחה זו מתקנת ביעילות amplitudes והן דיפוזיה פעמים המתקבל ניתוח המתאם של F(t)c, לעומת הערכות פרמטר זה ניתן להשיג את שלא תוקנו F(t). ואז, הפונקציות אוטומטי - ואת הצלב-קורלציה (ACFs / CCFs) של קרינה פלואורסצנטית החישוב של אותות:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq3v2.jpg">, (2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq4v2.jpg">, (3).
איפה אלפאFאני = Fאני(t) - <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> Fאני(t)<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg"> , ואני = g, r.
מודל דו מימדי דיפוזיה מצויד ואז המתאם לכל הפונקציות (CFs):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq7.jpg">.   (4)
כאן, N מציין את מספר חלבונים פלורסנט אמצעי תצפית, τd הזמן דיפוזיה לכל ערוץ. מודל זה לוקח בחשבון כי בהגדרה ניסיוני המתואר, דיפוזיה של חלבונים ברה מ מתרחשת בתוך המטוס x-z, בניגוד נפוץ התצורה של המתאם פלורסצנטיות ספקטרוסקופיה (FCS) ניסויים ממברנות חיטוט דיפוזיה במישור x-y של נפח קונאפוקלית17. המותניים w0 והגורם מבנה S, המתארת את התארכות wz של אמצעי האחסון נקודתית ב- z, S = wz/w0, מתקבלים מ כיול נקודת FCS מדידה המבוצעת עם spectrally דומים צבעי והגדרות באותו האופטי באמצעות הערכים הזמינים כבר מקדם דיפוזיה Dצבע:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq8.jpg">, (5).
איפה τd, צבע זה הזמן נמדד פיזור ממוצע של מולקולות צבען, המתקבל מתאים למודל תלת מימדי דיפוזיה בנתונים, לוקח לתוך חשבון מעברים של השבר T של כל המולקולות N שלישיה המדינה עם קבוע הזמן ττ:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq9.jpg">.   (6)
לבסוף, דיפוזיה (D), ערכי הבהירות מולקולרית (חדוה) והקבוע יחסית קרוס-הקורלציה של נתונים sFCCS (rel.cc.) מחושבים כדלהלן:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq10.jpg">, (7).
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq11.jpg">, (8).
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq12.jpg">, (9).
Gקרוס(0) איפה משרעת הפונקציה קרוס-קורלציה, <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq14.jpg"> הוא משרעת הפונקציה autocorrelation בערוץ אני-th.
הגדרה זו של יחסי קרוס-המתאם, קרי שימוש מרבי במקום כלומר המשוואה 9, לוקח בחשבון את המספר המרבי של קומפלקסים של חלבונים שני מינים נוכח בריכוזים שונים הוא מוגבל על ידי מינים נוכח מספר נמוך יותר.
בהירות ומספר צלב-המתאם מבוסס על ניתוח רגע של עוצמת קרינה פלואורסצנטית לכל פיקסל של אוסף תמונות רכשה במשך הזמן במיקום קבוע במדגם, המורכב בדרך כלל ~ 100-200 מסגרות, עם שני ספקטרלי ערוצי ( g = ירוק ערוץ, r = הערוץ האדום). מהממוצע טמפורלית <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/58582/58582img1.jpg"> אני<img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/58582/58582img2.jpg">, ואני השונות <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq16.jpg"> , הבהירות מולקולרית חדוהi ואת מספר nאני מחושבים ב כל פיקסל וערוץ ספקטרלי (אני = g, r)18:
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq20.jpg">, (10).
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq21.jpg">. (11)
חשוב לציין כי המשוואות נתון חלים במקרה האידיאלי של גלאי ספירת פוטון אמיתי. עבור מערכות זיהוי אנלוגי, המשוואות הבאות חלות19,20:
<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq22.jpg">, (12).
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq23.jpg">.   (13)
כאן, S הוא הגורם המרה בין פוטונים שזוהו הסעיפים דיגיטלי מוקלטות, <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> הוא רעש readout ואת היסט מתייחס ההיסט בעוצמה גלאי. באופן כללי, כמויות אלה צריכים להיות מכויל, עבור כל סוג הגלאי, המבוססת על מדידת השונות גלאי כפונקציה של עוצמת תאורה קבועה19, למשל, משטח מתכת רעיוני או פתרון דיי יבשים. היסט יכול להיקבע על ידי מדידת שיעור ספירה עבור דגימה ללא עירור אור. על ידי ביצוע רגרסיה ליניארית של השונות הקשורות גלאי <img alt="Equation 25" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq25.jpg"> לעומת העוצמה (אני) העלילה, S ו <img alt="Equation 24" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq24.jpg"> יכול להיות נחוש19:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq27.jpg">.   (14)
בסופו של דבר, הבהירות קרוס-המתאם מחושב בתוך כל פיקסל ולא מוגדר באופן כללי כמו21
<img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq28.jpg">, (15).
איפה <img alt="Equation 29" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq29.jpg"> הוא קרוס-השונות <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/58582/58582eq30.jpg"> .
על מנת לסנן תנודות חיים ארוכים, כל ccN &amp; B החישובים מבוצעים בעקבות קרון מטען סינון, באופן עצמאי עבור כל פיקסל22. בקצרה, ni, חדוהאני (אני = g, r) ו- Bcc מחושבים בהזזה מקטעים של למשל, 8-15 מסגרות. הערכים שהושג ובכך להיות בממוצע אז כדי להשיג הפיקסל האחרון מספר וערכי בהירות.
ניתוח סטויכיומטריה כדי לאמוד את סטויכיומטריה של חלבון מתחמי תא-תא באנשי קשר, הבהירות מולקולרית ניתן בנפרד לנתח בכל אחד מהערוצים ספקטרליות עבור sFCCS או ccN &amp; B נתונים. ב- sFCCS, מתקבל ערך הבהירות אחד לכל מדידה בכל ערוץ. ב ccN &amp; B, היסטוגרמה הבהירות של פיקסלים כל הקשר תא-תא מתקבל, הערך הממוצע (או החציוני) יכול לשמש נציג בהירות למדידה. על ידי ביצוע הניתוח אותו על הפניה monomeric, כל ערכי הבהירות יכול להיות מנורמל להשיג ישירות מדינת oligomeric הממוצע מתחמי חלבון שזוהו. בנקודה זו, חשוב לתקן לנוכחות של FPs שאינו-פלורסנט שעלולים לגרום underestimation המדינה oligomeric. זה מתבצע בדרך כלל על ידי מודדים את הבהירות הפניה ההומו-dimeric חלבון23,24 באמצעות sFCS צבע אחד או מספר והבהירות (N &amp; B).

