Name: מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: למדו מדידה בזמן אמת של צריכת חמצן וחומציות חוץ-תאית ברקמת רשתית מבודדת מעכברים באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאית. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של מטבוליזם אנרגיה ותגובות לתרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר אלכסנדר Kolesnikov, ד ר ולדימיר Kefalov על מתן Gnat1- / -עכברים, משוב מועילים ועצות, ולכל לקרוא את כתב היד.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH EY025269 (RR), המרכז לחקר הסוכרת באוניברסיטת וושינגטון - NIH DK020579 (JRM ו- RR), פרס פיתוח הקריירה מן המחקר כדי למנוע עיוורון (RR), קרן Horncrest (RR), פרס פיתוח הקריירה של האגודה לסוכרת נעורים ( JRM), DK101392 NIH (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS), DK114233 (JRM).

פרוטוקולים עקב האגודה לחקר חזון והצהרת רפואת עיניים עבור שימוש של בעלי החיים ואושרו על-ידי אוניברסיטת וושינגטון.
1. הכנה בעלי חיים
<ol><li>לשמור חיות בדיור סטנדרטי עם 12 שעות כהה מחזור אור 12 שעות. בגין ניסויים ב סטנדרטית פעמים כדי למנוע תופעות היממה, בדרך כלל בבוקר זמן קצר לאחר אורות דולקים.</li>
</ol>2. פתרון הכנה
<ol><li>להכין בסיס מדיה על ידי המסת 8.4 מ ג של אבקת מדיה מזוקק פעמיים H2O (ddH2O) להתאים את ה-pH ל 7.4 עם HCl או NaOH, לאמצעי אחסון הסופי של 1 ל' מסנן לחטא זה פתרון עם מסנן תרביות רקמה 0.22 מיקרומטר.<ol>
<li>מוסיפים גלוקוז 1 מ' ו- 100 מ מ פירובט נתרן בכלי התקשורת כדי להשיג הסופי ריכוזי גלוקוז 5 מ מ 1 מ"מ פירובט.</li>
		<li>המקום aliquot 50 מ של אמצעי התקשורת הבסיס באמבט מים 37 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להתכונן פירוק פתרון, רקמות כימות בסוף הניתוח השטף, על-ידי הוספת טריס בסיס 10 מ מ, פוליאתילן גליקול טרט-octylphenyl אתר 0.2% (v/v), EDTA עד 1 מ"מ, כל ddH2O. לערבב עד שכל הרכיבים התפרקה לחלוטין, להתאים ה-pH ל 8.0.</li>
	<li>עבור פרוטוקול מתח מיטוכונדריאלי, להכין מלאי של מיקרומטר 11 של oligomycin, מעכב ATP סינתאז, מומס בסיס מדיה למטרה הסופית ריכוז 1 מיקרומטר בבאר. להכין מלאי של מיקרומטר 11 של ציאניד קרבוניל - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), סוכן uncoupling, מומס בסיס מדיה למטרה הסופית ריכוז 1 מיקרומטר בבאר. להכין קוקטייל של מעכבי שרשרת האלקטרונים תחבורה, rotenone antimycin A (ראה) על-ידי הוספת rotenone 11 מיקרומטר, antimycin א 22 מיקרומטר, מומס מדיה בסיס היעד הסופי ריכוז rotenone מיקרומטר 1 ו- 2 מיקרומטר antimycin א ב טוב.</li>
	<li>עבור פרוטוקול גליקוליזה, להכין מלאי 220 מ מ של גלוקוז מומס מדיה הבסיס, כדי להתמקד ריכוז סופי של 20 מ מ בתוך הבאר. גם להכין מלאי 1.1 מ' של 2-deoxyglucose (2-DG), מעכב תחרותי של גלוקוז, אנטגוניסט glycolytic, על ידי המסת זה בתקשורת הבסיס. זה יעד ריכוז סופי של 100 מ מ 2-DG בבאר.</li>
</ol>3. מכשיר כיול
<ol><li>כדי לכייל את ומכשור וזמינותו השטף חוץ-תאית, להוסיף 1 מ"ל של כיול פתרון כל טוב של המחסנית חיישן (סה כ 24 בארות), דגירה ב 37 ° C ב- CO2-חינם חממה לילה (או לפחות 8 שעות).</li>
	<li>לטעון תוספים עבור פרוטוקול מיטוכונדריאלי מתח או בפרוטוקול גליקוליזה ליציאת כל מזרק, A עד D, שעל מחסנית חיישן, התאמת נפח שינויים בתוך הבאר. הערה: לדוגמה, יכלול assay טיפוסי 45 µL של תוסף ליציאת ה-מזרק הראשון, µL 49.5 לתוך השני, µL 54.5 לתוך µL השלישי, 60 לתוך האחרון, בהנחה אמצעי טוב הראשונית של 450 µL.</li>
	<li>במהלך הניסויים מספר הראשון, לטעון מדיה בסיס ליציאה A לאמוד כמה רקמות תנועה/החפץ מתרחשת לאחר זריקה יציאה.</li>
	<li>לאפשר את הצלחת חיישן טעון על דגירה-37 מעלות צלזיוס חממה-CO2 לפחות 60 דקות.</li>
