Name: 4D מיקרוסקופ של שמרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: למד מיקרוסקופיה קונפוקלית רב-צבעית תלת-ממדית לאורך זמן לניתוח תאי שמרים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת אברונים תוך-תאית ומספקת הבנה מעמיקה של תהליכים תאיים ביולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק R01 GM104010. תודה על הסיוע עם מיקרוסקופ הזריחה כדי Vytas Bindokas וכריסטין Labno במתקן ליבה מיקרוסקופ משולב, אשר נתמך על ידי מרכז הסרטן NIH ממומן תמיכה גרנט P30 CA014599.

1. הכנה
<ol><li>הפוך מינימלי לא פלורסנט NSD בינונית2. היעדר הריבופלאווין צפוי להפחית את הרקע הירוק מתאים לקרינה פלואורסצנטית ירוקה ו-phototoxicity משויכת.</li>
	<li>לגדל את מאמץ שמרים לילה ב ~ 23 ° צ' לשלב לוגריתמי ב 5 mL NSD ב 50 mL מבולבל בקבוקון עם האנטנה טוב. כ 3-4 h לפני הניתוח, לדלל את התרבות שמרים ב NSD טריים כך הסופי OD600 יהיה 0.5-0.8 בזמן הדמיה.</li>
	<li>להכין פתרון 2 מ"ג/mL של concanavalin A (קונה). אם תרצה, הקפא את התמיסה הזאת בחנקן נוזלי ובחנות ב-80 ° c.</li>
	<li>לסובב את הפתרון הקונה עבור 5 דקות במהירות מלאה במיקרוצנטריפוגה כדי להסיר חומר חלקיקי שעלול להפריע הדמיה. לאחר מכן להוסיף 250 μL של supernatant כדי נקי 35 מ"מ שמיכות התחתון צלחת המיקרוסקופיה. לאחר 15 דקות, לשטוף 2-3 פעמים עם 2 מ ל של dH2O ולתת יבש.</li>
	<li>הוסף 250 μL של התרבות שמרים לצלחת מצופה קונה, לחכות 10 דקות כדי לאפשר את התאים לדבוק, ולשטוף בעדינות 2-3 פעמים עם 2 mL NSD. כסה את התאים עם 2 מ"ל NSD טרי.</li>
</ol>2. הדמיה
<ol><li>השתמש עדשה 63 x או 100x טבילה שמן. פתח מספרי (NA) של 1.40 הוא מספיק, אבל עדשת NA גבוהה יכול לשמש גם.</li>
	<li>עצב את גודל המסגרת ל-256 x 128 (רוחב x גובה). אם יש צורך בגודל מסגרת גדול יותר, הגדלת הרוחב לא תפחית את מהירות הסריקה כל עוד המיקרוסקופ הקונקטיבי מצויד בסורק תהודה.</li>
	<li>כוונן את מקדם הזום כדי להפוך את גודל הפיקסל ~ 80 ננומטר.</li>
	<li>השתמש במהירות הסריקה המרבית, שהיא בדרך כלל בסדר של 8 kHz. הפעל סריקת X דו-כיוונית אם הוא זמין, ואם בקרת ניסויים לוודא כי סריקות משני הכיוונים הם בהרשמה.</li>
	<li>הגדר את הצטברות הקו ל-4 או 6. הקפד להשתמש בהצטברות (סיכום) במקום בממוצע.</li>
	<li>הגדר את החור מנקב 1.2 יחידות אווריריים. אמפירי, כאשר הדמיה לחיות תאים שמרים, הגדרה זו לוכדת פוטונים יותר מאשר הבחירה הסטנדרטית של 1.0 יחידת אוורירי תוך גרימת אובדן ניכר של רזולוציה.</li>
	<li>עבור כל ערוץ זריחה, להגדיר את אורך הגל, להקצות גלאי רגישות גבוהה, להגדיר את טווח אורך הגל הפליטה, ולהפעיל מצב ספירת פוטון אם זמין. בחירות אורך הגל יהיה תלוי fluorophores. כדוגמה, לרגש את הזריחה GFP ב 485 nm ולאסוף מ 495-550 nm, ולהלהיב mScarlet פלואורסצנטית ב 555 nm ולאסוף מ-562-625 nm.</li>
	<li>הגדר את עוצמת כל לייזר כדי להיות נמוך ככל האפשר. הגדרה זו חייבת להיקבע בהתאם. האינטנסיביות המתאימה תגרום ללכידת רצף התמונה רועש אך מתרגם, עם האות הפלואורסצנטית הלבנת לא יותר מ 50% עד סוף הסרט 5 דקות. במיקרוסקופ הקונמוקד המשמש כאן (ראה טבלת חומרים), עוצמה זו מקבילה להגדרת כוח לייזר על סדר של 5%.</li>
	<li>השתמש במסננים מדרגה או בזמן המשך כדי להימנע מלכידת האור המשתקף מהכיסויים. אם המשך הזמן זמין, להגדיר את החלון החוצה כדי 0.6-10.0 ns.</li>