<table><tbody><tr><td>מדיום גידול DMEM</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-01548</td><td></td></tr><tr><td>DPBS עם: Ca2+ ו</td><td>- Mg2 + PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS עם: Ca2+ ו</td><td>- Mg2 + PAN-Biotech</td><td>P04-35500</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין EDTA</td><td>PAN-Biotech</td><td>P10-023100</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect מגיב טרנספקציה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T תאים</td><td>DSMZ</td><td>ACC 635</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS Ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma-Alderich</td><td>83689-1G</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid DNA</td><td>Addgene</td><td>NA</td><td>ראה הפניה 12 (Dunsing et al., MBoC 2017), לתיאור מפורט של כל הפלסמידים</td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>35- כלי תחתית זכוכית מ"מ</td><td>CellVis</td><td>D35-14-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM780 קונפוקלי</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB חבילת תוכנה</td><td>MathWorks</td><td>&nbsp; 2015ב&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירת תאים נויבאואר</td><td>מרינפלד</td><td>640110</td><td></td></tr></tbody></table>

assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים כרוך תא-תא אינטראקציות, מתווך בדרך כלל על ידי חלבונים המקיימים אינטראקציה בין תאים שכנים. עניין, רק כמה מבחני מסוגלים במיוחד חיטוט כזה אינטראקציות ישירות בתאים חיים. כאן, אנו מציגים assay כדי למדוד את הכריכה של חלבונים באה לידי ביטוי על פני השטח של התאים הסמוכים, תא-תא באנשי קשר. Assay זו מורכבת משני שלבים: ערבוב של תאים המבטאים את החלבונים עניין התמזגו חלבונים שונה פלורסנט, ואחריו קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה מדידות-תא-תא אנשי קשר באמצעות לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. נדגים את הכדאיות של זה וזמינותו בהקשר רלוונטי מבחינה ביולוגית על ידי מודד את האינטראקציה של החלבון קודמן דמוי עמילואיד 1 (APLP1) על פני תאים תאים צמתי. אנו מספקים פרוטוקולים מפורט על רכישת נתונים באמצעות טכניקות מבוססות קרינה פלואורסצנטית (סריקה קרינה פלואורסצנטית קרוס-המתאם ספקטרוסקופיה, קרוס-קורלציה למספר וניתוח בהירות) את הכיול כלי הנדרש. יתר על כן, נדון שלבים קריטיים ניתוח הנתונים וכיצד לזהות ולפתור וריאציות אות חיצוני, כדין, כגון אלה עקב photobleaching או תא תנועה.
באופן כללי, וזמינותו הציג ישימה לכל הומו - או אינטראקציית חלבון heterotypic תא-תא באנשי קשר, בין תאים סוגים זהים או שונים, יכול להיות מיושם על לייזר קונפוקלי מסחרי מיקרוסקופ סורק. דרישה חשובה היא היציבות של המערכת, אשר צריך להיות מספיק לחקור דינמיקה דיפוזיה של החלבונים עניין במשך מספר דקות.

