qKAT: Semi-automated כמותיים הקלדה של הרוצח-תא גנים קולטני דמוי נוגדן
6 במרץ 2019
תא הרג כמותיים קולטן דמוי אימונוגלובולינים (קיר) חצי אוטומטיות הקלדה (qKAT) היא שיטה פשוטה, תפוקה גבוהה וחסכונית להעתיק מספר גנים "קיר" סוג של היישום שלהם במחקרים האגודה האוכלוסייה ומחלות.
שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח על גנטיקה קולטן תא NK כגון מגוון haplotype וכיצד זה קשור למחלות. הדגמה חזותית של שיטה זו תסייע להגדיר את הפרוטוקול במעבדה שלך, כולל תהליך האוטומציה וניתוח הנתונים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם, שלא כמו שיטות קונבנציונליות, qKAT, אשר מייצג הקלדה אוטומטית KIR כמותית, הוא תפוקה גבוהה והוא מספק מספר עותק גנים.
qKAT יכול לספק תובנה על שיוך מחלות. ההשלכות של טכניקה זו יכולות להיות שימושיות לטיפול בזיהומים ויראליים כמו HIV והפטיטיס C, בסרטן, בהשתלת תאי גזע והפרעות הריון. qKAT יכול להיות מיושם גם בחקר גנטיקה האוכלוסייה, כמו גם לחקור ביטוי אינטראקציות תפקודיות בין מולקולות KIR ו HLA.
qKAT מורכב 10 תגובות מולטיפלקס כי במיוחד למקד exons של שני גנים KIR גן התייחסות אחד. בפרוטוקול זה, פריימרים ספציפיים נועדו לזהות את אללים של הגן נתון תוצאות PCR אמפילונים קצרים. לאחר מכן, בדיקות הידרוליזה ספציפיות עם תווית כפולה משמשות לניטור הגברה של PCR בזמן אמת.
ניתוח מספר העתקה משתמש לכמות יחסי של גנים KIR היעד לגן ייחוס. qKAT מתוכנן ומוגדר כטכניקת תפוקה גבוהה. לפיכך, כל תגובה יכולה להתבצע על קצת פחות מ 1, 000 דגימות.
השלבים הבאים מראים את השלבים הכרוכים בהכנה וציפוי מתוך כל צלחת DNA של 96 באר. כדי להתחיל, לאחר כימות ה-DNA, לדלל את ה-DNA בצלחת 96 היטב עמוק היטב. כלול דוגמת פקד אחת לפחות עם מספר עותק מוכר ופקד אחד שאינו של תבנית.
צנטריפוגה הצלחת ב 450 gs במשך שתי דקות. לאחר מכן, מחלקים כל דגימה ברביעייה לתוך 384 גם צלחות qPCR. לאחר מכן, האוויר מייבש את הדנ"א באזור נקי בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
כדי להגדיר תגובת qKAT אחת עבור 10 לוחות 384 באר, הראשון, להפשיר את מאגר qPCR, פריימר, ו aliquots בדיקה בארבע מעלות צלזיוס. הכינו את תערובת האב על הקרח בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, השתמשו בפיגט רב-ערוצי כדי להפיץ את תערובת המאסטר באופן שווה על פני צלחת עמוקה של 96 בארות.
לוותר על 9.5 microliters של תערובת האב לתוך כל באר של הצלחת עם דגימות gDNA מיובשות. לאחר מכן, לאטום את הצלחת עם נייר כסף ומיד לאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס. זכור לבצע שטיפת מים קצרה כדי לנקות את המחטים של מערכת הטיפול בנוזל אם מחלקים את תערובת האב על יותר מצלחת DNA אחת של 384 באר.
צנטריפוגה הצלחת עם דגימות gDNA ב 450 gs במשך שלוש דקות. לאחר מכן, הדגירה את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס כדי להשתמש שוב את ה-DNA ולפזר את כל בועות האוויר. לאחר הדגירה של הצלחת בן לילה, חזור על הצנטריפוגה כדי לפזר את כל בועות האוויר.
לאחר מכן, מניחים את הצלחת ברציף האחסון מקורר. חבר את מחשב ה- qPCR למטפל במיקרו-לוחית. לאחר מכן, תכנת את המטפל במיקרופלסטיק בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
לאחר השלמת הריצה, יש הרובוט לאסוף את הצלחת ממכונת qPCR ולמקום אותו ברציף להשליך. לאחר השלמת ההגברה, פתח את תוכנת qPCR. תחת הכרטיסיה נווט, פתח את קובץ ניסוי התגובה שנשמר עבור לוח.
