Name: זיהוי מבוסס על טסית דם של תחמוצת החנקן בדם על ידי מדידת זרחון VASP (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: למדו לזהות תחמוצת חנקן בדם באמצעות טסיות דם ומדידת זרחון VASP. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש במיוחד של NO ברמות ננומולריות במחקר ביוכימי והמטולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן על ידי מענק מגזר NIH ד ר אלן ש שכטר.

הערה: דגימות דם, התקבלו בנק הדם NIH (IRB אושר פרוטוקול: 99-CC-0168).
1. דם לטעום הכנה
הערה: כדי למנוע הפעלת טסיות דם, דם לאט ומערבבים בעדינות עם ציטראט על-ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים.
<ol><li>
טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) הכנה
	<ol>
<li>לצייר 30 – 50 מ"ל של דם באמצעות 20 גרם או מחט בקוטר גדול יותר ולהוסיף לתוך צינור המכילים סודיום ציטרט (3.8%) יחס 1:9 או דקסטרוז ציטראט חומצה (ACD) (ציטראט trisodium 85 מ מ, מ מ 66.6 חומצת לימון, גלוקוז 111 מ מ, pH 4.5) על יחס 1:6.</li>
		<li>Aliquot 5 מ של דם טרי שנאספו לתוך צינורות חרוט 15-mL ריק. צנטריפוגה דם מלא ב x 120 g 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>בזהירות לאסוף את תגובת שיקוע המכיל טסיות הדם (טסיות דם עשיר פלזמה, PRP) מן החלק העליון על ידי פיפטה העברת פלסטיק. הערה: PRP מהשלב 1.1.3 הוא מוכן לשימוש בניסויים או עיבוד נוסף כדי להכין שטף את טסיות הדם. בגדר רך שהושג לאחר צנטריפוגה (שלב 1.1.2) מכיל כדוריות דם אדומות, כדוריות לבנות, ניתן לטהר כדי לקבל שטף תאי דם אדומים (RBC) — ראה שלב 1.3. הניסוי צריך להסתיים בתוך שעתיים לאחר עד זוב דם. בעת איסוף PRP (supernatant), למנוע את האוסף של לויקוציטים באפי המכילות את המעיל, שנצבר על הממשק PRP/RBC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
טסית דם שטף הכנה (אופציונלי)
	<ol>
<li>צנטריפוגה אסף PRP ב x 400 g 10 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע ולשמור את כדורי טסיות.</li>
		<li>יש לשטוף בעדינות את כדורי על-ידי הוספת 5 מ של מאגר הרמטכ ל (120 מ"מ NaCl, גלוקוז ציטראט ו- 30 מ מ trisodium 12.9 מ"מ, pH 6.5), צנטריפוגה ב x 400 g 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>Resuspend כדורי טסיות 3 מ ל Tyrode שונה מאגר (134 מ מ NaCl, 0.34 ממ NaH2PO4, 2.9 מ"מ אשלגן כלורי, 12 מ מ NaHCO3, 20 מ מ. HEPES, מ מ 1 MgCl2, מ מ 2 CaCl2, 10 מ מ גלוקוז pH 7.4).</li>
		<li>לדלל טסיות הדם (בטחונות — לדוגמה, 10 µL של טסיות ב 990 µL של ריס-Ecker פתרון) עם פתרון Ecker ריס, מונה על-ידי hemocytometer.</li>
		<li>להתאים את הצפיפות של טסיות כדי 3 x 108 תאים למ"ל על-ידי הוספת Tyrode מאגר.</li>
		<li>דגירה ההשעיה טסיות ב 37 ° C עבור 1 h לפני תחילת הניסוי. הערה: טסיות דם שטף יציבים עבור 5-8 h ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנה של תאי דם אדומים (RBC) שטף
	<ol>
<li>אחרי האוסף, centrifuge בגדר רך שהושג בשלב 1.1.3 ב x 2,500 g 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר RBC 5 מ ל- PBS, על ידי צנטריפוגה ב x 2,500 g 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה עבור 3 פעמים.</li>
		<li>למחוק את PBS ולהשתמש RBCs שטף לניסויים נוספים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. deoxygenation
<ol><li>להוסיף 1 מ"ל של התערובת של PRP (מוכן בשלב 1.1.4. או 1.2.4.) ואת RBCs (מוכן ב- 1.3 צעד.)-המטוקריט הרצוי לתוך בקבוק פוליפרופילן סגור עם פקק גומי. לדוגמה, ב- 20% המטוקריט, להוסיף 200 µL של RBCs µL 800 של PRP. הערה: הציע hematocrits הם בין 0% עד 40%. אל תשתמש בקבוק זכוכית או הבקבוק כפי טסיות לדבוק משטח זכוכית.</li>