מבחן ראשון עבור אינטראקציית חלבון-חלבון וזמינותו, קרי, ערבוב של תאים המבטאים חלבונים פלורסנט ברורים spectrally, ואחריו sFCCS/ccN &amp; B מדידות (איור 1), צריכה להתבצע על חלבונים אשר אינם אמורים אינטראקציה-הקשר תא-תא (קרי, פקד שלילי). לכן, HEK 293T תאים myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-דקל-mEYFP) או - mCardinal היו מעורבים, sFCCS בוצעה על-פני הקשר תא-תא (איור 2א). במקרה האידיאלי, האות פלורס...

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

שיטה זו יכולה לעזור להבין שאלות מפתח בשדה האינטראקציה בין תא לתא, כגון אילו קולטנים מתווים הידבקות או זיהוי באנשי קשר מתא לתא והאם ליגנדים ספציפיים מפעילים את האינטראקציות שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקור אינטראקציות כאלה ישירות בתאים חיים ללא צורך בקיבוע תאים או הפרעה. למרות שיטה זו משמשת כדי לחקור אינטראקציות בין תאים מתורבתים, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות mono-קרום ורייקים או אפילו אורגניזמים מודל קטן.בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו צריכים לבדוק כי המדגם שלהם הוא יציב מספיק כדי לאפשר רכישה על פני כמה דקות על ידי בדיקה זהירה של תנועת התא וריאציות אות איטי. ראשית, לזרוע את המספר המתאים של תאים לפחות ארבע בארות של צלחת שש בארות ביום לפני transfection. תרבו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס 5%פחמן דו חמצני ב- DMEM בינוני בתוספת 10% FBS ו 1%L-גלוטמין.כדי לבצע ניסוי בסיסי לבצע פלסמידים transfect עבור החלבון של עניין התמזגו חלבון פלואורסצנטי ירוק או צהוב חלבון פלואורסצנטי אדום בארות נפרדות. לאחר ארבע שעות להסיר את מדיום הצמיחה ולשטוף כל גם בעדינות עם מיליליטר אחד של PBS בתוספת מגנזיום וסידן הטלת PBS על הקצה היטב כדי למנוע ניתוק של התאים במהלך הכביסה. לאחר מכן הסר את ה- PBS.הוסף כ 50 microliters של פתרון EDTA טיפה חכם לכל באר כדי להקל על ניתוק של התאים. לאחר הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות, לאט לנער את הצלחת שש בארות באופן מאוחר כדי לנתק את התאים. לאחר מכן, להוסיף 950 microliters של צמיחה בינוני לכל באר resuspend התאים על ידי pipetting כמה פעמים למעלה ולמטה ובכך לנתק את כל התאים מלמטה היטב.ודא שהתאים יתווספו מחדש כראוי וינותקו זה מזה על-ידי בדיקה חזותית של היעדר צבירות תאים גדולות לאחר ההתכוונות מחדש. העבר את פתרון התא של באר אחת ל הבאר המתאימה. מערבבים בעדינות על ידי צינורות כמה פעמים למעלה ולמטה.ואז לזרוע את התאים המעורבים על צלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר ותרבות התאים זרעים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני ליום אחד. בתוכנת מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר להגדיר את הנתיב האופטי. כדי להימנע מצלב ספקטרלי, בחרו שתי רצועות נפרדות כדי לרגש ולזהות mEGFP או mEYFP ו-mCherry או mCardinal ברצף ובחרו 'החלף רצועות בכל קו'.לצורך הזיהוי השתמש במסננים המתאימים עבור שני הערוצים. מניחים את המנה המכילה את התאים המעורבים על מחזיק הדגימה. לאחר המתנה של 10 דקות כדי להבטיח שיווי משקל טמפרטורה ולהפחית את סחף המיקוד, התמקד בתאים באמצעות אור השידור בתפריט איתור.חפש זוג תאים אדומים וירוקים במגע זה עם זה. לאחר מכן, בחר נתיב סריקה בניצב ליצירת קשר בין תא לתא באמצעות לחצן חתוך. הגדל כדי להשיג גודל פיקסל של 50 עד 200 ננומטר ובחר קו במצב סריקה.