	<li>הפעל דימות ברייטפילד והשתמש בגלאי רגישות נמוך לאיסוף נתונים. הגדר את הרווח לרמה שהופכת את התאים לגלויים בבהירות. אל תשתמש בניגוד הפרעות דיפרנציאלי (DIC) מכיוון שהפריזמה תפריע ללכידת נתוני הזריחה האמינים.</li>
	<li>הגדר את מרווח ה-Z ל-0.25-0.35 μm. תמונה של כל הנפח של התאים שמרים על ידי איסוף על 20-25 מקטעים אופטיים לכל Z-מחסנית. ציין את הכיווניות של הדמיה כגון "למטה" נע לעבר הכיסויים.</li>
	<li>עבור סרט אופייני, הגדר את מרווח הזמן בין Z-ערימות ל-2 s והגדר את משך הסרט ל-5 עד 10 דקות. בהתאם לתא שמתחת למחקר, הפחת את מרווח החיים כדי לבצע סרטים קצרים יותר של דינמיקה מהירה יחסית, או הגדל את המרווח כדי להפוך סרטים ארוכים יותר של דינמיקה איטית יחסית.</li>
	<li>שמור את הסרט כקובץ, עם תמונות השדה הברייטמיות בערוץ האחרון. במעמקי הסיביות הגבוהה יותר אינם נחוצים בשלב זה, והצינור העיבוד מוגדר לקבל נתוני TIFF של 8 סיביות.</li>
</ol>3. פירוק המבנים
<ol><li>הפעל את תוכנת הפירוק (ראה טבלת חומרים), באמצעות האלגוריתם ' שערוך סבירות מקסימלית קלאסי '.</li>
	<li>פתח את ערכת הנתונים שנוצרה בשלב 2.13. בחר באפשרות "אשף פירוק הטור". בדוק את הערכים המוצגים באשף הפרמטרים. יש לזהות את פרמטרי ההדמיה ולהציגם כראוי. תחת "מדדי השבירה", לשנות את הערך "הטבעה רפואית." כדי 1.40 לקירוב הציטופלסמה שמרים. תחת "coverslip", בחר "הפעל עורך" ו "מיקום הערכה" ו "אישור" כדי להגדיר את מיקום coverslip. בחר "קבע את כל האימות" ו-"קבל".</li>
	<li>המשך באמצעות "אשף פירוק" עבור כל ערוץ זריחה. בחר "ידני" כמצב עבור שערוך רקע. בדוק את פרופיל עוצמת הקרינה הגולמית של הנתונים כדי לקבוע ערך רקע מוערך, שהוא בדרך כלל כ-0.1.</li>
	<li>בתפריט ההגדרה של פירוק, הזן ערך ' מספר איטראציות מרבי ' של 40 וכבה את תיקון האקונומיקה. הזן ערך SNR מוערך, שהוא בדרך כלל כ-5.0. לחץ על "דבולבה".</li>
	<li>במקרה הצורך, חיזרו לקובץ הנתונים המקורי, התאימו את ערכי הרקע והSNR, וחזרו על הפרק, עד שהרעש יוסר במידה מספקת מבלי לסלק קרינה מקורית ממבנים עמומים.</li>
	<li>למזג את השדה ברייטזה ולפרק ערוצי זריחה. עבור שלבי עריכת הסרטים הבאים ב-ImageJ, סדר את הערוצים כך שאדום הוא הראשון, ירוק (אם קיים) הוא הבא בתור, כחול (אם קיים) הוא הבא בתור, וברייטפילד הוא האחרון. שמור את רצף התמונות כקובץ TIFF של 8 סיביות.</li>
</ol>4. תיקון אקונומיקה ודור הסרט
<ol><li>יבא את רצף התמונות החוצה לתוך ImageJ והמירו אותה להיפר-מחסנית על-ידי בחירה באפשרות תמונה > היפרערימות > מחסנית ל-Hyperstack. בחר באפשרות "xyzct" מהתפריט הנפתח ומלא את מספר הערוצים, פרוסות מחסנית Z ומסגרות הזמן (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).</li>
	<li>בחרו ' תמונה > צבע ' > ערוצים מפוצלים.</li>
	<li>תקן את ערוצי הזריחה עבור הלבנה באמצעות התוסף ImageJ הזמין מ http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. לאחר התוסף הזה הורד והתקין, בחר תוספים > EMBLtools > תיקון אקונומיקה. בחר באפשרות "התאמה מעריכית".</li>
	<li>כדי למזג את ערוצי הקרינה הפלואורסצנטית ותיקון האקונומיקה לתוך hyperstack, בחרו ' תמונה > צבע ' > מיזוג ערוצים. שמור את ההיפר-מחסנית המתקבלת כקובץ TIFF של 8 סיביות.</li>
	<li>
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58618/ImageJ.zip" target="_blank">התקן את התוספים המותאמים אישית של ImageJ המסופקים עם פרוטוקול זה.</a> בצע את ההוראות המופיעות במסמך הנלווה כדי להציג, לערוך ולכמת את רצף התמונות, ולהפיק את הסרט הסופי של ה-Z-ערימות המוקרנת.</li>
</ol>