	<li>את המחט מחוברת מיכל גז הליום לתוך הבקבוק סגור ולעשות ששקע גז על ידי החדרת מחט 26 G (איור 1).</li>
	<li>אט-אט מערבולת מהבקבוק בטמפרטורת החדר. הערה: אל תאפשר גז הוא בועה דרך הדם הכנה. זרימת הגז איטי עדיפה עבור הליך זה, ומוביל זרימת הגז הוא מהיר בצורה מוגזמת המוליזה מוגברת. זרימת הגז היעילה ביותר צריך להיקבע על ידי משפט, כמו זה מאוד תלוי הגיאומטריה של ההתקנה ניסיוני.</li>
	<li>מעת לעת מבצעים תהליך deoxygenation על ידי מדידת הלחץ חמצן חלקית (pO2) באמצעות oximeter שיתוף. הערה: בידיים שלנו, 10 דקות של deoxygenation ירידות פו2 ל- 25 מ מ כספית אשר נדרש עבור הפחתת חנקיתי מאת RBCs. המשך deoxygenation לצמצם עוד יותר את פו2 עד 10 מ מ כספית; עם זאת, זה הוביל המוליזה מוגברת ומגדיל ללא תא המוגלובין (איור 2).</li>
</ol>3. תאי הדם האדומים חנקיתי הפחתת
<ol><li>להוסיף 1 מ"ל ל- PBS (pH 7.4) לתוך g 0.0345 של ננו2 להכין תמיסת חנקיתי מניות 500 מ מ. לדלל 500 מ מ NaNO2 250 מיקרומטר NaNO2 (25 x) על ידי דילול סדרתי ב- PBS (pH 7.4).</li>
	<li>שימוש של microsyringe, להזריק חנקיתי (40 µL) דרך מחצה לתוך דגימת דם לא מחומצן PRP ו RBCs להשגת ריכוז סופי של 10 מיקרומטר ב סה כ 1 מ של דגימה. הערה: בניסוי זה, ריכוזי חנקיתי המשמש הסופי הוא 10 מיקרומטר.</li>
	<li>דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או יותר. הערה: התאמת משך הדגירה RBC המדויק עם חנקיתי לצורך הפחתת חנקיתי מקסימלי עבור סוגים שונים של ניסויים.</li>
	<li>הסר את בסימפטומים ולא במחלה עצמה ואת פיפטה 1 מ"ל של המדגם לתוך צינור microcentrifuge.</li>
	<li>צנטריפוגה ב x 200 g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>פיפטה µL 300 של ההשעיה טסית דם מן החלק העליון של תגובת שיקוע, מערבבים עם ACD (pH 6.5) יחס של 1:9. להתעלם בגדר RBC.</li>
	<li>Centrifuge התליה טסיות ב x 500 g למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להוסיף µL 80 המאגר הקר פירוק (150 מ מ NaCl, 50 מ מ. טריס, 0.5% NP-40, pH 7.4) המכיל מעכבי פרוטאז גללים קוקטייל השלישי (שבערך) טסיות.</li>
</ol>4. סופג המערבי של VASP
<ol><li>לטעון µg 15 של החלבון מן כל מדגם 2 ג'לים מרחביות-דף נפרד של 10%. הערה: מאגר הפשטת קשים, אשר מכיל b-mercaptoethanol, לא יכול להסיר נוגדנים P-VASPSer239 ו VASP הקרום; לכן, P-VASP Ser239 ו VASP אמורה לפעול בנפרד.</li>
	<li>הפעל את ג'לים-120 V עבור 1.30 h והעברת למוח ניטרוצלולוזה.</li>
	<li>בלוק כריכת שאינם ספציפיים עם 5% שומן חלב יבש.</li>
	<li>דגירה הקרום עם P-VASPSer239 (שבערך), VASP (1:1, 000), GAPDH (1:1, 000) נלון ב 4 º C.</li>
	<li>דגירה חזרת peroxidase (HRP) נוגדנים משניים עם קרום למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לחשוף את הקרום עם מכונת imager ולכמת את צפיפות הלהקה באמצעות ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reaction+between+nitrite+and+deoxyhemoglobin.+Reassessment+of+reaction+kinetics+and+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).</li>
<li>Cosby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reduction+to+nitric+oxide+by+deoxyhemoglobin+vasodilates+the+human+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).</li>
