זיהוי מבוסס על טסית דם של תחמוצת החנקן בדם על ידי מדידת זרחון VASP

פרוטוקול זה מטפל בשימוש הפוטנציאלי של טסיות דם כמו חיישן תחמוצת החנקן רגיש מאוד הן במבחנה והן ב vivo בתוך הדם. מוגברת זרחן Vasodilator-מגורה Phosphoprotein או P-VASP סרין 239 בתחמוצת החנקן טסיות יש כמה יתרונות, כולל היכולת לזהות את נוכחותו של תחמוצת החנקן בשושלת nanomolar. בתוך שעתיים של איסוף 30 עד 50 מיליליטר של דם שלם מתורם בריא, להוסיף חמישה aliquots מיליליטר של הדם למספר המתאים של צינורות חרוט 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה.

השתמש פיפטה העברת פלסטיק בזהירות לאסוף את הפלזמה עשיר טסיות מהחלק העליון של supernatants. גלולה טסיות דם עשירות בפלזמה עם צנטריפוגה שנייה בעדינות לשטוף את כדורי בחמישה מיליליטר של חיץ CGS. צנטריפוגה ב 400 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

בסוף הצנטריפוגה, תן שימוש חוזר כדורי בשלושה מיליליטר של חיץ טירוד שונה. השתמש hemocytometer לספירה ולהתאים את הצפיפות של מתלי טסיות הדם לשלוש פעמים 10 לתאים השמיני למיליליטר במאגר טירוד טרי. ואז להדגר את השעיות טסיות הדם במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.

בינתיים, לאסוף את תאי הדם האדומים משכבות פלזמה ללא צלחת של דגימות הדם כולו על ידי צנטריפוגה ואחריו ארבע שטיפות בחמישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, השליכו את העל-טבעיים וערבבו את תאי הדם האדומים עם מיליליטר אחד של טסיות הדם העשירות בפלזמה בהמטוקריט הניסיוני המתאים בבקבוקי פוליפרופילן סגורים עם פקקי גומי. הכנס מחט המחוברת למיכל גז הליום לתוך כל septa ולהכניס 26 מחטי מד כדי להפוך את שקעי גז.

ואז לאט מערבלים את הבקבוקים בטמפרטורת החדר ולהשתמש oximeter כדי למדוד את לחץ החמצן החלקי לניטור של תהליך ניוון. קצב ירידה בחמצן תלוי בקצב זרימת ההליום והמהירות המרגשת. לכן, הזמן של החמצון צריך להיות אופטימיזציה לפני תחילת ניסוי כמו זה תלוי מאוד על הגיאומטריה של ההתקנה הניסיונית.

להפחתת חנקן של תאי דם אדומים, השתמש במיקרו-זירינג כדי להזריק ניטריס דרך המחיצה לדגימות הנוונות של PRP ו- RBCs, כך שהושג ריכוז סופי של 10 מיקרומולרים. הדגירה את הדגימות לפחות 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולהעביר מיליליטר אחד של כל מדגם לתוך צינור microcentrifuge עבור צנטריפוגה. מעבירים 300 מיקרוליטרים של מתלי טסיות דם מהחלק העליון של העל-טבעיים לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים ומוסיפים חומצה ציטראט דקסטרוז לכל צינור ביחס של 1 עד 9.

צנטריפוגה טסיות הדם שוב resuspend כדורי ב 80 microliters של חיץ תמוגה קר קרח המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז שלוש לכל צינור. לאחר מכן, העמיסו 15 מיקרוגרם חלבון מכל דגימה לשני ג'לים נפרדים של 10%SDS-PAGE. הפעל את הג'לים ב 120 וולט במשך 1.3 שעות.

בסיום הריצה, מעבירים את הג'לים למברנות חנקן בודדות וחוסך כל כריכה לא ספציפית בנפח מתאים של 5% חלב יבש ללא שומן. הדגירה את הממברנות עם הנוגדנים העיקריים המתאימים לילה בארבע מעלות צלזיוס ואחריו תיוג עם נוגדן צנון סוס משני מתאים peroxidase במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לחשוף את הממברנות עם imager לכמת את צפיפות הלהקה עם תוכנית ניתוח תמונה מתאימה.

דגימות דם ארסיות בריאות יש ערכי לחץ חמצן חלקיים בין 50 ל 80 מילימטרים של כספית. ניוון על ידי הליום במהירות מקטין את הלחץ החלקי של חמצן ל 25 מילימטרים של כספית בתוך 10 דקות. ירידה נוספת של לחץ חמצן חלקי ניתן להשיג עם זמן ניוון מוגבר.

deoxygenation מוגברת מוביל רמות גבוהות של המוליזה כפי שצוין על ידי פלזמה צבע אדום יותר ויותר. זוהי השפעה של deoxygenation והוא לא נגרם על ידי ערבוב עצמו כפי שצוין על ידי חוסר המוליזה בדגימות עורר ללא הליום. הן Vasodilator-מגורה Phosphoprotein או VASP ו Phosphorylated-VASP רמות ביטוי טסיות דם ירד עם hematocrit הגדלת דגימות ניוון כפי שזוהה על ידי כתם מערבי.

טיפול עם תורם תחמוצת החנקן קצר ימים מגביר ביטוי פוספופרוטאין זרחן מגורה זרחן בתוך 10 שניות של טיפול. כמו כן, רמות של Phosphorylated-VASP או P-VASP נשאר יציב עד 10 דקות לאחר הדגירה של תורם NO עם פלזמה עשירה טסיות דם המציין כי יש מספיק זמן להפרדת RBCs טסיות דם מבלי להשפיע על רמות P-VASP הקיימות. ניטירה גם מגבירה את רמות ה-P-VASP של טסיות הדם בנוכחות RBCs מנוונים.

כאן היחס בין P-VASP ל- VASP הכולל תלוי ברמת ההמטוקריט. VASP מתבטא מאוד טסיות והוא זרחן במהירות בנוכחות תחמוצת החנקן. לכן, פרוטוקול זה מספק שיטה לחקר אינדוקציה של תחמוצת החנקן על ידי גירויים פיזיולוגיים שונים.

בשיטה זו, השתמשנו בהצלחה P-VASP מוגברת טסיות דם כסמן של גירוי תחמוצת החנקן על ידי שאיפת ניטריס ב vivo. אל תשכח כי עבודה עם טסיות דם עם דגימה ביולוגית תמיד צריך להתבצע באמצעות ציוד ההגנה האישי המתאים.