<ol><li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li>
<li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li>
<li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li>
<li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+Golgi+apparatus%3A+insights+and+mysteries%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li>
<li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li>
<li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232(2015).</li>
<li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting%2C+disruption%2C+replacement%2C+and+allele+rescue%3A+integrative+DNA+transformation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li>
<li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li>
<li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003(2017).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li>
<li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787(2017).</li>
<li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, Pt 1 250-257 (2014).</li>
<li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin%2C+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li>
<li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li>
<li>Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy.+3rd+edn%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li>
<li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , Epub ahead of print (2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

4d הדמיה קונפוקלית וקד של אורגלים שמרים דורש כוונון זהיר של פרמטרים מרובים. הדאגה העיקרית היא פוטוהלהלבנת ו פוטורעילות. סרט 4D אופייני כרוך באיסוף אלפי מקטעים אופטיים, כך שתאורת הלייזר חייבת להישמר כנמוכה ככל האפשר. התגים של חלבון פלואורסצנטי טנדם ניתן להשתמש כדי להגביר את האות מבלי להגדיל את הביטוי של חלבון מתויג16,17. למקסם את מהירות הסריקה מסייע להגביל את הנזק photodamage וגם מאפשר Z-ערימות להילכד במרווחי זמן קצרים כראוי. גדלים voxel הנמצאים במגבלת נייקוויסט ב...