<li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide%2FcGMP%2Fphosphodiesterase-5+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).</li>
<li>Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+nitrite+on+coagulation+processes+demonstrated+by+thromboelastography%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography.</a> Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).</li>
<li>Wajih, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+red+blood+cell+S-nitrosation+in+nitrite+bioactivation+and+its+modulation+by+leucine+and+glycose%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose.</a> Redox Biology. 8, 415-421 (2016).</li>
<li>Akrawinthawong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+analysis+of+the+inhibition+of+platelet+reactivity+due+to+nitrite+reduction+by+deoxygenated+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 9 (3), e92435(2014).</li>
<li>Friebe, A., Koesling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nitric+oxide-sensitive+guanylyl+cyclase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase.</a> Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).</li>
<li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+inhibition+by+nitrite+is+dependent+on+erythrocytes+and+deoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation.</a> PLoS One. 7 (1), e30380(2012).</li>
<li>Smolenski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+regulation+of+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+serine+239+phosphorylation+in+vitro+and+in+intact+cells+using+a+phosphospecific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).</li>
<li>Burkhart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+comprehensive+and+quantitative+analysis+of+human+platelet+protein+composition+allows+the+comparative+analysis+of+structural+and+functional+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways.</a> Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).</li>
<li>Parakaw, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+inhibition+and+increased+phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+following+sodium+nitrite+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+oxide%22%5BJournal%5D)">Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation.</a> Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).</li>
<li>Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+vasodilator-stimulated+phosphoprotein+%28P-VASPSer239%29+in+platelets+is+increased+by+nitrite+and+partially+deoxygenated+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes.</a> PLoS One. 13 (3), e0193747(2018).</li>
<li>Mal Cortese-Krott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+soluble+guanylate+cyclase+in+RBCs%3A+preserved+activity+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease.</a> Redox Biology. 14, 328-337 (2018).</li>
<li>Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+the+focal+adhesion+protein+VASP+in+vitro+and+in+intact+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letter%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets.</a> FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).</li>
</ol>