</ol>4. בידוד של רקמת רשתית העכבר טרי
הערה: השלב זה ממאמרו של הטכניקה של ד ר בארי ווינקלר15.
<ol><li>לאחר ניהול הרדמה עמוקה באמצעות קוקטייל קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים סטנדרטי, המתת חסד עכברים מאת נקע בצוואר הרחם.</li>
	<li>השתמש זוג מלקחיים מעוקל בגודל בינוני תופסים את העולם האחורי על עצב הראייה, בעדינות קדימה אל תפעילו לחץ על proptose העין (איור 1 א').<ol>
<li>עם סכין גילוח נקי, ליצור חתך לימבוס כדי לימבוס על פני הקרנית באמצעות כרטיס יחיד, מכוונת של הלהב.</li>
		<li>שימוש בסדר, מלקחיים מקפירסון בסגנון זוויתי, צבוט הגלובוס האחורי כדי לבטא את העדשה וממברנות הקדמי hyaloid מתוך החתך הקרנית. להתעלם רקמות אלו.</li>
		<li>חזור על התמרון צובט עם מלקחיים לבטא עצביים ברשתית.</li>
		<li>עם המלקחיים כמו כפית כדי להרים את הרשתית, במקום להבין את הרקמה, העברת הרשתית מן החתך הקרנית ומניחים ישירות לתוך המדיה חמה תבשיל 3-ס"מ או צלחת אשכול 6-ובכן תרביות רקמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש שני זוגות של מלקחיים מקפירסון בסגנון בסדר, בזווית לנתח בעדינות הזגוגיות שנותרו מן הרשתית. זה נעשית על ידי האוחז את הזגוגיות בפריפריה של הגביע ברשתית ומושך לכיוון המרכז, עם disinsertion הסופית של הגוף בזגוגית מהמרכז בכללותה. עם המלקחיים, הסר כל אפיתל הפיגמנט ברשתית שיורית משטח קולט אור ברשתית.<ol>
<li>חותכים טיפ pipet P1000 עם סכין גילוח כדי ליצור פתח ~ 4 מ מ כדי למנוע טראומה מיותרת לרקמת הרשתית עדין במהלך העברת תמרונים.</li>
		<li>להעביר את רקמת רשתית מבודד טריים מדיה באמצעות טיפ pipet לחתוך P1000.</li>
		<li>חותכים 1 מ"מ האגרופים של הרשתית סביב עצב הראייה עם ביופסיה 1 מ"מ אגרוף מצויד עם פומפה מכך הרקמה, במקרה זה הופך ונתקע לתוך נשא (איור 1B). הגדר את האגרופים ברשתית הצידה בתקשורת נקייה כל הזמן על בלוק 37 ° C או חימום משטח.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. assay פרוטוקול
<ol><li>העברה אגרופים בודדים microplate לכידת 24-ובכן איון באמצעות טיפ P1000 לחתוך, כ רפה בעברית µL 450 של המדיה יחד עם הרקמה.</li>
	<li>השתמש בסדר, ישר מלקחיים בעדינות לתפעל אגרופים למרכז microplate. שמור אגרופים חוקיים באותו כיוון (למשל, תא גנגליון בצד כלפי מעלה).<ol>
<li>הנח את הצלחת הלכידה על כרית חימום או חימום בלוק מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס כפי שלבים אלה חוזרים על עצמם על הדגימות הנותרים. הערה: עבור ניסוי, להפריש 3-4 בארות ריק עם 450 µL של בסיס מדיה כדי לשמש כפקדי שלילי. הנותרים 20-21 וולס, לבדוק כל שכפול וחיסונים דולר. לכן, כל צלחת 24-ובכן יאפשר עבור הקלטת של 6-7 בעלי חיים שונים או טיפול תנאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הימנעות בועות אוויר, מיקום בעדינות איון ללכוד רשת מוסיף לתוך כל טוב באמצעות מלקחיים, לאבטח את הכיסויים עם פומפה מתכת, או עם טיפ pipet P1000 לחתוך (איור 1 C). הערה: להימנע התנועה רקמות מופרז במהלך שלב זה כדי לשמור על מיקום הניקוב רשתית בתוך המרכז של microchamber הדגימה. בועות אוויר לעוות קשות OCR קריאות. למרות microchamber יש עומק מספיק כדי להכיל את עכבר אופייני רשתית (איור 1C), לעתים עיבוד שבבי-פגמים הכיסויים רשת עלול לגרום רקמות להיות דחוס מדי במהלך מסך הכניסה. אם זה קורה, פשוט רשום של הרקמה כתוש, אל תכלול הדגימה הניתוח הסופי.</li>
	<li>דגירה לצלחת רקמות 37 ° C CO2-חממה חינם לפחות 60 דקות.</li>
	<li>תוכנית במנתח השטף חוץ-תאית באמצעות ערבוב, חכה. מידה, וחזור על פקודות. לדוגמה, ניסוי טיפוסי עם רקמת רשתית עשויים לכלול את הפריטים הבאים: מערבבים 2 דקות, להמתין 2 דקות, וכך למדוד 5 דקות. חזור על הניסוי עם שלושת השלבים בין 5 - 8 פעמים (מחזורים) לצורך הקלטה בסיסית, ואחרי הזרקה של כל המתחם נבדק במהלך הריצה.</li>
