ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

הפרוטוקול שלנו מסייע למדענים לנתח רשת אקטומיוסין תת-תאית בתאי אפיתל בודדים וגם מאפשר להם לבצע ניתוח דומה בקנה מידה רב-תאי ברקמות אפיתל מעוגלים. הפרוטוקול שלנו הוא דוגמה נחמדה ליישום פיג'י. יש לו ממשק משתמש גרפי אינטואיטיבי, והוא אינו דורש כל ידע של סקריפטים.

לכן, הוא מתאים מאוד גם למשתמשים מתחילים בתחום. למרות השיטה שלנו פותחה עבור תאי ביצה Drosophila, זה ישים גם מחוץ Drosophila אפיתליה. אנו מעודדים מדענים לבחון את הפרוטוקול שלנו במערכות המודל שלהם.

השתמש בקבצי הבדיקה הנלווים כדי להכיר פרוטוקול זה. זה יעזור לך להחליט איזה חלק של פרוטוקול זה מתאים לשאלת המחקר האישית שלך. חלק זה של הפרוטוקול מאפשר למשתמשים למקטע תאי אפיתל בסרטים לשגות בזמן ולאחר מכן לנתח פולסים actomyosin בתאים בודדים לאורך זמן באמצעות מנהל פני השטח.

כדי להתחיל, לפתוח את פיג'י ולייבא את המאקרו TissueCellSegmentMovie. ijm כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, פתחו קובץ TIFF מתוקן באמצעות אקונומיקה, ופצלו את ערוצי הקובץ שתקן את האקונומיקה על-ידי צפייה שורת התפריטים, בחירה בתמונה, ואחריו צבע, ובחירה ב'ערוצים מפוצלים'.

הפעל את קובץ ה- Script שהועלה בערוץ קרום התא הפעיל של הסרט הנבחר לשגות בזמן על-ידי לחיצה על הסמל הפעל בקובץ ה- Script הפתוח. כדי לקבל מסכת תא נחמדה, הגדר את הטשטוש הגאוסיאני ל- 2.500 ואת רגישות זיהוי התא למינוס אחד, ולחץ על אישור. לאחר מכן, הגדר את עמידות הרעש המשוערת בין 10 ל- 20 עבור סרטים לשגות בזמן שנרכשו עם המטרה 63x ולחץ על אישור. מסיכת תא שנוצרה מופיעה בסרט לשגות בזמן שנותח, מופיע חלון חדש בשם ParticleStack וחלון קטן בשם פעולה נדרשת מופיע גם כן. מתוך מסיכת התא בסרט לשגות בזמן, התמקד רק בתאים במרכז ובחר את אלה שיכולים לספק קווי מתאר שלמים ומוגדרים היטב לאורך הסרט לשגות בזמן.

כאשר התאים שנבחרו במרכז מתאימים יפה למברנות התא האמיתיות, שמור את ParticleStack כקובץ TIFF. פתח את קובץ TIFF של ParticleStack המתאים בפיג'י. עם תוסף Surface Manager מותקן בפיג'י, פתח את התוסף.

במנהל פני השטח, לחץ על לחצן קרא תמונת חלוקה לרמות והגדר את אינדקס Jaccard ל- 60%טעינת קווי המתאר עשויה להימשך מספר דקות בהתאם למספר התאים. לאחר הטעינה, לכל תא יוקצה מספר S והוא יופיע בחלק השמאלי של חלון מנהל פני השטח. לחץ על מספר S שנבחר כך חלוקה לרמות תא מיובא מ ParticleStack1.

tiff מופיע בסרט לשגות בזמן. בדוק אם קיימים בכל מספר S מיובא איכות חלוקה לרמות של תאים לאורך הסרט והסר תאים לא רצויים המציגים קווי מתאר שגויים של תאים. כדי להסיר תא לא רצוי, סמן את קו המיתאר של התא ולחץ על לחצן מחק.