ד ר אלן שכטר מופיע בתור ממציא שיתוף על מספר הפטנטים להנפיק את מכוני הבריאות הלאומיים לשימוש של מלחי חנקיתי לטיפול במחלות לב וכלי דם. הוא מקבל תמלוגים על סמך NIH רישוי פטנטים אלו עבור הפיתוח הקליני אבל אין פיצויים אחרים.

מאז טסיות מופעלים בקלות, עדין טיפול של טסית דם המכילים דוגמאות נדרש. יש להימנע pipetting מהר, ומנענע נמרצת. מעכבי טסיות כגון prostacyclin (PGI2) יכול לשמש כדי למנוע הפעלה טסית דם; עם זאת, זה עלול להשפיע על איזה איתות המסלולים בתוך טסיות הדם. עבור הכנת כדורי טסיות, אנו להוסיף ACD המתלים טסיות ולהשתמש נמוך מהירות צנטריפוגה.
טסיות הדם הטרי ב PRP יש חיים מוגבל להתפרס, עד 2 שעות. כדי להשיג הפארמצבטית גבוהה, כל הניסויים צריך להיעשות רק עם טסיות דם טרי ובתוך שעתיים לאחר איסוף דם. הנתונים ש...

הטסיות הן שברי תאים קטנים בצורת דיסק נגזר megakaryocytes כי הם חיוניים קרישת הדם. המפל קרישת דם הוא שיזם מולקולות ביו שונים (כגון קולגן או ADP), שוחרר לאחר פציעתו של קיר כלי הדם. תהליך קרישת הדם יכול להיות שונה, בין effectors השונים על ידי תחמוצת החנקן (NO). . לא, באופן טבעי המיוצר על ידי תאי יונקים, הוא אחד המגוונים ביותר אותות פיזיולוגיים. היא פועלת vasodilator חזק, מוליך עצבי, אפנן המערכת החיסונית, שם כמה הפונקציות הרבות שלה. בכלי הדם, לא גם מסייע לווסת את היקף קרישת הדם על ידי עיכוב הצטברות של טסיות דם. אחד המקורות סביר ביותר לא במחזור הדם הוא חנקיתי, יון אנאורגניים זה הוכח להוות סימן מקדים של מס מגיבה עם כדוריות דם אדומות (RBCs) חנקיתי מופחתת ללא, deoxyHb תחמוצת methemoglobin (metHb)1. לא שוחררו RBCs הוא vasoactive וגורם vasorelaxation2. מסלול זה הפחתת חנקיתי הוא תוכנית חלופית אין מסלול הדור, מתנהג יחד עם ו משלימים קלאסית אין שביל דור על ידי סינתאז תחמוצת החנקן אנדותל-תנאים ובשפתיים.
טסיות הדם עצמם אינם מסוגלים להפחית חנקיתי לתוך לא אבל רגישים מאוד את נוכחותה. בטסיות תקין, לא ב- nanomolar טווח מגדילה cGMP (EC50 = 10 ננומטר), זירחון של VASP (EC50 = 0.5 ננומטר)3. לכן, טסיות עשויים לשמש חיישן מעולה של הפחתת חנקיתי RBCs, אין שחרור לדם. ישנן מספר שיטות שבהן באפשרותך למדוד ישירות את היקף ההפעלה טסיות - כגון aggregometry ו- thromboelastography (TEG)4,5. עם זאת, שיטות אלה דורשים יקר במכשור מיוחד, כמויות די גדולות של חומר. זה גם אפשרי לעקוב אחר אירועים במורד הזרם, לאחר לא הוא שוחרר מן RBCs, באמצעות השינויים בביטוי חלבונים משטח טסיות – כגון בחירת שמלות P6. לא ידוע גם להגדיל את כמות cGMP ב טסיות הדם7. בעבר, היינו cGMP לפקח אין שחרור לתוך הדם לאחר הפחתה חנקיתי מאת RBC רווית8. זה הוכיח להיות שיטה מאוד רגיש; עם זאת, cGMP הוא מולקולה קצרת ימים, זיהוי שלו כרוכה עבודה נרחב. אפשרות נוספת, שמתואר פרוטוקול שהוצגו, משתמשת זירחון של פוספו מגורה מרחיב כלי דם (VASP)-חלבון כדי לזהות הנוכחות של NO בדם. VASP הוא מצע של הפעלת קינאז גרם חלבון, אשר הוא phosphorylated על האינטראקציה עם לא דרך הסטארגייט/cGMP מסלול9. זרחון VASP לזיהוי מתרחשת ללא נמוך מאוד ריכוזי, שעלולה לגרום טסיות גלאי רגיש מאוד אין נוכחות בדם. VASP מתבטאת מאוד טסיות, אך לא בתאים אחרים בדם, מה שמאפשר לעקוב באופן סלקטיבי את האירועים הקשורים טסיות10.
המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לתאר את שיטת בפירוט עבור זיהוי אין שחרור בדם כל שימוש ביחסיו עם טסיות דם על-ידי ניטור VASP זרחון11,12. השיטה המתוארת מאפשרת גילוי מוקדם של נמוך אין ריכוזים - תיאורטית בטווח nanomolar מה שהופך את הפרוטוקול הנוכחי רגיש יותר נחישות cGMP, עקב השימוש של טכניקות תספיג סטנדרטי השגה במעבדה רוב הגדרות.