הגדר את גודל המסגרת ל- 128 בפיקסל אחד. הגדר את מהירות הסריקה לערך המרבי המותר. לאחר מכן הגדר מחזורים ל- 100, 000 עד 500, 000.לאחר מכן, בחר את כוחות הלייזר המתאימים. הגדר את הגלאים למצב ספירת פוטון. לחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל את הרכישה.יצא את קובצי הנתונים הגולמיים לתדמית RGB TIF בתבנית נתונים גולמית. קובץ זה יכיל קימוגרף עם נתוני הערוץ הירוק והדדום בערוץ המונשם G ו- R של התמונה, בהתאמה. לאחר מכן, יבא את קובץ ה- TIF עם תוכנת הניתוח המתאימה והמשך לבצע את הניתוח.ישר את הקווים על-ידי ביצוע ממוצע זמן מבחינת מקטע עם בלוקים של 500 עד 1000 שורות. קבע את מיקום הממברנה בכל בלוק. לאחר מכן הסט את כל הבלוקים לאותה תנוחה משנית.סכם את כל הקווים המיושרים לאורך ציר הזמן והתאים לפרופיל העוצמה הממוצע באמצעות פונקציה גאוסיאנית. הגדר את הפיקסלים המתאימים לממברנה כפיקסלים בתוך פלוס או מינוס 2.5 סיגמא של מיקום הממברנה, וסכם את עוצמת הפיקסלים האלה בכל שורה כדי לקבל ערך אות פלואורסצנטי יחיד עבור כל נקודת זמן. אם נצפתה הלבנת תמונות, החל תיקון הלבנה על-ידי התאמת סדרת זמן פלואורסצנטיות הממברנה עם פונקציה מעריכית כפולה והחלת נוסחת התיקון המתאימה.חשב את פונקציות המתאם האוטומטי וההצלבה בהתאם למשוואות המתאימות. כדי לשפר את מהימנות הניתוח ולהימנע ממצאים לבצע את החישובים עבור 10 עד 20 מקטעים שווים של המדידה הכוללת. בדוק את סדרות הזמן והמתאם של הפלואורסצנטיות בכל מקטע והסר מקטעים מעוותים בבירור.לבסוף, ממוצע כל המקטעים שאינם מעוותים. בעת ניתוח הנתונים שלך, בדוק בזהירות את עוצמת סדרות הזמן ואת פונקציות המתאם מכל מקטע כדי למנוע עיוותים, למשל, עקב ורירית תאית בפריפריה של הממברנה. תמונה עוצמתית של תאי HEK 293T המבטאים את מיריסטילציה-פלמיוליט-mEYFP או mCardinal מוצגת כאן.מתאם צולב יחסי קרוב לאפס נצפה בעוד פונקציות התיקון האוטומטי מראות זמני ריקבון אופייניים של 10 עד 20 אלפיות השניה עבור דיפוזיה של מיריסטילציה-palmitoylated-mEYFP ו mCardinal בממברנה פלזמה. הפונקציות חוצות המתאם של מדידות sFCCS של תאי HEK 293T המבטאים הטרודימר מעוגן קרום מיריסטוליטציה-palmitoylated-mCardinal-mEYFP היו משרעת חיובית והראה זמני ריקבון דומים כמו פונקציית תיקון אוטומטי. מדידות sFCCS באנשי קשר בין תא לתא בין תאי APLP1-mEYFP ו- APLP1-mCardinal-ביטוי הביאו למתאם חיובי יחסית של 0.45.פונקציות המתאם sFCCS שהתקבלו ממדידות על פני אשכולות APLP1 באנשי קשר תא-תא הראו דינמיקה מופחתת מאוד כפי שניכר פעמים ריקבון גדולות בתנודות בזמני השהיה גדולים. בתוספת יון אבץ, המתאם הנגדי היחסי עלה לערך ממוצע של 0.8. בהמשך הבהירות המולקולרית גדלה באופן משמעותי מאוליגודרים קטנים למולטימרים גדולים יותר המורכבים מ-10 עד 50 מונומרים בכל תא.אי-יציבות ארעית עלולה לגרום לפונקציה חוצת-מתאם עם ערכים שליליים או מתאם חיובי כוזב גבוה. פונקציות המתאם המתאימות בדרך כלל חורגות מאוד מאלה של רוב המקטעים. כגישה משלימה למספר מתאם צולב של sFCCS ובהירות ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון.בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי ערבוב של תאים מנוקטים הוא צעד קריטי. מערבבים בעדינות את התאים ומייעלים את יעילות ההמרה כדי להגדיל את הסיכוי למצוא תאים אדומים וירוקים במגע. לאחר התפתחותה נעשה שימוש בטכניקה זו על ידי חוקרים בתחום האימונולוגיה כדי לחקור את האינטראקציות של מולקולות איתות בסינאפסות אימונולוגיות.