	<li>לחץ על לחצן התחל תוכנית במנתח השטף חוץ-תאית, בצע את ההוראות שעל המסך כדי הכנס את מיכל הדיו חיישן לכיול.</li>
	<li>בסוף הכיול, בצע את ההוראות שעל המסך כדי להחליף את הצלחת calibrant עם לוחית המכיל את הדגימות ברשתית.</li>
	<li>מאפשר לתוכנית לפעול, כפי מתוכנת. בסיום ההפעלה, בצע את ההוראות שעל המסך כדי להוציא את הצלחת רקמות. הצג את תוצאות המרוץ ולאחסן את קובץ הנתונים.</li>
	<li>עם מחט בקוטר 20 כפופות, מלקחיים, הסר מוסיף רשת כל הבארות, ומותיר את האגרוף ברשתית.</li>
	<li>בזהירות תשאף המדיה מן הרקמה ולשטוף את הרקמה פעמיים עם 0.5 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS). האחות של PBS לאחר הרחצה.</li>
	<li>להוסיף 100 µL מאגר פירוק כל טוב, pipet למעלה ולמטה כדי homogenize רקמות.</li>
	<li>Quantitate רמות הקלט בהתבסס על סך כפול גדילי הדנ א (dsDNA) או תכולת החלבון הכולל. הערה: להלן מבוססת על וזמינותו dsDNA זמינים מסחרית.</li>
	<li>לדלל דגימות lysed 1:1 על-ידי הוספת µL 100 טריס-EDTA (TE) מאגר ולהעביר µL 100 המדגם מדולל צלחת טוב 96.<ol>
<li>להוסיף 100 µL מאגר זיהוי כל טוב. לאחר ערבוב 2-5 דקות, quantitate קרינה פלואורסצנטית לאחר עירור-480 ננומטר, פליטה-520 nm, השוואת לעקומה סטנדרטי.</li>
		<li>לנרמל את העקיבה raw השטף חוץ-תאי DNA תוכן בתוך הבאר. הערה: בתוצאות המובאות כאן, דוגמאות הן מנורמל ל 50 ng dsDNA - כמות אופיינית באגרוף ברשתית 1 מ מ. לכן, הערכים המוחלטים המובאות כאן ניתן להשוות מחקרים בהצגת נתונים "לפי ברשתית פאנץ'". לנרמל לשרטוטים כדי תקן פנימי, כגון הבסיס להפעיל בכל ריכוז הגלוקוז של 5 מ מ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+and+brain%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function%3A+high+cost+of+Na%2B+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li>
<li>Wubben, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+metabolic+reprogramming+provides+survival+advantage+in+acute+stress+while+causing+chronic+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration.</a> Scientific reports. 7 (1), 17863(2017).</li>
<li>Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Metabolism+in+the+Intact+Retina+Using+Stable+Isotope+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers.</a> Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).</li>
<li>Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Combined+Retinal+Vascular+and+Tissue+Oxygen+Tension+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging.</a> Scientific reports. 7 (1), 10622(2017).</li>
<li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+lactate%2C+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li>
<li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).</li>
<li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li>
<li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li>
<li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biology%22%5BJournal%5D)">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113(2017).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li>
<li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+research%22%5BJournal%5D)">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li>
<li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+proton+and+electron+leaks%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