<table><tbody><tr>אספקת <td>תלת-נתרן ציטראט</td><td>על ידי בנק</td><td></td><td></td>הדם של NIH</tr><tr>אספקת<td>חומצת לימון</td><td>על ידי בנק</td><td></td><td></td>הדם של NIH</tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl; נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>S-7653 1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4; נתרן פוספט מונו-בסיסי, מונוהידראט</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>KCl; אשלגן כלורי</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3; נתרן ביקרבונט</td><td>Mallinckrodt Chemical</td><td>7412-12</td><td></td></tr><tr><td>HEPES; N-[2-הידרוקסיאתיל]פיפרזין-N'-[-חומצה אתנסולפונית]</td><td>סיגמא</td><td>H3375-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (1 M); מגנזיום כלוריד</td><td>איכות ביולוגיה</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2; סידן כלורי</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene בקבוקי HDPE חסכוניים צרי פה</td><td>Nalgene</td><td>2089-0001</td><td></td></tr><tr><td>מחיצה אדומה פקק מס' 29</td><td>פישרברנד</td><td>FB57877</td><td></td></tr><tr><td>NaNO2-; נתרן ניטריט</td><td>Sigma</td><td>S2252-500G</td><td></td></tr><tr><td>בסיס TRIZMA; Tris[hydroxymethyl]aminomethane</td><td>Sigma</td><td>T8524-250G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma</td><td>74385-1L</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז סט קוקטייל III</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-VASP (Ser239) נוגדן</td> טכנולוגיית <td>איתות תאים</td><td>3114</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן VASP</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>3112</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-6250-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td> <td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060-200 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>קו-אוקסימטר (ABL 90 flex)</td><td>רדיומטר</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי מבוסס על טסית דם של תחמוצת החנקן בדם על ידי מדידת זרחון vasp

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

הטסיות הן רכיבי הדם אחראי על קרישת הדם תקין. תפקידם הוא מאוד מווסתות על ידי מסלולים שונים. אחד הסוכנים vasoactive הקטלניים ביותר, תחמוצת החנקן (NO), יכול גם לפעול מעכב חזק של הצטברות של טסיות דם. ישיר אין זיהוי בדם הוא מאוד מאתגר עקב שלה תגובתיות גבוהה עם המוגלובין ללא תא המגביל מחצית אין חיים על הטווח אלפיות השנייה. כיום, אין שינויים לאחר התערבויות מוערכות רק בהתבסס על שינויים מדודה של חנקיתי חנקתי (חברים של מסלול מטבולי חנקת-חנקיתי-לא). עם זאת מדויק, מדידות אלה הם די קשה לפרש מול בפועל ללא שינויים, עקב חנקיתי בסיסית גבוהה באופן טבעי טונות רמות שנמצאים במספר סדרי גודל גבוה יותר מאשר שינויים צפויים לא עצמו. לכן, בפיתוח שיטות ישירה ופשוטה שתאפשר אחד לזהות לא ישירות הוא מזמן. פרוטוקול זה מטפל שימוש פוטנציאלי של טסיות כמו רגישות גבוהה לא חיישן בדם. זה מתאר פלזמה עשיר טסיות הראשונית (PRP) ואת ההכנות טסיות שטף את השימוש חנקיתי רווית תאי דם אדומים גנרטורים אין. זירחון של VASP-סרין 239 (P-VASPSer239) משמש כדי לזהות הנוכחות של מס העובדה כי חלבון VASP מתבטאת מאוד טסיות הדם, כי זה הוא במהירות phosphorylated כאשר לא קיים מוביל הזדמנות ייחודית לשימוש מסלול זה ישירות לאתר בו שום נוכחות בדם.