a-fluorescence-fluctuation-spectroscopy-assay-protein-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

סרטון זה מדגים את השימוש בספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות כדי לזהות את האינטראקציה בין חלבוני פני התא במגעים בין תאי התא. על ידי ביטוי קולטן ההידבקות הטרנסממברנה של עניין המסומן בחלבון פלואורסצנטי וערבוב שתי אוכלוסיות תאים שונות המכילות שתי תוויות פלואורסצנטיות מופרדות ספקטרלית, האינטראקציה הטרנסית בין קולטנים של שני תאים שכנים בעלי פלואורסצנטיות בצבעים שונים מוערכת באמצעות מתאם צולב בתנודות של עוצמת הפלואורסצנטיות.

ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה של חלבונים במגעים עם תאים

סרטון זה מדגים את הטכניקה של ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות (FFS) לחקר הומו-אוליגומריזציה של חלבונים. חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי בדגימה עוברים דימריזציה באמצעות סוכן כאשר חוקרים אוליגומריזציה של חלבונים באמצעות FFS. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, כאשר החלבונים נעים פנימה והחוצה מנפח התצפית הקטן, ניתוח התנודות בבהירות המולקולות הפלואורסצנטיות מבוצע כדי לקבוע את המצב האוליגומרי של החלבונים.

ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר הומו-אוליגומריזציה של חלבונים

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת האנאיזוטרופיה הפלואורסצנטית כדי לחקור את יחסי הגומלין בין חלבון תסמונת שוואכמן-יהלום (SBDS) המתויג פלואורופור לבין גורם התארכות דמוי 1 GTPase (EFL1). על דגירה של חלבוני SBDS עם ריכוזים הולכים וגדלים של EFL1, נצפתה עלייה מתמדת באנאיזוטרופיה, מה שמצביע על אינטראקציה מוצלחת בין שני החלבונים.

זיהוי מבוסס אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית של אינטראקציות חלבון-חלבון

אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

אנו מתארים טכניקה למדידה בו-זמנית של קינטיקה של קשירת קולטן-ליגנד יחיד מווסתת כוח והדמיה בזמן אמת של איתות סידן בלימפוציט T יחיד.

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

אינטראקציות חלבון הן בלב של התפקוד של תא. טכניקות קלוריות ספקטרוסקופיות משמשות בדרך כלל כדי לאפיין אותם. כאן אנו מתארים אנאיזוטרופיה הקרינה ככלי לחקור את האינטראקציה בין החלבון מוטציה של תסמונת שווקמן-יהלום (SBDS) לבין הגורם דמוי התארכות 1 GTPase (EFL1).

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

מאמר זה מתאר זרימה מבוססת-סריג cy, מבוסס הפרוטוקול כדי לכמת הרכבה עצמית חלבון בשני S. cerevisiae ס ו HEK293T תאים.

גילוי ואפיון הרכבה עצמית של חלבון בVivo על-ידי הזרמת הקיטומטל

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) בין שתי מולקולות פלואורופור יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבונים בתא החי. כאן, פרוטוקול מסופק כיצד למדוד FRET בתאים חיים על ידי זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

למד ספקטרוסקופיית תנודות זריחה לחקירת אינטראקציות חלבון-חלבון בקשרים בין תאים בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת מחקר ישיר בתאים חיים ללא צורך בקיבוע או הרס תאי.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

גלה סרטונים נוספים