OCR, ECAR נמדדים ברצון ברקמת הרשתית explanted באמצעות bioanalyzer תוך שימוש בטכניקות המתואר. שיטה זו יוצאת מאלו של קבוצות אחרות במספר שלבים קריטיים. רקמות ברשתית מבודדים דרך חתך גדול הקרנית ללא enucleating העולם, כפי שהם במקור מתוארת על ידי וינקלר15. שיטה זו של בידוד ברשתית מאפשר העברה מהירה מעינו החי המשקולת לכידת רקמות (לרוב בתוך 5 דקות). רקמות נשמרים ב 37 מעלות צלזיוס לאורך כל התהליך, אשר משמר נשימה תאית טוב יותר כאשר הם ממוקמים על קרח. מדיה עם תוספות מינימליות משמשים עבור מדידות ראשוניות, תוך ...

הרשתית היא בין הרקמות ביותר דורש אנרגיה מערכת העצבים המרכזית1. כמו רוב רקמות, שהיא מייצרת אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך גליקוליזה ב זרחון חמצוני ציטוזול או דרך בתוך המיטוכונדריה. היתרון האנרגטי של זרחון חמצוני על גליקוליזה לייצר ATP ממולקולה אחת של גלוקוז נקי: 36 מולקולות של ATP שנוצר מתוך לשעבר לעומת 2 מולקולות של ATP שנוצר האחרון. בהתאם לכך, הנוירונים ברשתית תלויים בעיקר נשימה מיטוכונדריאלי לאספקת אנרגיה, זה משתקף על ידי שלהם צפיפות גבוהה של המיטוכונדריה2. ובכל זאת, הרשתית גם מסתמכת במידה רבה על מכונות glycolytic גם כאשר חמצן בשפע. תהליך זה של אירובי גליקוליזה תוארה לראשונה על ידי אוטו ורבורג3, מי פעם ציין, כי הרשתית הרקמה רק שלאחר mitotic מסוגל צורה זו של חילוף החומרים4בתאים סרטניים. מאז תצפיות ראשוניות אלה, ברקמות רבות שלאחר mitotic תוארו לעסוק בדרגות שונות של גליקוליזה בנוסף זרחון חמצוני כדי לענות על דרישותיהם ATP.
Phototransduction, פיגמנט חזותי מיחזור, ביוסינטזה של מקטעי החיצוני קולט אור, בפעילות הסינפטית הם כל התהליכים תובעניים אנרגיה photoreceptors, מחלקת המשנה השולט עצביים ברשתית. אך הצורך להעביר באופן פעיל יונים נגד שלהם חשמל ומעברי הריכוז הוא עד כה התהליך לארוך ביותר אנרגטית נוירונים1. Photoreceptors הם נוירונים מוזר במובן שהם אינם depolarized בהיעדר גירוי (קרי, בחושך), ואילו גירוי אור מפעילה ערוץ הסגר, hyperpolarization הבאים. לכן, בחושך, הרשתית צורכת כמויות גדולות של ATP כדי לשמור על דפולריזציה או "זרם אפל" שלה, כפי שהיא מכונה בדרך כלל. מההיבט אדפטיבית, הוא אתגר גדול באספקת אלה כמויות אדירות של ATP עבור אורגניזמים לשמור על בהירות חזותית באמצעות לציר האופטי. הארכיטקטורה ברשתית הפוך אצל יצורים מודרני הוא הפתרון דומיננטי, כמו זה שומרת את הרשת נימי צפופה הספקת photoreceptors לברוח מדרכו של אור. . אבל זה מעורר פליאה bioengineering טבעי מקומות הרשתית צוק במונחים של שמורת מטבולית. עלבונות קטן אפילו לרשתית פוטנציאלי יכול לשבש את האיזון העדין של אספקת אנרגיה לדרוש, תפקוד חזותי או עיוורון פרנק עשוי לנבוע במהירות.
בהתחשב הדרישות האנרגטי הייחודי של הרשתית עצבית, בשילוב עם הגבלה חזק של אספקת הדם, מדידה מדויקת של צריכת ATP הרשתית ואת שלו משתנה במהלך המחלה עשויות להיות השלכות עמוקה תוך הבנה וטיפול מעלף מצבים כגון רטיניטיס פיגמנטוזה רטינופתיה סוכרתית. באופן מסורתי, מדידות אלה דורשים ציוד יקר, אישית מעוצבת עם רוב המחקרים מתוך קומץ של מעבדות שכולו מוקדש מדידות של פעילות חילוף החומרים2,5,6, 7,8. טכניקות כוללים מבחני בודדים של המטבוליטים ספציפיים, מחקרים מעקב באמצעות התווית על-ידי רדיו סימנים מקדימים, צריכת חמצן הקלטה באמצעות אלקטרודות קלארק, ו metabolomic פרופיל9.
עם ההתקדמות בטכנולוגיית תפוקה גבוהה וזמינות מוגברת של התקנים מסחריים, טכניקות כדי הרשומה מטבוליזם ברשתית הם יותר ויותר נגיש וזול. השיטה המתוארת כאן מודד בשני זרחון חמצוני, גליקוליזה רשתית העין באמצעות explanted רקמות ו זמין מסחרית השטף חוץ-תאית מנתח9,10,11,12. זה מנתח מתעדת בנפרד קצב צריכת החמצן (OCR), שער חוץ-תאית acidification (ECAR), הגשה אינדיקטורים עקיף של זרחון חמצוני, גליקוליזה, בהתאמה13. מדידות אלה נעשית על ידי בדיקה submersed במרחק microchamber שנוצרו על הרקמה של ריבית. זה עיבוד של שיטות שפורסמו בעבר משתמש צלחת לכידת תוכנן במקור עבור לנגרהנס בלבלב כדי להקליט את פעילות חילוף החומרים בסעיפים קטנים, עגולים של רשתית העכבר. חשיפות מרובות תרופתי יכול להיות מועברת הרקמה במהלך הקלטה יחיד כי המערכת מכילה 4 יציאות הזרקת עבור כל דגימה. טוב. באמצעות מערכת זו עם פרוטוקולים נפרד אופטימיזציה עבור הקלטות ECAR, OCR, התגובות של פראי-סוג באדמומיות ניתן להשוות הרשתיות חסר transducin (Gnat1- / -), סיבת עיוורון לילה נייח מולדות ב בני14.