דגימות דם ורידי יש פו2 ערכים בין 50-80 מ מ כספית. Deoxygenation על ידי הליום יורדת במהירות פו2 ל- 25 מ מ כספית בתוך 10 דקות הגדילו deoxygenation-זמן פו ובירידות מעט יותר2. עם זאת, זמן מוגברת של deoxygenation גם מוביל רמות גבוהות באופן משמעותי של המוגלובין ללא תא (שנקבע על ידי Oximeter שיתוף, מבחינה ויזואלית לראות על איור 2 מוספים יותר ויותר אדומה פלזמה) (איור 2 א-ב). המוליזה מוגבר...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לטפל להשתמש הפוטנציאל של טסיות דם כמו חיישן רגיש מאוד תחמוצת החנקן בדם. זה מתאר טסיות הראשונית הכנה ושימוש חנקיתי ו רווית תאי דם אדומים גנרטורים תחמוצת החנקן.

זיהוי מבוסס על טסית דם של תחמוצת החנקן בדם על ידי מדידת זרחון VASP

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

פרוטוקול זה מטפל בשימוש הפוטנציאלי של טסיות דם כמו חיישן תחמוצת החנקן רגיש מאוד הן במבחנה והן ב vivo בתוך הדם. מוגברת זרחן Vasodilator-מגורה Phosphoprotein או P-VASP סרין 239 בתחמוצת החנקן טסיות יש כמה יתרונות, כולל היכולת לזהות את נוכחותו של תחמוצת החנקן בשושלת nanomolar. בתוך שעתיים של איסוף 30 עד 50 מיליליטר של דם שלם מתורם בריא, להוסיף חמישה aliquots מיליליטר של הדם למספר המתאים של צינורות חרוט 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה.השתמש פיפטה העברת פלסטיק בזהירות לאסוף את הפלזמה עשיר טסיות מהחלק העליון של supernatants. גלולה טסיות דם עשירות בפלזמה עם צנטריפוגה שנייה בעדינות לשטוף את כדורי בחמישה מיליליטר של חיץ CGS. צנטריפוגה ב 400 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הצנטריפוגה, תן שימוש חוזר כדורי בשלושה מיליליטר של חיץ טירוד שונה. השתמש hemocytometer לספירה ולהתאים את הצפיפות של מתלי טסיות הדם לשלוש פעמים 10 לתאים השמיני למיליליטר במאגר טירוד טרי. ואז להדגר את השעיות טסיות הדם במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.בינתיים, לאסוף את תאי הדם האדומים משכבות פלזמה ללא צלחת של דגימות הדם כולו על ידי צנטריפוגה ואחריו ארבע שטיפות בחמישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, השליכו את העל-טבעיים וערבבו את תאי הדם האדומים עם מיליליטר אחד של טסיות הדם העשירות בפלזמה בהמטוקריט הניסיוני המתאים בבקבוקי פוליפרופילן סגורים עם פקקי גומי. הכנס מחט המחוברת למיכל גז הליום לתוך כל septa ולהכניס 26 מחטי מד כדי להפוך את שקעי גז.ואז לאט מערבלים את הבקבוקים בטמפרטורת החדר ולהשתמש oximeter כדי למדוד את לחץ החמצן החלקי לניטור של תהליך ניוון. קצב ירידה בחמצן תלוי בקצב זרימת ההליום והמהירות המרגשת. לכן, הזמן של החמצון צריך להיות אופטימיזציה לפני תחילת ניסוי כמו זה תלוי מאוד על הגיאומטריה של ההתקנה הניסיונית.