התאים של המערכת הendomembrane הם בשטף קבוע, ואת האפיון המלא שלהם דורש הדמיה תא חי. מתוארים כאן הוא פרוטוקול המעסיק 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופיה כדי להמחיש באופן מתויג בתאי בתים של הניצנים. השיטה פותחה כדי לעקוב אחר הדינמיקה של מתאי הפרשה בפיצ'יה פסטורלה וסכומיסס סרביסיאה1,2,3. פרוטוקול זה מתמקד ב -S. cerevisiae, אשר יש golgi שאינו מוערם שבו cisternae הפרט הם לפתירה4. הארגון החריג Golgi ב -S. cerevisiae ס איפשר את ההפגנה על ידי מיקרוסקופ 4d כי golgi cisterna בתחילה תוויות עם תושב מוקדם בשנת golgi, ולאחר מכן מאבד את החלבונים האלה תוך רכישת תושב מאוחר golgi חלבונים3 ,5. מעבר זה יכול להיות דמיינו על ידי יצירת זן שבו חלבון Golgi מוקדם Vrg4 מתויג עם GFP בעוד חלבון Golgi מאוחר Sec7 מתויג עם חלבון פלורסנט monomeric אדום. כאשר cisternae בודדים מסומנים, התבגרות נצפתה כהמרה ירוק-אדום3. סוג זה של ניתוח יכול לספק מידע חשוב אודות לוקליזציה של חלבון וזהות תא. לדוגמה, שני חלבונים עם זמני הגעה ויציאה מעט נגדיים עשויים לעתים להיראות כתוויות לתאים שונים בתמונות סטטיות, אך ניתן לראות בסרטים 4d כדי לתייג את אותו תא בנקודות זמן שונות6,7 . לפיכך, מיקרוסקופ 4D חושף תופעות שלא היו נראות באופן אחר.
מיקרוסקופ 4D אינפורמטיבי של תאי שמרים ניתן להשיג עם הליכים המתאימים וציוד2. במידת האפשר, התיוג חלבון פלורסנט מבוצע על ידי החלפת גנים8 כדי למנוע חפצים ביטוי יתר. כי מבנים תאיים הם לעתים קרובות דינמי מאוד, 4D הדמיה נדרשת כדי להבטיח כי מבנה מסומנים מהימן לאורך זמן. הפרוטוקול המתואר כאן מעסיק מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לייזר המצויד בגלאי רגישות גבוהה. עם התקן זה, את כל הנפח של התא של S. cerevisiae ס יכול להיות בתמונה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית בערך כל 1-3 s, עם 2 מרווחי s להיות אופייני. נתונים ניתן לאסוף עד 5-15 דקות בהתאם לצפיפות התיוג של fluorophores ואת המאפיינים שלהם פוטופיסיים. המשוכה העיקרית היא למזער את הלבנת התמונות. למטרה זו, עוצמות הלייזר נשמרות נמוכות ככל האפשר, מהירות הסריקה הקונפוקלית מוגדלת, והפרמטרים האופטיים מוגדרים לתמונה במגבלת נייקוויסט כדי ללכוד את המידע הרלוונטי תוך הימנעות מחשיפה מוגזמת באור. הגדרות אלה צפויים גם להקל על הרעילות, גורם התעלמו לעתים קרובות במהלך הדמיה תא חי9,10,11. הנתונים הרועשים הנובעים מכך מעובדים עם תיקון אקונומיקה והאלגוריתמים לפירוק כדי להקל על הכמת של עוצמות הזריחה.
גם עם איכות גבוהה בסרטים 4D, הניתוח הוא מסובך כי בתאי שמרים נוטים להיות רבים, הטרוגנית, וניידים. בשל המגבלות הפנימיות של המיקרוסקופיה וההגדרות הלא-אופטימליות הנדרשות עבור הדמיה ממושכת של 4D, מבני פלורסנט הסמוכים זה לזה קשה לפתרון. בעיה זו ניתן להקיף על-ידי התמקדות במספר קטן של מבני פלורסנט כי נשארים מחדש באופן מבחינה אופטית למשך תקופת תיוג, עם ההנחה כי מבנים אלה מייצגים את האוכלוסיה כולה של התווית תאים. תאים פלורסנט שיכולים להיות מסומנים באופן מהימן מזוהים על ידי צפייה בסרטים של ה-Z-ערימות מוקרן ועל ידי יצירת סדרה של ונטאז שבו הסעיפים האופטיים עבור כל נקודת זמן מסודר על מסך המחשב. ניתוח זה משתמש בתוספים מותאמים אישית של ImageJ12 , המאפשרים מבנה פרטני להיות מאותר בבידוד.
ניירות השיטות האחרונות כיסו את השימוש של חלבונים פלורסנט ב-13 שמרים, כמו גם את התיאוריה והתרגול של הדמיה מיקוד 4d של תאים שמרים2. פרוטוקול זה מתמקד בהיבטים המעשיים המרכזיים של ניסוי הדמיה 4-d. הוא כולל כמה שיפורים להליכים שתוארו בעבר, כמו גם גירסאות מעודכנות של הקוד והתיעוד של התוסף ImageJ. הדוגמה המוצגת מתמקדת בדינמיקה של Golgi, אך פרוטוקול זה מתאים באותה מידה ליצירת הדמיה של תאי שמרים אחרים.

<table><tbody><tr><td>צלחות תחתית זכוכית 35 מ"מ מס' 1.5</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>צלחות הדמיה</td></tr><tr><td>Concanavalin A אבקה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2010</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Vector Laboratories</td><td>CB-1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X&nbsp;</td><td>תוכנת מיקרוסקופ</td> <td>Leica Microsystems</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Huygens Essential, גרסה 17.04</td><td>תוכנת Deconvolution</td><td>הדמיה</td><td></td> בנפח מדעי</tr><tr>תוכנת עיבוד <td>וניתוח תמונה</td> <td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td></tr></tbody></table>