השתמש בכלי מברשת לתיקון קווי מתאר של תאים. לאחר שתסיים, שמור את התאים מתוקנים כ- RoiSet. קובץ zip.

כדי לזהות אם פולסים actomyosin נמצאים ברקמה מנותחת כדי להבין את ההתנהגות המפורטת, כמו גם את הכיווניות של אותות actomyosin, להתחיל על ידי פתיחת פיג'י. פתח סרט לשגות בזמן, לטעון את ParticleStack שנשמר1. מסיכת תא טיפ וסרט לשגות זמן מתוקן אקונומיקה, ולאחר מכן לטעון את תוסף מנהל פני השטח ואת האזור המתאים של עניין מן RoiSet.

קובץ zip. לאחר מכן, ב- Surface Manager, הפעל ערוץ עם אותות של עניין. לחצו על הלחצן 'סטטיסטיקה' כדי לקבל את החלון שנקרא 'ערך אפור ממוצע פרוסה לפי פרוסה'.

התעצמות הממוצעת והחציון של אותות האקטומיוסין תוצג לאורך זמן ביחידות שרירותיות, כמו גם בפרמטרים אחרים הקשורים לאזור ולצורת התא. שמור את הערכים כקובץ גיליון אלקטרוני על ידי הולך לחלון סטטיסטיקה, לחיצה על קובץ, ובחירה שמירה As.Similarly, ליצור מסיכת תא, טען אותו לתוך Surface Manager על מנת לנתח פולסים actomyosin בסולם הרקמות. חלק זה של הפרוטוקול מאפשר למשתמשים לחלץ באופן סלקטיבי שכבה דקה של אקטומיוסין ברקמת האפיתל המעוקלת לאורך זמן.

שלבים אלה ידידותיים למשתמש ומבוססים על ממשק גרפי אינטואיטיבי. פתח את פיג'י וודא שהתוסף להקרנת משטח אליפסואיד מותקן. לאחר מכן, פתח סרט לשגות בזמן וייצא אותו כקובץ XML/HDF5 על-ידי לחיצה על תוספים, לחיצה על BigDataViewer ובחירה באפשרות יצא תמונה נוכחית כקובץ XML/HDF5.

לאחר מכן, פתח את הקובץ המיוצא בהקרנת משטח אליפסואיד על ידי הולך תוספים, לחיצה על BigDataViewer, ואחריו הקרנה משטח אליפסואיד, ובחירת קובץ XML. זה יפתח חלון חדש עם נוף קשתי של תא הביצים, ודיאלוג שינחה את המשתמש בעיבוד יופיע. חלון הדו-שיח, הנקרא הקרנה של השחלות, כולל מספר כרטיסיות.

בכרטיסית הדו-שיח הראשונה, הנקראת תיבה תוחמת, הגדר את גבולות ה- x וה- y של תא ביצה בסרט לשגות בזמן יחד עם רוחב z של התיבה התוחמת ולחץ על set. החלקים הנבחרים של תא הביצים מודגשים בוורוד. לאחר מכן, הגדר את הגודל של כתמי אות בכרטיסית הדו-שיח הנקראת חיפוש כתמים בחלון הקרנה של השחלות.

הגדר את הסיגמא ואת ערך השיא המינימלי. לאחר מכן, לחץ על מ לחשב כדי לזהות את אותות actomyosin, אשר יופיעו כתמים ירוקים. נסה שוב לבצע שלב זה עם פרמטרים שונים עד שיימצאו כ- 100 נקודות.

זיהוי אותות האקטומיוסין הוא צעד מכריע. זה תלוי באיכות האות ובגודל הנכון של הכתמים שזוהו. אם אין כתמים ירוקים גלויים בתמונה, השלב הבא לא יעבוד.

כדי לעצב את האליפסואיד, המשך עם הכרטיסייה הנקראת התאם אליפסואיד. הגדר דגימות אקראיות ל- 10, 000, את מרחק החיתוך החיצוני/פנימי למרחק ניתוק אחד עד 10 ולאחר מכן לחץ על מ לחשב. לאחר מכן, הכרטיסיה הנקראת הקרנה תיפתח באופן אוטומטי ותתיר את ההגדרה של מיצוי פני השטח.