להפחתת חנקן של תאי דם אדומים, השתמש במיקרו-זירינג כדי להזריק ניטריס דרך המחיצה לדגימות הנוונות של PRP ו- RBCs, כך שהושג ריכוז סופי של 10 מיקרומולרים. הדגירה את הדגימות לפחות 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולהעביר מיליליטר אחד של כל מדגם לתוך צינור microcentrifuge עבור צנטריפוגה. מעבירים 300 מיקרוליטרים של מתלי טסיות דם מהחלק העליון של העל-טבעיים לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים ומוסיפים חומצה ציטראט דקסטרוז לכל צינור ביחס של 1 עד 9.צנטריפוגה טסיות הדם שוב resuspend כדורי ב 80 microliters של חיץ תמוגה קר קרח המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז שלוש לכל צינור. לאחר מכן, העמיסו 15 מיקרוגרם חלבון מכל דגימה לשני ג'לים נפרדים של 10%SDS-PAGE. הפעל את הג'לים ב 120 וולט במשך 1.3 שעות.בסיום הריצה, מעבירים את הג'לים למברנות חנקן בודדות וחוסך כל כריכה לא ספציפית בנפח מתאים של 5% חלב יבש ללא שומן. הדגירה את הממברנות עם הנוגדנים העיקריים המתאימים לילה בארבע מעלות צלזיוס ואחריו תיוג עם נוגדן צנון סוס משני מתאים peroxidase במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לחשוף את הממברנות עם imager לכמת את צפיפות הלהקה עם תוכנית ניתוח תמונה מתאימה.דגימות דם ארסיות בריאות יש ערכי לחץ חמצן חלקיים בין 50 ל 80 מילימטרים של כספית. ניוון על ידי הליום במהירות מקטין את הלחץ החלקי של חמצן ל 25 מילימטרים של כספית בתוך 10 דקות. ירידה נוספת של לחץ חמצן חלקי ניתן להשיג עם זמן ניוון מוגבר.deoxygenation מוגברת מוביל רמות גבוהות של המוליזה כפי שצוין על ידי פלזמה צבע אדום יותר ויותר. זוהי השפעה של deoxygenation והוא לא נגרם על ידי ערבוב עצמו כפי שצוין על ידי חוסר המוליזה בדגימות עורר ללא הליום. הן Vasodilator-מגורה Phosphoprotein או VASP ו Phosphorylated-VASP רמות ביטוי טסיות דם ירד עם hematocrit הגדלת דגימות ניוון כפי שזוהה על ידי כתם מערבי.טיפול עם תורם תחמוצת החנקן קצר ימים מגביר ביטוי פוספופרוטאין זרחן מגורה זרחן בתוך 10 שניות של טיפול. כמו כן, רמות של Phosphorylated-VASP או P-VASP נשאר יציב עד 10 דקות לאחר הדגירה של תורם NO עם פלזמה עשירה טסיות דם המציין כי יש מספיק זמן להפרדת RBCs טסיות דם מבלי להשפיע על רמות P-VASP הקיימות. ניטירה גם מגבירה את רמות ה-P-VASP של טסיות הדם בנוכחות RBCs מנוונים.כאן היחס בין P-VASP ל- VASP הכולל תלוי ברמת ההמטוקריט. VASP מתבטא מאוד טסיות והוא זרחן במהירות בנוכחות תחמוצת החנקן. לכן, פרוטוקול זה מספק שיטה לחקר אינדוקציה של תחמוצת החנקן על ידי גירויים פיזיולוגיים שונים.בשיטה זו, השתמשנו בהצלחה P-VASP מוגברת טסיות דם כסמן של גירוי תחמוצת החנקן על ידי שאיפת ניטריס ב vivo. אל תשכח כי עבודה עם טסיות דם עם דגימה ביולוגית תמיד צריך להתבצע באמצעות ציוד ההגנה האישי המתאים.