<table><tbody><tr><td>Seahorse XF24 מנתח שטף חוץ-תאי</td><td>Agilent, סנטה קלרה, קליפורניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (כולל: לכידת איים Microplate, מחסנית חיישן ופתרון קליברנט)</td> <td>Agilent, סנטה קלרה, CA</td><td>101174-100</td><td>כולל מיקרו-צלחת לכידת איים, מחסנית חיישן ותמיסת קליברנט</td></tr><tr><td>RPMI 1640 מדיה (מדיום אבקתי)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>R1383</td><td>RPMI 1640 מדיה עם L-גלוטמין וללא גלוקוז או נתרן ביקרבונט</td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G8270</td><td>1M D-גלוקוז מסונן, להכנת</td></tr><tr><td>מדיה נתרן פירובט</td><td>קורנינג</td><td>25000CI</td><td>100 מ"מ נתרן פירובט</td></tr><tr><td>אנטימיצין-A</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A8674</td><td>רכיב פרוטוקול מתח מיטוכונדריאלי</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C2920</td><td>רכיב פרוטוקול מתח מיטוכונדריאלי</td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R8875</td><td>רכיב פרוטוקול מתח מיטוכונדריאלי</td></tr><tr><td>2-דאוקסיגלוקוז</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D6134</td><td>רכיב פרוטוקול גליקוליזה</td></tr><tr><td>1 מ"מ ביופסיית עור אגרופים עם בוכנה</td><td>Integra-Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td>שתילת כלי רקמת רשתית</td></tr><tr><td>Dumont Mini-Forceps Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-10</td><td>השתלת כלי רקמת רשתית</td></tr><tr><td>Dumont Medical #5/45 מלקחיים- בזווית 45 מעלות</td><td>כלי מדע עדין</td><td>11253-25</td><td>השתלת כלי רקמת רשתית</td></tr><tr><td>Dumont #7 מלקחיים -</td><td>כלי מדע עדינים</td> מעוקלים <td>11271-30</td><td>השתלת כלי רקמת רשתית</td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA ערכת בדיקת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P7589</td><td>טעינת מבחן</td></tr> <tr><td>נורמליזציהבסיס טריזמה (בסיס טריס)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T6066</td><td>רכיב של מאגר ליזה</td></tr><tr><td>טריטון X-100 (פוליאתילן גליקול טרט-אוקטילפניל אתר)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>X100</td><td>רכיב של מאגר ליזה</td></tr><tr><td>0.5M EDTA pH 8.0</td><td>אמביון</td><td>AM9262</td><td>רכיב של מאגר ליזה</td></tr><tr><td>עכברי C57BL/6J&nbsp;</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>&nbsp; זן 000664</td><td>Animals</td></tr><tr><td>Gnat1-/- ו-Gnat1+/+&nbsp;</td><td>ולדימיר קפאלוב, דוקטורט; בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון</td> בעלי <td>חיים</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

חזון חדות גבוהה היא תהליך בכבדות הצורכים אנרגיה, הרשתית פיתחה מספר עיבודים ייחודיים לדרישות בדיוק כזה תוך שמירה על שקיפות של הציר חזותי. לפליטת כדי איזון עדין זה לגרום מחלות מסנוור, כגון רטינופתיה סוכרתית. לכן, ההבנה של האנרגיה חילוף החומרים משתנה ברשתית במהלך המחלה הכרחי להתפתחות של טיפולים רציונלי עבור גורמים שונים של אובדן vison. הופעתו האחרונה של מנתחי השטף חוץ-תאית זמין מסחרית הפך המחקר של חילוף החומרים האנרגיה ברשתית נגיש יותר. פרוטוקול זה מתאר את השימוש כזה מנתח כדי למדוד את התרומות לאספקת אנרגיה ברשתית באמצעות זרועותיה עיקרון שני - זרחון חמצוני, גליקוליזה - מאת לכימות שינויים בשערי צריכת חמצן (OCR), חוץ-תאית המחירים acidification (ECAR) כאל שליחים עבור המסלולים הללו. טכניקה זו מבוצעת בקלות ברקמת הרשתית explanted, הקלה על הערכה של התגובות מרובות סוכנים תרופתי בניסוי יחיד. חתימות מטבולית הרשתיות מחיות חסר רוד קולט אור איתות מושווים לפקדים פראי-סוג בשיטה זו. מגבלה משמעותית בטכניקה זו הוא חוסר היכולת להבחין בין ניצול האנרגיה הותאם-אור, dark-adapted, שיקול חשוב הפיזיולוגיות ברקמת הרשתית.