בכרטיסיה הקרנה, הגדר מרחק הקרנה מינימלי ומקסימום ברוחב האליפסואיד הרצוי. מרחק ההקרנה המינימלי והמקסימלי חייב להתאים כך שהאזור האליפסואידי המוגדר בוורוד כולל את כל השכבה החיצונית של תא הביצים. לאחר מכן, הגדר את מרחק הפרוסה כאחד.

ודא כי האזור הוורוד של אליפסואיד עם מוגדר עם על תא הביצה גלוי לפני לחיצה על מ לחשב. זה עוזר להעריך את האיכות של התאמה אליפסואידית חדשה. לאחר מכן, הגדר רוחב פלט של האליפסואיד כגדול או שווה ל- 800 וגובה הגדול או שווה ל- 400.

לאחר מכן, קבעו את משך החילוץ של פני השטח ובחרו הקרנה כדורית או גלילית. במידת הצורך, הפוך Z ויישר מדף Y.Press כדי להשיג חילוץ משטח עבור שני הערוצים בחלונות חדשים הנקראים תמונה. כוונן את הבהירות והניגודיות של חלונות התמונה שהושגו כדי שתוכל לראות את אותות האקטומיוסין המוקרנים על-ידי לחיצה על תמונה, ג'יינג' כוונון ובחירת בהירות/ניגודיות.

אם חילוץ פני השטח נראה טוב, שמור את שני הערוצים בנפרד כקבצי TIFF. בנוסף, שמור את קובץ חלון יומן הרישום לעיון בעתיד לגבי האופן שבו המשטח של תא הביצים המסוים הזה חולץ. לאחר מכן, מזג את הערוצים עם קוד צבע מועדף בפיג'י ושמור את התוצאות כקבצי TIFF.

פרוטוקול זה מאפשר למדענים לחקור את ההתנהגות של רשתות actomyosin ברקמות אפיתל. זה אפשרי רק כאשר ניתוח מפורט של התנהגות actomyosin בקנה המידה התאי המקומי משולב עם ניתוח דומה בסולם הרקמות. מוצגות להלן דוגמאות מייצגות להתנהגות דינמית של מיוסין II בסולם התאים המקומי ובקנה המידה של הרקמות לשליטה ותאי ביצים דרוסופילה מוטציה fat2.

במישור היחיד הבסיסי, שרשרת האור הרגולטורית הירוקה של אותות מיוסין II נעים בניצב לציר האחורי-אחורי של תאי הביצה הבקרה. קוטביות זו אובדת בתאי הביצים המוטנטיים fat2 ומובילה לפולסים אניסוטרופיים מיוסין II, תנודות ברמת הרקמה, שרשרת האור הרגולטורית הירוקה של myosin II בדגימה הבקרה מייצרת את הכוח המסונכרן הנדרש כדי לקדם סיבוב אפיתל. לעומת זאת, אפיתל הזקיק של דופק תא ביצה מוטציה fat2 בחוזקה בצד הבסיסי ולא מצליח ליצור את הכוח המסונכרן הנדרש כדי לקדם סיבוב אפיתל.

באזור אפיקל דק של תא הביצים Drosophila, מוטציה fat2 גם מציג עם התנהגות דינמית שונה של שרשרת אור רגולטורי שונה ירוק של myosin II.After צפייה בסרטון זה, אתה צריך מושג טוב כיצד לנתח רשת actomyosin בקנה מידה מקומי ורקמות בתאי ביצה Drosophila באמצעות פיג'י. לקבלת עצות מעשיות נוספות ופתרון בעיות, עיין בחלק הדיון לאחר הפרוטוקול. אם יש לך שאלות הקשורות לפיג'י או לתוספים שלנו, עיין בדפי האינטרנט המתאימים או פנה אלינו.