4d מיקרוסקופ של שמרים

4D Microscopy of Yeast

המטרה של פרוטוקול זה היא לאפיין את כיצד תאים ממברנות טופס ולשנות בתאים חיים של שמרים לגבש. תאים תאיים רבים שמרים הם דינמיים, והבנה מלאה של המאפיינים שלהם דורש הדמיה בזמן. Multi-צבעים 4D מיקרוסקופ מיקרוסקופית פלואורסצנטית היא שיטה רבת עוצמה למעקב אחר ההתנהגות והרכב של תא תאיים על סולם זמן של 5-15 דקות. ניתוח קפדני של דינמיקה תא דורש לכידת אלפי אופטי סעיפים. כדי להשיג מטרה זו, photobleaching לבנת ו פוטורעילות הם ממוזער על ידי סריקת במהירות בכוח לייזר נמוך מאוד, ואת מידות פיקסל ומרווחי Z-step מוגדרים לערכים הגדולים ביותר התואמים לדגימת התמונה ברזולוציה מלאה. ערכות הנתונים המתקבלות מוסדרות, רועשות, אך ניתן לחלק אותן על-ידי פירוק. גם עם נתונים באיכות גבוהה, שלב הניתוח הוא מאתגר כי מבנים תאיים הם לעתים קרובות רבים, הטרוגנית, וניידים. כדי לענות על צורך זה, התוספים ImageJ מותאם אישית נכתבו לתוך מערך 4D נתונים על מסך המחשב, לזהות מבנים של עניין, לערוך את הנתונים כדי לבודד מבנים בודדים, לכמת את קורסי הזמן הזריחה, ולעשות סרטים של ה-Z מוקרן הערימות. 4D סרטים שימושיים במיוחד כדי להבחין תאים יציבים מתאים ארעי כי להפוך על ידי התבגרות. סרטים כאלה יכולים לשמש גם כדי לאפיין אירועים כגון היתוך תא, כדי לבדוק את ההשפעות של מוטציות ספציפיות או רטבאליות אחרים.

הדוגמה שניתנה כאן מסמכים וככמת את ההבשלה של שתי Golgi cisternae שמרים כפי שדמיינו על ידי המיקרוסקופיה 4D מיקרוסקופית הצבע הכפולה3. תא שמרים מכיל על הסדר של 10-15 Golgi cisternae, שכל אחד מהם מתבגר במשך זמן של כ 2-4 דקות. התבגרות יכול להיות מדמיין על ידי תיוג מוקדם מסמן Golgi Vrg4 עם GFP ועל ידי תיוג המנוח Golgi סמן Sec7 עם פלורסנט אדום חלבון כגון מאנצ או מסקרלט. תוויות cisterna בודדות בתחילה עם סמן Vrg4, ולאחר מכן עובר מעבר קצר שבו הסמנים מוחלפים, ולאחר מכן מתייג ע...

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של מסומן בתוך התאים התאיים בתוך שמרים באמצעות מרובת צבעים 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופ. הפרמטרים הדמיה נבחרים כדי ללכוד אותות הולמים תוך הגבלת photodamage. תוספים מותאמים אישית של ImageJ מאפשרים מבנים עם תוויות למעקב וניתוח כימות.

