מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כגון כיצד חילוף החומרים של האנרגיה ברקמת הרשתית שונה בין דגימות ביולוגיות, או לאחר חשיפה לסוכנים פרמקולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת ברקמת רשתית אורגנותית מופרשת כדי למדוד שיעורים של גליקוליזה, וזרחון מחומצן ומאפשר הערכות של התערבויות בזמן אמת במבחנה. כדי לכייל את המכשור עבור מישן שטף חוץ-תאי, הוסף תחילה מיליליטר של תווי כיול לכל באר של מחסנית החיישנים של 24 הבאר, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור ללא Co2 במהלך הלילה.

טען תוספים עבור פרוטוקול הלחץ המיטוכונדריאלי, או פרוטוקול הגליקוליזה לכל יציאת מזרק במחסנית החיישן, תוך כוונון לשינויי נפח באר. בהנחה נפח באר ראשונית של 450 microliters, בדיקה טיפוסית תכלול 45 microliters של תוסף לתוך יציאת המזרק הראשון, 49.5 microliters ב השני, 54.5 microliters לתוך השלישי, ו 60 microliters עד האחרון. במהלך הניסויים הראשונים, לטעון בסיס בינוני לתוך יציאה A כדי לאמוד כמה חפץ תנועת רקמות מתרחשת לאחר הזרקת יציאה.

אפשר לצלחת החיישן הטעון להידגר ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור שאינו Co2 למשך 60 דקות לפחות. התחל בידוד של רקמת רשתית עכבר טרי עם עכבר מרופד טרי. השתמש בזוג ממטרים מעוגלים בגודל בינוני כדי לתפוס את הגלובוס האחורי בעצב הראייה, ולהחיל בעדינות לחץ קדימה כדי להניע את העין.

עם סכין גילוח נקי, צור לימבוס לחתך לימבוס על פני הקרנית באמצעות מעבר יחיד ומכוון של הלהב. באמצעות מדפים בסגנון מקפרסון בזווית עדינה, צובטים את הגלובוס האחורי כדי לבטא את העדשה ואת קרום ההילואידים האחורי מתוך החתך הקרנית. חזור על תמרון הצביטה עם מטלות כדי לבטא את הרשתית העצבית.

לאחר מכן, השתמש במקלות כמו כף כדי להרים את הרשתית הרחק החתך הקרנית. מניחים את הרשתית ישירות לתוך המדיום החם בצלחת של שלושה סנטימטרים, או צלחת אשכול תרבות רקמות שש באר. לאחר מכן, השתמש בשני זוגות של מטלשי הסגנון של מקפרסון בזווית עדינה כדי לנתח בעדינות את הזייפים הנותרים מהרטינה.

הדבר נעשה בצורה הטובה ביותר על ידי תפיסת ההוויה בפריפריה של גביע הרשתית, ומושך לכיוון המרכז, עם disinsertion הסופי של הגוף ההגשום מהמרכז בכללותו. לאחר מכן, להסיר כל אפיתל פיגמנט רשתית שיורית מפני השטח קולטן צילום של הרשתית. חותכים קצה פיפטה P1000 עם סכין גילוח כדי ליצור פתח משוער ארבעה מילימטר כדי למנוע טראומה מיותרת לרקמת הרשתית העדינה במהלך תמרוני העברה.

לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה לחתוך להעביר את רקמת הרשתית מבודדת לתוך מדיום טרי. לבסוף, להשתמש אגרוף ביופסיה מילימטר אחד מצויד בוכנה, כדי לחתוך אגרופים של רשתית סביב עצב הראייה. מניחים את האגרופים ברשתית בצד במדיום נקי, נשמר על בלוק 37 מעלות צלזיוס, או כרית חימום.

לאחר איסוף מספר האגרופים הרצוי, השתמש בקצה P1000 חמוד כדי לשאיף אגרוף בודד ב-450 מיקרוליטרים של מדיום, והעבר אותו לצלחת מיקרו לכידת עפעפיים באורך 24 מעלות על כרית חום או בלוק חום של 37 מעלות צלזיוס. השתמש במדפים ישרים עדין כדי לתפעל בעדינות אגרופים למרכז צלחת המיקרו. שמור על אגרופים מכוונים באותו כיוון.

לדוגמה, כאשר צד תא הגנגליון כלפי מעלה. עבור כל ניסוי להפריש שלוש עד ארבע בארות ריקות עם 450 microliters של מדיום הבסיס לשמש פקדים שליליים. תוך הימנעות בועות אוויר או תנועה מוגזמת, בעדינות למקם את העין ללכוד רשת מוסיף לתוך כל באר, ולאבטח את מוסיף עם בוכנה מתכת או עם קצה פיפטה P1000 לחתוך.