תוך שימוש בטכניקות המתואר (מסוכם באיור1), explants ברשתית מ 8 בת שבוע פראי סוג (WT) עכברים היו לעומת גיל - ועל רקע-מתאימים transducin null עכברים (Gnat1- / -). כי Gnat1- / - בעלי חיים חסרי המכונות כדי לסגור מחזורית-נוקלאוטיד מגודרת תעלות יונים בתגובה לגירויים קלים, photoreceptors רוד שלהם להישאר depolarized גם ב קל14. עוקבות צריך לשמור על אשלגן בזרימת תיצור ביקוש גדול ATP, וכתוצאה מכך זן...

טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כגון כיצד חילוף החומרים של האנרגיה ברקמת הרשתית שונה בין דגימות ביולוגיות, או לאחר חשיפה לסוכנים פרמקולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת ברקמת רשתית אורגנותית מופרשת כדי למדוד שיעורים של גליקוליזה, וזרחון מחומצן ומאפשר הערכות של התערבויות בזמן אמת במבחנה. כדי לכייל את המכשור עבור מישן שטף חוץ-תאי, הוסף תחילה מיליליטר של תווי כיול לכל באר של מחסנית החיישנים של 24 הבאר, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור ללא Co2 במהלך הלילה.טען תוספים עבור פרוטוקול הלחץ המיטוכונדריאלי, או פרוטוקול הגליקוליזה לכל יציאת מזרק במחסנית החיישן, תוך כוונון לשינויי נפח באר. בהנחה נפח באר ראשונית של 450 microliters, בדיקה טיפוסית תכלול 45 microliters של תוסף לתוך יציאת המזרק הראשון, 49.5 microliters ב השני, 54.5 microliters לתוך השלישי, ו 60 microliters עד האחרון. במהלך הניסויים הראשונים, לטעון בסיס בינוני לתוך יציאה A כדי לאמוד כמה חפץ תנועת רקמות מתרחשת לאחר הזרקת יציאה.אפשר לצלחת החיישן הטעון להידגר ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור שאינו Co2 למשך 60 דקות לפחות. התחל בידוד של רקמת רשתית עכבר טרי עם עכבר מרופד טרי. השתמש בזוג ממטרים מעוגלים בגודל בינוני כדי לתפוס את הגלובוס האחורי בעצב הראייה, ולהחיל בעדינות לחץ קדימה כדי להניע את העין.עם סכין גילוח נקי, צור לימבוס לחתך לימבוס על פני הקרנית באמצעות מעבר יחיד ומכוון של הלהב. באמצעות מדפים בסגנון מקפרסון בזווית עדינה, צובטים את הגלובוס האחורי כדי לבטא את העדשה ואת קרום ההילואידים האחורי מתוך החתך הקרנית. חזור על תמרון הצביטה עם מטלות כדי לבטא את הרשתית העצבית.לאחר מכן, השתמש במקלות כמו כף כדי להרים את הרשתית הרחק החתך הקרנית. מניחים את הרשתית ישירות לתוך המדיום החם בצלחת של שלושה סנטימטרים, או צלחת אשכול תרבות רקמות שש באר. לאחר מכן, השתמש בשני זוגות של מטלשי הסגנון של מקפרסון בזווית עדינה כדי לנתח בעדינות את הזייפים הנותרים מהרטינה.הדבר נעשה בצורה הטובה ביותר על ידי תפיסת ההוויה בפריפריה של גביע הרשתית, ומושך לכיוון המרכז, עם disinsertion הסופי של הגוף ההגשום מהמרכז בכללותו. לאחר מכן, להסיר כל אפיתל פיגמנט רשתית שיורית מפני השטח קולטן צילום של הרשתית. חותכים קצה פיפטה P1000 עם סכין גילוח כדי ליצור פתח משוער ארבעה מילימטר כדי למנוע טראומה מיותרת לרקמת הרשתית העדינה במהלך תמרוני העברה.לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה לחתוך להעביר את רקמת הרשתית מבודדת לתוך מדיום טרי. לבסוף, להשתמש אגרוף ביופסיה מילימטר אחד מצויד בוכנה, כדי לחתוך אגרופים של רשתית סביב עצב הראייה. מניחים את האגרופים ברשתית בצד במדיום נקי, נשמר על בלוק 37 מעלות צלזיוס, או כרית חימום.לאחר איסוף מספר האגרופים הרצוי, השתמש בקצה P1000 חמוד כדי לשאיף אגרוף בודד ב-450 מיקרוליטרים של מדיום, והעבר אותו לצלחת מיקרו לכידת עפעפיים באורך 24 מעלות על כרית חום או בלוק חום של 37 מעלות צלזיוס. השתמש במדפים ישרים עדין כדי לתפעל בעדינות אגרופים למרכז צלחת המיקרו. שמור על אגרופים מכוונים באותו כיוון.