4D מיקרוסקופ של שמרים

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

שיטה זו עוקבת אחר מבנים בתאי שמרים בשלושה ממדים לאורך דקות רבות, ומאפשרת לנו לחקור את הדינמיקה של אורגנים ותאים תאיים. הדמיה 4D מבטיחה כי אנו יכולים להסיק מסקנות אמינות על דינמיקה תאית, במיוחד עבור מבנים או סמנים שעשויים להיות ארעיים. הפגנת ההליך תהיה נטלי ג'ונסון, פוסט-דוק מהמעבדה שלי.התחל על ידי גידול תרבות לילה של זן שמרים של עניין חמישה מיליליטר של סינתטי שאינו פלואורסצנטי מוגדר, או NSD, בינוני, בבקבוק מבולבל 15 מיליליטר עם aeration טוב, ב 23 מעלות צלזיוס. שלוש עד ארבע שעות לפני הניתוח, לדלל את תרבות שמרים שלב לוגריתמי במדיום NSD טרי, כך הצפיפות האופטית הסופית ב 600 ננומטר, או OD600, יהיה 0.5 כדי 0.8 בזמן ההדמיה. לפחות שעה אחת לפני שהתרבות מוכנה, צנטריפוגה aliquot של שני מיליגרם למיליליטר קונקבאלין פתרון במשך חמש דקות במלוא המהירות, כדי גלולה כל חלקיקים, ולהוסיף 250 microliters של supernatant לתוך צלחת מיקרוסקופיה תחתית זכוכית 35 מילימטר נקי.לאחר 15 דקות, לשטוף את המנה פעמיים עד שלוש פעמים עם שני מיליליטר של מים מזוקקים לכל לשטוף, הוספת 250 microliters של תרבות השמרים לצלחת מצופה Concanavalin A לאחר שהוא מיובש. המתן 10 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק, לפני שטיפת המנה בעדינות פעמיים עד שלוש פעמים נוספות עם שני מיליליטר של מדיום NSD טרי. ואז לכסות את התאים עם שני מיליליטר של NSD טרי.כדי לדמיין את תאי השמרים, בחר עדשת טבילת שמן 63X עם צמצם מספרי של לפחות 1.4 במיקרוסקופ אור קונפוקלי. כאן, עדשה אובייקטיבית 100X ניתן להשתמש גם במקום עדשה אובייקטיבית 63X. לאחר מכן, מניחים את המנה על העדשה האובייקטיבית, הבחין בשמן טבילה.מהתפריט הנפתח של הכרטיסיה מצב רכישה, בחר xyzt. תחת הכרטיסיה XY, עצב את גודל המסגרת לרוחב 256 בגובה 128. השתמש במהירות הסריקה המרבית, שהיא בדרך כלל בסדר גודל של שמונה קילוהרץ.הפעל סריקת X דו-כיוונית אם היא זמינה, והתאם את גורם הזום לתשע, מה שיהפוך לגודל פיקסל של כ- 80 ננומטר. אם נעשה שימוש במטרה 100X, התאימו את גורם הזום בהתאם לשמירה על גודל פיקסל של כ-80 ננומטר. לאחר מכן הגדר את הצטברות הקו לארבעה או שישה.הגדר את חור הסיכה ל- 1.2 יחידות אוורימיות והדליק את לייזר האור הלבן, אם הוא זמין. לאחר מכן הגדר את אורך גל העירור ואת כוח הלייזר אחוז עבור כל ערוץ פלואורסצנטי. אם אפשרות זו זמינה, אפשר את השימוש במצב ספירת פוטון תחת לשונית התצורה על-ידי ביטול הבחירה בזמן שילוב מרבי.עבור כל ערוץ פלואורסצנטי, הקצה גלאי רגישות גבוהה, הגדר את טווח אורך הגל של הפליטה והפעיל מצב ספירת פוטון, אם הוא זמין. הגדר את חלון gating הזמן ל 0.6 עד 10 ננו שניות עבור כל ערוץ פלואורסצנטי, כדי למנוע לכידת אור משתקף מצלחת הזכוכית. לאחר מכן, הפעל הדמיית שדה בהיר ובחר גלאי רגישות נמוכה עבור איסוף הנתונים.הפעל מצב דימות חי והגדל את הרווח בערוץ השדה הבהיר עד שהתאים יהיו גלויים בבירור. אם במצב ספירת פוטון, שנה את טווח הערכים האפורים מכדור ידני לאוטומטי כדי להציג את אות הפלואורסצנטי. הגדר את מחסנית Z כדי לדמיין את כל נפח תאי השמרים ולציין את הכיווניות של ההדמיה כך למטה נע לכיוון החלקת המכסה.הגדר את מרווח הזמן של שלב Z ל- 0.25 עד 0.35 מיקרומטר כדי להשיג כ- 20 עד 25 מקטעים אופטיים לכל מחסנית Z והפעיל את זרימת Galvo אם היא זמינה. עבור סרט טיפוסי, הגדר את מרווח הזמן בין ערימות Z לשתי שניות והגדר את משך הסרט לחמש עד עשר דקות. לאחר מכן שמור את הסרט כקובץ LIF.עבור פירוק סרטים, הפעל תוכנה מתאימה לפירוק המשתמשת באלגוריתם הערכת הסבירות המרבית הקלאסי, ופתח את סידרת הנתונים. בחר אשף פירוק ועורך פרמטרים כדי לאשר כי פרמטרי הדימות מזוהים ומוצגים כראוי. שנה את ערך מדד השחזור הבינוני המוטבע ל- 1.4 כדי להעריך את ציטופלסמת השמרים.לאחר מכן השתמש בעורך כדי להעריך את מיקום עמוד השער. בחר הגדר את כל המאומתים ולחץ על קבל ובחר הזן אשף. לחץ על החץ הבא כדי לעקוף את בחירת פונקציית כפולת הנקודות ואת שלבי החיתוך שלפני העיבוד, והמשך דרך אשף האצלה עבור כל ערוץ פלואורסצנטיות.בחר את פונקציית המיפוי האנכי הלוגאריתמית של המיפוי ובדוק את פרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות של הנתונים הגולמיים. הגדר ידנית כ למצב להערכת הרקע, הזן ערך רקע ולחץ על קבל. השאר את ערך האיטראציות המרבי על 40 והזן אות משוער ליחס רעש.