לאחר מכן, פתח את החלון יצירת ניתוח חדש ובחר את ההגדרות המתאימות עבור פעולת השירות 2 Derivative Max. לאחר מכן בחרו 'מסרק סינון' ודאו שהנתונים שנאספו עבור STAT6 נבחרו. בחר את פיצוי הצבע המתאים.
לחץ על חשב ולאחר מכן לחץ על שמור קובץ. לניתוח הנתונים בעזרת השיטה Fit Points, פתחו את החלון 'צור ניתוח חדש' ובחרו בהגדרות המתאימות לפעולת השירות Fit Points. לאחר מכן, בחר את המסננים ופיצוי הצבע הנכונים עבור STAT6.
הגדר את רצועת הרעש כך שלא תכלול את רעשי הרקע. לאחר מכן, פתחו את הכרטיסיה 'ניתוח' והגדירו את נקודות התאמה לשלוש ובחרו 'הצג נקודות התאמה'. שמור שינויים וחזור על השלבים עם ההגדרות המתאימות עבור Fit Point וניתוח נגזרת שנייה עבור הגנים KIR.
פתח את הכרטיסיה נווט בתוכנת qPCR ובחר ייצוא אצווה תוצאות. לאחר מכן, פתח את התיקיה המכילה את קבצי הניסוי והעבר אותם לצד הימני של החלון. לחץ על הבא ובחר את השם והמיקום של קובץ הייצוא.
לאחר מכן, בחר את סוג הניתוח של עניין ולחץ על הבא. ודא ששמו של הקובץ, תיקיית הייצוא וסוג הניתוח נכונים לפני שתלחץ על הבא כדי להתחיל בתהליך הייצוא. כאשר מצב הייצוא ישתנה ל'אישור', המסך יעבור באופן אוטומטי לשלב הבא.
ודא שכל הקבצים שנבחרו יוצאו בהצלחה ולחץ על בוצע. לאחר מכן השתמש בקבצי ה- Script בפרוטוקול הטקסט כדי לפצל את הלוחות המיוצאים לתגובות בודדות ולהמיר את הקבצים לתוכנה הניתנת לקריאה על-ידי תוכנת ניתוח מספר העתקה. לאחר מכן, פתח את תוכנת ניתוח מספר ההעתקה ובחר יבא קובץ תוצאות PCR בזמן אמת כדי לטעון את קבצי הטקסט שנוצרו על-ידי קבצי ה- Script.
לבסוף, בחר נתח ונהל את הניתוח על-ידי בחירה במספר העותק לדוגמה השכיח ביותר. בפרוטוקול זה, הקלדה אוטומטית למחצה, או qKAT, שימשה להעתקת גנים KIR מסוג מספר. מספר העותק השכיח ביותר עבור KIR2DL4 היה שני עותקים בעוד שמספר העותק השכיח ביותר עבור KIR3DS1 היה אפס.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לוודא כי ה-DNA הוא כימת במדויק, כדי לנהל את כל השלבים על הקרח, ולוודא כי reagents מכוסים מן האור. חשוב גם לבצע בדיקות יסודיות על הנתונים הגולמיים עבור דגימות שאינן תואמות את הכללים הידועים LD עבור גנים KIR. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו רצף על מנת לענות על שאלות נוספות, למשל, נוכחות של גנים היתוך, או זיהוי של אללים הרומן.
לאחר התפתחותה, שיטה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונוגנטיקה לחקור את תפקידה של KIR בביולוגיה של תאי NK, עמידות למחלות ורבייה אנושית.
סקירה כללית
הטיפוס החצי-אוטומטי הכמותי של קולטנים דמויי אימונוגלובולין של תאי קטל (qKAT - quantitative killer cell immunoglobulin-like receptor typing) הוא שיטה בעלת תפוקה גבוהה לטיפוס של גני KIR. טכניקה זו מסייעת בהבנת הגנטיקה של קולטני תאי NK והשלכותיה במחלות שונות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונוגנטיקה
- גנטיקה של אוכלוסיות
- ביולוגיה של התא
רקע
- גנים מסוג KIR ממלאים תפקיד מכריע בתגובה החיסונית.
- הבנת השונות של ההפלוטיפים חשובה למחקרי קשר למחלות.
- שיטות קונבנציונליות הן לרוב בעלות תפוקה נמוכה ויקרות.
- שיטת qKAT מספקת מידע על מספר העותקים של הגן ביעילות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה בעלת תפוקה גבוהה לטיפוס גנטי של גני KIR.
- בחינת הקשר בין הגנטיקה של KIR לבין מחלות.
- סיוע למחקר בתחומי האימונוגנטיקה ומחקרי אוכלוסיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון פריימרים ספציפיים לזיהוי גני KIR.
- שימוש בתגובות מולטיפלקס המכוונות לגני KIR וגן ייחוס.