למרות שלמיקרו-תא יש עומק הולם כדי להכיל רשתית עכבר טיפוסית, מדי פעם פגמים במכונה במוסיף הרשת גורמים לרקמות להידחס יתר על מדי במהלך החדרת המסך. אם זה קורה, פשוט רשום את הרקמה המרוסקת הזו, ואל תכלול את הדגימה מהניתוח הסופי. הדגירה את צלחת הרקמה באינקובטור ללא פחמן דו חמצני 37 מעלות לפחות 60 דקות.

תכנת את מנתח השטף התאי הנוסף באמצעות פקודות ערבוב, משקל, מדידה וחזרה. כדוגמה, ניסוי טיפוסי עם רקמת רשתית עשוי לכלול את הדברים הבאים. מערבבים שתי דקות, מחכים שתי דקות, ומודדים חמש דקות.

חזור על הניסוי עם שלושה שלבים אלה בין חמש לשמונה פעמים עבור הקלטת קו הבסיס, ולאחר הזרקה של כל תרכובת נבדק. לחץ על לחצן ההפעלה של התוכנית במנתח השטף החוץ-תאי ובצע את ההוראות המופיעות על המסך כדי להכניס את מחסנית החיישן לכיול. בסוף הכיול, בצע את ההוראות על המסך כדי להחליף את הלוח כיול עם הלוח המכיל את דגימות הרשתית, ולאחר מכן לאפשר לתוכנית לפעול כ מתוכנת.

בסיום הריצה, בצע את ההוראות על המסך כדי להוציא את לוחית הרקמה. הצג את תוצאות הריצה ואחסן את קובץ הנתונים. עם מחט מכופפת 20 מד ומדפים, להסיר את כל מוסיף רשת מן בארות, משאיר את אגרוף הרשתית מאחור.

בזהירות שאפו את המדיום מן הרקמה, ולשטוף את הרקמה פעמיים עם 0.5 מיליליטר של מלוחים פוספטים קרים. לאחר שאיפה לשטוף PBS השני, להוסיף 100 microliters של חיץ תמוגה לכל לשטוף, ואת פיפטה למעלה ולמטה כדי הומוגניזציה של רקמה. לבסוף, לכמת את רמות הקלט בהתבסס על תוכן ה-DNA כפול תקוע הכולל על ידי דילול דגימות lysed אחד לאחד, עם 100 microliters של מאגר טריס-EDTA, והעברת 100 microliters של המדגם מדולל לצלחת 96 היטב.

לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של מאגר זיהוי לכל באר ומערבבים במשך שתיים עד חמש דקות. לבסוף, לכמת את הצמחייה לאחר גירוש ב 480 ננומטר ו פליטה ב 520 ננומטר על ידי השוואה עקומה סטנדרטית. לנרמל את מעקב שטף חוץ תאי גלם לתוכן ה-DNA בתוך באר.

בקו הבסיס, בנוכחות חמישה מילי סוכר מולר בנוכחות 10 מילי מולר פירובט, אין הבדל משמעותי בשיעורי eflux חומצה, נמדד על ידי קצב חומציות חוץ תאית. בין רקמות רשתית מבעלי חיים מסוג wile, או לדפוק את העכברים כי חסרים את המכונות כדי לסגור תעלות יון מגודר נוקלאוטידים מחזוריים בתגובה לגירויים אור. דפוסים דומים נראים לאחר תוספת של 20 מילי סוכר מולר מעכבי גליקוליטי 2DG.

נתונים אלה עשויים להשתנות מתמטית כדי לייצג שינויים חלקיים מקו הבסיס, תבנית שעשויה לאפשר השוואה טובה יותר בין התערבויות ניסיוניות שונות. קצב צריכת חמצן מוחלט בבסיס גם שווה ערך בין שליטה לרקמת רשתית מוטנטית. תוספת של 20 מילי מולר גלוקוז מגביר את הנשימה המיטוכונדריאלית, אבל אין שינוי שנצפה בין קבוצות במונחים של כימות מוחלט או במונחים של שינוי מקו הבסיס.

התוספת של אחד מילי מולר FCCP, סוכן ניתוק, כדי להדגים שיעורי נשימה מיטוכונדריאליים מקסימלית אינה להגדיל באופן משמעותי OCR מעל לרמה לראות עם גלוקוז גבוה בשליטה רקמת רשתית מוטציה. עם זאת, אותות משני העכברים לרדת באופן דרסטי לאחר תוספת של קוקטייל RAA. לסיכום, אנו מדגימים טכניקה לכימות שיעורים של זרחון מחומצן וגליקוליזה במתפוצצים אורגנוטיים של רשתית העכבר.

עם בידוד יעיל של רקמת הרשתית, הטכניקה מניבה מדידות אמינות הניתנות לניתוב מחדש. השפעות בזמן אמת של חשיפות, כגון סוכנים בלתי מפרידים, ניתן להעריך. בנוסף להליך זה, שיטות אחרות, כמו RTPCR כמותי סופג המערבי, ניתן לבצע על הרקמה העודפת מבודד בשלב הניתוח כדי לקבל מידע מקביל רלוונטי למחקרים של חילוף החומרים ברשתית.