לאחר מכן כבו את תיקון האקונומיקה ולחצו על 'Deconvolve'. בחר קבל לערוץ הבא בחלון תוצאת deconvolution, אם הרעש מוסר מספיק מבלי לבטל את הפלואורסצנטיות המקורית מהמבנים העמום. לאחר שכל הערוצים הפלואורסצנטיים נותקו באופן משביע רצון, לחץ על הכל וסדר תחילה את הערוץ האדום, ואחריו ערוצי השדה הירוק, הכחול והבהיר, לעריכה הבאה ב- ImageJ.לאחר מכן שמרו את רצף התמונה כקובץ TIF של שמונה סיביות ובחרו קובץ אחד לערוץ והניגודיות נמתחת במצב המרה. לתיקון אקונומיקה, יבאו את רצפי התמונה המפותלים ל-ImageJ ולחצו על 'תמונה', 'היפרסטאק' ו'מחסנית' ל'היפרסטאק' כדי להמיר את התמונות להגזמה. בחרו xyzct מהתפריט הנפתח והזינו את מספר הערוצים, פרוסות ערימת Z ומסגרת הזמן.לתיקון ערוצי הפלואורסצנטיות להלבנת תמונות, בחרו 'תמונה', 'צבע', 'ערוצי פיצול' ובערוצי פלואורסצנט, בחרו 'תוספים', 'EMBLtools', 'תיקון אקונומיקה' ו'התאמה מעריכית'. לאחר מכן בחרו 'תמונה', 'צבע' ו'ערוצי מיזוג' כדי למזג את השדה הבהיר ואת ערוצי הפלואורסצנטיות מתוקנים להיפר-סטאק, ולשמור את ההיפר-סטאק המפותל והמכוולב עבור יצירת הסרטים והעריכה הבאים כקובץ TIF של שמונה סיביות. כדי להמיר את ערכת הנתונים המפותלת והמתוקנת למונטאז' מוקף, בחר תוספים, IJ_Plugins והפוך את סדרת מונטאז', ובחר את ההיפר-סטאק הרלוונטי של שמונה סיביות.לחץ על פתח וסדר כדי לקבל את העובדה שכל הפרוסות ישמשו ליצירת המונטאז', ולחץ שוב על אישור כדי לקבל את ערך גורם קנה המידה המוצע. שמור את מונטאז' המקורי כקובץ TIF של שמונה סיביות ובחר תוספים, IJ_Plugins, סדרת מונטאז ' ל- Hyperstack ו- OK, כדי ליצור היפרסטאק 4D מהמונטאז ' המקורי הכולל את כל לוחות הזמנים. כדי ליצור את הסרט המוקרן הממוצע המקורי, בחר תחילה תוספים, IJ_Plugins, Project Hyperstack ו- OK, כדי לקבל את פרמטרי ברירת המחדל של ZProjection.שמור את הסרט המוקרן הממוצע כקובץ TIF של שמונה סיביות ובדוק את הסרט כדי לזהות מבנים בודדים שניתן לעקוב אחריהם למשך תקופת התיוג שלהם. זיהוי מבנה שניתן לעקוב אחריו באופן אמין למשך הסרט, ולבודד מבנה זה לצורך ניתוח, הם השלבים הקריטיים ביותר של ההליך. לאחר מכן בצע את ההוראות במדריך למשתמש תוסף, כדי לבודד מבנים של עניין על ידי עריכת montage.צור היפרסטאק 4D מהמונטאז' הערוך לתקופה הכוללת את מבני העניין, ושמור את ההיפר-סטאק הערוך. כדי לכמת את עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן עבור המבנה המבודד בהגזמה הדו-מימדית הערוכה, בחר תוספים, IJ_Plugins ונתח סרט ערוך, הזן את מרווח הזמן בין ערימות Z ולחץ על אישור. ליצירת סרט אחרון של המבנה המבודד, בחרו 'תוספים', 'IJ_Plugins' ו'היפרסטאק של פרוייקט', ציינו את פרוסות מחסנית Z שיש לכלול, בחרו 'עוצמה ממוצעת' כסוג ההקרנה ולחצו על הלחצן 'אשר'. כדי ליצור היפרסטאק 4D עם הנתונים המקוריים מעל הנתונים הערוכים, בחר תוספים, IJ_Plugins, מזג שני היפרסטאקים ומקם ראשון מעל השני. להפקת סרט מגזע ה-4D עם הנתונים המקוריים על הנתונים הערוכים, בחרו 'תוספים', 'IJ_Plugins' ו'היפרסטאק של פרוייקט', ציינו את פרוסות מחסנית Z שיש לכלול, בחרו 'עוצמה ממוצעת' כסוג ההקרנה ולחצו על הלחצן 'אשר'. כאן, ניתן להשוות את המסגרת הראשונה של הקרנת מחסנית Z של נתונים גולמיים לאותם נתונים מנופלים ונתונים מתוקנים מלבין.מסגרות אלה מאותו סרט מנומק ותיקון אקונומיקה להראות שני cisternae שנותחו, אשר תווית ראשונה עם חלבון גליקוזילציה עמידות ונדאט ירוק 4 או סמן Vrg4, ומאוחר יותר עם הפרשת אדום 7 או Sec7 סמן חלבון הובלת גנים. מונטאז' זה, שנוצר מהיפרסטאק מנומק ואקונומיקה מתוקן, מציג את כל החלקים האופטיים בנקודת זמן אחת לפני ואחרי העריכה, כדי לאפשר בידוד של האות מאחד מהמצוות שנבחרו. בנתון זה, מספר מסגרות מהסרט הסופי של ערימות Z המוקרנות מוצגות עם ההקרנות המקוריות בחלק העליון של הדמות והקרנות ערוכות בתחתית.כימות אותות הפלואורסצנט הירוקים והאדום מהססטרנה הגולגית שנבחרה מגלה כי סמן Vrg4 הירוק מגיע ונמשך כ-80 שניות, ולאחר מכן מגיע סמן ה-Sec7 האדום ונמשך כ-60 שניות, עם חפיפה קצרה בין שני הסמנים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזהות מבנים שניתן לעקוב אחריהם באופן חד משמעי לאורך כל חייהם. אותו סוג של ניתוח יכול להתבצע לאחר ביצוע מוטציה או סוג אחר של הפרעה ספציפית.טכניקה זו פתחה את הדרך לחקר ההתנהגות הדינמית של אתרי יציאה מרטיקוליום Golgi ו- endoplasmic באמצעות שמרים כמערכת מודל.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד...