לדוגמה, כאשר צד תא הגנגליון כלפי מעלה. עבור כל ניסוי להפריש שלוש עד ארבע בארות ריקות עם 450 microliters של מדיום הבסיס לשמש פקדים שליליים. תוך הימנעות בועות אוויר או תנועה מוגזמת, בעדינות למקם את העין ללכוד רשת מוסיף לתוך כל באר, ולאבטח את מוסיף עם בוכנה מתכת או עם קצה פיפטה P1000 לחתוך.למרות שלמיקרו-תא יש עומק הולם כדי להכיל רשתית עכבר טיפוסית, מדי פעם פגמים במכונה במוסיף הרשת גורמים לרקמות להידחס יתר על מדי במהלך החדרת המסך. אם זה קורה, פשוט רשום את הרקמה המרוסקת הזו, ואל תכלול את הדגימה מהניתוח הסופי. הדגירה את צלחת הרקמה באינקובטור ללא פחמן דו חמצני 37 מעלות לפחות 60 דקות.תכנת את מנתח השטף התאי הנוסף באמצעות פקודות ערבוב, משקל, מדידה וחזרה. כדוגמה, ניסוי טיפוסי עם רקמת רשתית עשוי לכלול את הדברים הבאים. מערבבים שתי דקות, מחכים שתי דקות, ומודדים חמש דקות.חזור על הניסוי עם שלושה שלבים אלה בין חמש לשמונה פעמים עבור הקלטת קו הבסיס, ולאחר הזרקה של כל תרכובת נבדק. לחץ על לחצן ההפעלה של התוכנית במנתח השטף החוץ-תאי ובצע את ההוראות המופיעות על המסך כדי להכניס את מחסנית החיישן לכיול. בסוף הכיול, בצע את ההוראות על המסך כדי להחליף את הלוח כיול עם הלוח המכיל את דגימות הרשתית, ולאחר מכן לאפשר לתוכנית לפעול כ מתוכנת.בסיום הריצה, בצע את ההוראות על המסך כדי להוציא את לוחית הרקמה. הצג את תוצאות הריצה ואחסן את קובץ הנתונים. עם מחט מכופפת 20 מד ומדפים, להסיר את כל מוסיף רשת מן בארות, משאיר את אגרוף הרשתית מאחור.בזהירות שאפו את המדיום מן הרקמה, ולשטוף את הרקמה פעמיים עם 0.5 מיליליטר של מלוחים פוספטים קרים. לאחר שאיפה לשטוף PBS השני, להוסיף 100 microliters של חיץ תמוגה לכל לשטוף, ואת פיפטה למעלה ולמטה כדי הומוגניזציה של רקמה. לבסוף, לכמת את רמות הקלט בהתבסס על תוכן ה-DNA כפול תקוע הכולל על ידי דילול דגימות lysed אחד לאחד, עם 100 microliters של מאגר טריס-EDTA, והעברת 100 microliters של המדגם מדולל לצלחת 96 היטב.לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של מאגר זיהוי לכל באר ומערבבים במשך שתיים עד חמש דקות. לבסוף, לכמת את הצמחייה לאחר גירוש ב 480 ננומטר ו פליטה ב 520 ננומטר על ידי השוואה עקומה סטנדרטית. לנרמל את מעקב שטף חוץ תאי גלם לתוכן ה-DNA בתוך באר.בקו הבסיס, בנוכחות חמישה מילי סוכר מולר בנוכחות 10 מילי מולר פירובט, אין הבדל משמעותי בשיעורי eflux חומצה, נמדד על ידי קצב חומציות חוץ תאית. בין רקמות רשתית מבעלי חיים מסוג wile, או לדפוק את העכברים כי חסרים את המכונות כדי לסגור תעלות יון מגודר נוקלאוטידים מחזוריים בתגובה לגירויים אור. דפוסים דומים נראים לאחר תוספת של 20 מילי סוכר מולר מעכבי גליקוליטי 2DG.נתונים אלה עשויים להשתנות מתמטית כדי לייצג שינויים חלקיים מקו הבסיס, תבנית שעשויה לאפשר השוואה טובה יותר בין התערבויות ניסיוניות שונות. קצב צריכת חמצן מוחלט בבסיס גם שווה ערך בין שליטה לרקמת רשתית מוטנטית. תוספת של 20 מילי מולר גלוקוז מגביר את הנשימה המיטוכונדריאלית, אבל אין שינוי שנצפה בין קבוצות במונחים של כימות מוחלט או במונחים של שינוי מקו הבסיס.התוספת של אחד מילי מולר FCCP, סוכן ניתוק, כדי להדגים שיעורי נשימה מיטוכונדריאליים מקסימלית אינה להגדיל באופן משמעותי OCR מעל לרמה לראות עם גלוקוז גבוה בשליטה רקמת רשתית מוטציה. עם זאת, אותות משני העכברים לרדת באופן דרסטי לאחר תוספת של קוקטייל RAA. לסיכום, אנו מדגימים טכניקה לכימות שיעורים של זרחון מחומצן וגליקוליזה במתפוצצים אורגנוטיים של רשתית העכבר.עם בידוד יעיל של רקמת הרשתית, הטכניקה מניבה מדידות אמינות הניתנות לניתוב מחדש. השפעות בזמן אמת של חשיפות, כגון סוכנים בלתי מפרידים, ניתן להעריך. בנוסף להליך זה, שיטות אחרות, כמו RTPCR כמותי סופג המערבי, ניתן לבצע על הרקמה העודפת מבודד בשלב הניתוח כדי לקבל מידע מקביל רלוונטי למחקרים של חילוף החומרים ברשתית.