platelet-based-detection-nitric-oxide-blood-measuring-vasp

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הליך פולשני להערכת תפקוד האנדותל הוא הוכיח באמצעות Endo-PAT 2000.

הערכת תפקוד האנדותל vasodilator עם 2000 Endo-PAT

ייצור אנדוגני של תחמוצת החנקן (NO) מסדיר מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים. מתברר יותר ויותר כי שיבוש או dysregulation של איתות NO מבוסס מעורב מחלות אנושיות רבות. שיטות לכמת רלוונטי מטבוליטים אינו רשאי לספק סמנים ביולוגיים מנבא אבחון או הרומן של מחלות אנושיות.

טכניקות אנליטיות עבור assaying bioactivity תחמוצת החנקן

תפקוד תאי כלי הדם תלוי בפעילות של שליחים תוך-תאיים.  מתוארת כאן שיטת הדמיית שני פוטונים ex vivo המאפשרת מדידה של רמות סידן ותחמוצת החנקן התוך תאיות בתגובה לגירויים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים בתאי אנדותל ושריר חלק בודדים של אבי העורקים המבודד.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

במאמר זה נתאר שיטה קלה מותאמת יחסית באמצעות צבע פלואורסצנטי diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2da) ו dihydroethidium (DHE) לגילוי סימולטני אן-פאס וויזואליזציה של תחמוצת חנקן תאית (NO) אניון סופראוקסיד (O 2 .- ) בהתאמה, טרי מבודד aortas השלם של מודל עכבר להשמנה.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לאיתור תחמוצת החנקן ונגזרותיה הרלוונטיות מבחינה ביולוגית באמצעות מבחנים מבוססי כימילומינסנציה בעלי רגישות גבוהה.

מבחנים מבוססי כימילומינסנציה לזיהוי תחמוצת החנקן ונגזרותיה מאוטוקידציה ותרכובות ניטרוסטיות

לכידת שינויים דינמיים בהפעלת החלבונים של תאי דם אדומים מעוררים אתגרים מתודולוגיים, כמו שימור שינויים דינמיים לגירויים חריפים לצורך הערכה מאוחרת יותר. הפרוטוקול המוצג מתאר טכניקות הכנת דגימה וצביעה המאפשרות שימור וניתוח של שינויי חלבון רלוונטיים וזיהוי לאחר מכן.

זיהוי מבוסס חיסונים של שינויים דינמיים בחלבוני תאי דם אדומים

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). אנו מספקים גם שיטות מפורטות לייצור לחץ גזירה ומתיחה כדי לחקור לחץ מכני ב- hSVECs.

בידוד תאי אנדותל של וריד ספנוס אנושי וחשיפה לרמות מבוקרות של לחץ גזירה ומתיחה

הדור של אניון סופראוקסיד חיוני לגירוי טסיות הדם, ואם אינו מוסדר, קריטי למחלות טרומבוטיות. כאן, אנו מציגים שלושה פרוטוקולים לזיהוי סלקטיבי של אניונים סופראוקסידים ולחקר ויסות טסיות תלוי חיזור.

שיטות חלופיות לאיתור ייצור אניון סופראוקסיד בטסיות הדם 

מסופק פרוטוקול מפורט להדמיית טסיות נודדות בודדות באמצעות קשירה של אבידין-ביוטין מתפקדת RGD עם צפיפות ניתנת לכוונון, וחושף כי טסיות הדם מייצרות מספיק כוח כדי לקרוע את הקשר אבידין-ביוטין.

מבחן במבחנה לחקר נדידת טסיות הדם באמצעות קשירה של אבידין-ביוטין מתפקדת RGD

היווצרות טסיות דם מעודדות נקשרה עם סיכון מוגבר לפקקת. מוצג כאן פרוטוקול מדויק לבידוד טסיות דם שטופות מדם אדם, שנועד לכמת את החשיפה של פוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית, שהם מאפיינים ייחודיים של טסיות מעודדות.

אפיון טסיות מעודדות קרישה על ידי מדידת חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מטסיות אדם מטוהרות

פרוטוקול זה מתאר את מבחן ניימכן המוסטזיס, המאפשר מדידה סימולטנית ובזמן של יצירת טרומבין ופלסמין כדי לספק הערכה משולבת של קרישה ופיברינוליזה. המבחן שואף לשפר את אפיון האיזון ההמוסטאטי במחקרים ובהקשרים קליניים, מעבר להיקף הבדיקות המוסטטיות המקובלות.

בדיקת ניימכן המוסטזיס: מדידה פלואורוגנית סימולטנית של יצירת תרומבין ופלסמין בבאר אחת

למדו לזהות תחמוצת חנקן בדם באמצעות טסיות דם ומדידת זרחון VASP. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש במיוחד של NO ברמות ננומולריות במחקר ביוכימי והמטולוגי.

זיהוי מבוסס על טסית דם של תחמוצת החנקן בדם על ידי מדידת זרחון VASP

גלה סרטונים נוספים