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

שיטה להטבעת מושבות שמרים המאפשר חתך של מיקרוסקופ אור אלקטרונים. פרוטוקול זה מאפשר קביעה של חלוקת תאים sporulated ותאי pseudohyphal בתוך מושבות מתן כלי חדש לקראת הבנת הארגון של סוגי תאים בתוך קהילה פטרייתי.

במושבה שמרים והטבעה שיטה

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

כדאיות ניידת תלויה בניהול הזמן והיעיל של misfolding חלבון. כאן אנו מתארים שיטה להמחשת הגורל הפוטנציאלי השונה של חלבון misfolded: קפל שוב, שפלה, או תפיסה בתכלילים. אנו מדגימים את השימוש בחיישן מתקפל,...

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

אנו מציגים פרוטוקול להקפאה וcryosectioning קהילות שמרים להתבונן דפוסים הפנימיים של תאי ניאון. השיטה מסתמכת על מתנול, תיקון ואוקטובר הטבעה-לשמר את הפיזור המרחבי של תאים ללא inactivating חלבוני ניאון בתוך קהילה.

Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי

אנו מספקים שיטה בסיסית הניתנת לשחזור למיקרוסקופיה ארוכת טווח של מחזור החיים המיני של שמרי ביקוע. עם התאמות קלות שתוארו, הפרוטוקול המוצג מאפשר התמקדות מחקרית בשלבים שונים של תהליך הרבייה.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

ניצני שמרים הוא מודל יתרון לחקר הדינמיקה microtubule in vivo עקב גנטיקה חזקה שלה ואת הפשטות של שלד התא microtubule שלה. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להפוך ותאי שמרי התרבות, לרכוש תמונות מיקרוסקופיה confocal, וגם כמותית לנתח דינמיקת microtubule בתאים חיים שמרים.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

למד מיקרוסקופיה קונפוקלית רב-צבעית תלת-ממדית לאורך זמן לניתוח תאי שמרים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת אברונים תוך-תאית ומספקת הבנה מעמיקה של תהליכים תאיים ביולוגיים.

4D מיקרוסקופ של שמרים

גלה סרטונים נוספים