measurement-energy-metabolism-explanted-retinal-tissue-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מספק גישה ביוכימית למדידת קצב החמצה חוץ-תאי (ECAR) וקצב צריכת חמצן (OCR) של תאים לוקמיים ראשוניים עם בדיקת שטף חוץ-תאי. הערכת הפרופיל המטבולי של תאים אלה מסייעת לאפיין את דרישותיהם, מה שמוביל לטיפול מותאם אישית.

בדיקת שטף חוץ-תאי: שיטה למדידת פרופיל מטבולי של תאים

סרטון זה מדגים את השיטה לניתוח מטבוליזם אנרגיה בתאי NK אנושיים פעילים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי. מעכבים שונים של מכלולי שרשרת הובלת האלקטרונים משפיעים על סינתזת ATP, הנמדדת באמצעות קצב צריכת החמצן או OCR, ומספקים תובנות לגבי חילוף החומרים התאי והביו-אנרגטיקה.

ניטור בזמן אמת של מטבוליזם אנרגיה בתאי NK אנושיים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי

תכנות מחדש מטבולי הוא מאפיין ותנאי מוקדם לקיטוב מקרופאגים M1 ו-M2. כתב יד זה מתאר מבחן למדידת פרמטרים בסיסיים של גליקוליזה ותפקוד מיטוכונדריאלי במקרופאגים שמקורם במח עצם של עכבר. ניתן ליישם כלי זה כדי לחקור כיצד גורמים מסוימים משפיעים על חילוף החומרים והפנוטיפ של המקרופאגים.

אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת

פרוטוקול זה מספק גישה חסכונית כדי לבודד ולאפיין העכבר הראשי כליות צינורי תאים יכולים לאחר מכן להיות תת תרבותי להערכת תפקודים ביולוגיים כליות ex-vivo, כולל ביואנרגיה מיטוכונדריאלי.

ניתוח השטף חוץ-תאי בידוד, אפיון, תפוקה גבוהה של העכבר הראשי כליות צינורי בתאי אפיתל

מתואר כאן פרוטוקול מפורט לביצוע בדיקת מתח מיטוכונדריאלית ובוחן קצב גליקוליטי בדגימות רקמת רשתית ex vivo באמצעות ביואנלייזר מסחרי.

קביעת נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזיס בדגימות רקמת רשתית Ex Vivo

השיטה המוצגת כאן מסכמת פרוטוקולים ממוטבים להערכת ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים שאינם דבקים ובתאי אב פרימיטיביים (HSPCs) תוך שימוש במנתח השטף החוץ-תאי כדי למדוד את קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) ואת קצב צריכת החמצן (OCR) של HSPCs בזמן אמת.

הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי

פרוטוקולים אלה יסייעו למשתמשים לחקור את חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים שמקורם בתאי סרטן תלת-ממדיים באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי של סוסון ים.

חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי

המצב המטבולי של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית האנושית (H-RPE) משקף את בריאותם ותפקודם. מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לבחינת שטף מטבולי בזמן אמת של H-RPE באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

ניתוח בזמן אמת של ביואנרגטיקה בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים בבני אדם באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

כאן, אנו מתארים בפירוט שיטות לחילוץ מקרופאגים ממח העצם, הטחול והלב האוטם, ולאחר מכן הערכת שטף מטבולי בתאים חיים.

ניתוח שטף מטבולי ex vivo במקרופאגים של הטחול והלב, ומונוציטים של מח העצם

פרוטוקול זה מתאר דרך חסכונית לביצוע בדיקת מאמץ גליקוליזית לכימות תכנות מחדש מטבולי במיקרוגליה ראשונית של העכברים. לאחר בידוד וגירוי דלקתי, נמדד קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR) באמצעות מגיבים טריים ומותאמים ל-pH, ולאחר מכן נרמול חלבונים כדי לאפשר הערכה מדויקת וניתנת לשחזור של היסטים גליקוליטיים.

חקר גליקוליזה במיקרוגליה ראשונית באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאית

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לכימות קצב צריכת החמצן וקצב החמצה החוץ-תאית של חדרי דגי זברה בוגרים מחוץ לחיים כדי לאפיין את היכולת המטבולית החמצונית והגליקוליטית שלהם.

הערכת הפעילות המטבולית של חדרי דגי זברה המתחדשים מחוץ לחיים באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאית

למדו מדידה בזמן אמת של צריכת חמצן וחומציות חוץ-תאית ברקמת רשתית מבודדת מעכברים באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאית. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של מטבוליזם אנרגיה ותגובות לתרופות.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

גלה סרטונים נוספים