- שימוש ב-Real-time PCR לניטור השכפול.
- ניתוח נתונים באמצעות תוכנה ייעודית להערכת מספר העותקים.
תוצאות עיקריות
- qKAT יכול לעבד כמעט 1,000 דגימות בריצה אחת.
- זוהו מספרי העותקים השכיחים ביותר עבור KIR2DL4 ו-KIR3DS1.
- השיטה הוכיחה מהימנות בכימות מספרי העותקים של גני KIR.
- השיטה סייעה להמשך חקירה של תפקידם של גני KIR במחלות.
מסקנות
- qKAT הוא כלי בעל ערך עבור חוקרים בתחום האימונוגנטיקה.
- הוא משפר את ההבנה של תפקודי גני KIR במצב בריאות ובמחלה.
- ניתן להתאים את השיטה ליישומים שונים בגנטיקה של אוכלוסיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ביצוע גנוטיפיקציה מדויקת של לוקוסים פולימורפיים של רצפטורים חיסוניים, כגון KIR, הוא קריטי להפחתת סיכונים באימות מטרות (target validation) במחקרי אימונולוגיה והשתלה. שיטת qKAT מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של מספר עותקים בקרב קהלים רחבים, ובכך תומכת בתובנות מכניסטיות לגבי עמידות למחלות ותגובה טיפולית המתווכות על ידי תאי NK. יכולת זו מחזקת את הביטחון החזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי על ידי קישור וריאציה גנטית לתוצאות תפקודיות במודלים של מחלות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של וריאציות במספר העותקים של גן KIR כדי להבהיר את הגיוון ההפלוטיפי והשפעתו על תפקוד הקולטנים של תאי NK.
- ערך תפעולי: מספק גנוטיפינג חצי-אוטומטי בהספק גבוה, התואם לפורמטים של 96 ו-384 בארות, לצורך עיבוד דגימות ברמת קנה מידה משתנה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספק נתונים כמותיים וניתנים לשחזור של מספר העותקים עבור כל גני ה-KIR באמצעות multiplex real-time PCR עם גשים הידרוליטיים (hydrolysis probes).
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות נורמליזציה של גנים ייחוס ותהליכי ניתוח מוגדרים מראש (2nd Derivative Max, Fit Points).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על חקירת אינטראקציות KIR-HLA בהקשרי מחלות כגון זיהום נגיפי, סרטן והשתלה.
- ערך תפעולי: מייצר נתונים המעניקים מידע על ההפלוטיפ, הניתנים לשימוש בריצף המשך או במבחנים תפקודיים לגילוי אללים חדשים.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
qKAT משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות ועד לתיקוף פרה-קליני, במיוחד במקרים שבהם מנגנוני אפקטור חיסוניים משפיעים על היעילות הטיפולית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי קישור מספר העתקים של KIR לפעילות תאי NK בפנוטיפים הקשורים למחלה.
- סריקה: מאפשרת שימוש במערכות ביולוגיות מוכנות עם גנוטיפי KIR מוגדרים לסריקת תרכובות במודלים תלויי-מערכת חיסונית.
- אנליטיקה: מפיקה נתוני כימות יחסי המתאימים לקביעת מספר העתקים ולהשוואה סטטיסטית בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פרופיל גנטי להמשכיות פרה-קלינית במודלים של השחזה חיסונית או מחלת שתל נגד מאכסן.
- שימוש חוזר ארגוני: תוכננה כפלטפורמת גנוטיפיקה רב-פעמית שניתן ליישם בתיקי עבודה של אימונולוגיה, אונקולוגיה ובריאות הרבייה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות חיסוניות באמצעות פרופיל גנטי ברזולוציה גבוהה של לוקוסים פולימורפיים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות טיפול סטנדרטי בריאגנטים, הכנת תערובת מאסטר (master mix) בשרשרת קירור ועיבוד אוטומטי של פלטות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אפשורה של סטרטיפיקציה גנטית רחבה במחקרים בשלבים מוקדמים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכון על ידי זיהוי haplotypes של KIR הקשורים לתגובה דיפרנציאלית לטיפול.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהקמת real-time PCR, תכנון פריימרים/פרובים ותוכנה לניתוח מספר עותקים.
- תלוי במכשור qPCR התואם לפלטות של 384 בארות ובמטפלים במיקרופלטות (microplate handlers) לצורך אוטומציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של כימות DNA, עקביות בפיזור הפלטה ובקרות זיהום.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למודלים שאינם אנושיים או לגנים של ייחוס חלופיים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בכימות מדויק של DNA, ריאגנטים מוגנים מאור ובקרת איכות (QC) לנתוני גלם לצורך עמידה בכלל LD.
