טיהור של H3, H4 חלבוני היסטון, כימות של סימני היסטון Acetylated תאים ורקמות המוח
30 בנובמבר 2018
מטרת מאמר זה היא לספק מדריך מקיף, שיטתית של טיהור יעיל של שינויים היסטוניים H3 ו- H4, כימות של שאריות היסטון acetylated.
שיטה זו מאפשרת כימות מדויק של היסטון הליבה H3 ו- H4 ושינויים שלאחר התרגום שלהם מתמציות תאים ורקמות וכתוצאה מכך מוביל לדור של תוצאות איכותיות, לשחזור. לטכניקה המוצגת שלושה יתרונות עיקריים. ראשית, הוא משמר שינויים ילידיים שלאחר התרגום של היסטון.
שנית, הוא עוקף שיטות תפוקה נמוכה יקרות. לבסוף, הוא תואם באופן מלא עם יישומי תפוקה בינונית במורד הזרם. הפגנת ההליך תהיה קרולינה Janczura סטודנט מוכשר לתואר שני מהמעבדה שלי אשר אופטימיזציה מלאה של פרוטוקול זה ועסק בטכניקה כדי לענות על שאלות חשובות לגבי ויסות אפיגנטי במחלת אלצהיימר.
כדי להתחיל צלחת התאים ב 10 ס"מ רקמת רקמות שטופלו במנות עם התקשורת המתאימה לתרבות התאים על פי פרוטוקול הטקסט. אפשר לתאים לגדול עד שהם מגיעים כ 90%confluency. לאחר התאים הגיעו הקונפדרציה הרצויה בעדינות לקדם את התקשורת התרבותית ולשטוף את התאים פעמיים עם מדיה מראש ללא סרום.
לאחר מכן, הסר את המדיה ללא סרום מהתאים והצב את הכלים באורך 10 ס"מ על קרח. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ מיצוי קר כקרח לכל מנה. באמצעות מגרד תא פלסטיק לאסוף את התאים במאגר החילוץ ולהעביר אותם צינור שכותרתו 1.5 מיליליטר.
ואז למקם את הצינורות על קרח. אם נעשה שימוש ברקמה קפואה, מניחים את הרקמה בצינור מקורר מראש של 1.5 מיליליטר ומפשירים אותה לזמן קצר על קרח. הבא הומוגניזציה רקמת המוח עם homogenizer כף יד באמצעות הכמות המומלצת של חיץ החילוץ ומספר שבץ.
הומוגניזציה הושלמה כאשר אין שברי רקמה גלויים והפתרון מקבל מראה חלבי. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה חד-ערוצית 1, 000 מיקרוליטר כדי להעביר את ההומוגנט לצינור 1.5 מיליליטר מקורר מראש ולה מניחים את הצינורות על קרח. מניחים את הצינור המכיל את lysates התא רקמת המוח הומוגנית על פלטפורמה מסתובבת מסתובב ב 15 RPMs בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור במהירות מקסימלית במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן להעביר את supernatant לצינור חדש מקורר מראש 1.5 מיליליטר ולהשליך את גלולה. לאחר מכן לנטרל את ההיסטון עם 1/4 נפח של חיץ נטרול, ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה.
השתמש פסי pH כדי לבדוק את ה- pH של התערובת, ולהתאים עוד יותר את ה- pH עם מאגר נטרול במידת הצורך. אם היסטון חומצי אינם מנוטרל במהלך שלב זה, הם לא ייקשרו כראוי לממברנה של העמוד, יעברו דרכו ויגלו בזרימה. הוסף 37.5 מיקרוליטרים של המדגם ל-12.5 מיקרוליטרים של מאגר מדגם.
לאחר צנטריפוגה קצרה denature את התערובת ב 99 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, מניחים את הצינורות על קרח ומסובבים אותם לזמן קצר כדי לאסוף עיבוי. טוענים את הדגימה על ג'ל SDS-PAGE ו מפעילים את הג'ל ב-100 וולט למשך שעה.
ואז להכתים את הג'ל לילה. ולתעב אותו במהלך שלוש שטיפות רצופות. ראשית להוסיף 500 microliters של מאגר שיווי משקל לכל עמודת ספין.
צנטריפוגה הטור במשך שלוש דקות. השלך את הזרימה דרך ולחזור צנטריפוגה עוד פעם אחת. לאחר מכן להוסיף 500 microliters של המדגם לעמודה.
צנטריפוגה העמוד במשך שלוש דקות ולאסוף את הזרימה דרך. לאחר מכן נתח את זרימת העמודה כפי שתואר קודם לכן. הוסף 500 microliters של מאגר לשטוף לעמודה.
צנטריפוגה העמוד במשך שלוש דקות ולאסוף את הזרימה דרך. העבר את העמודה לצינור חדש שכותרתו 1.5 מיליליטר. הוסף 50 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון אבן לעמודה.
לאחר צנטריפוגה של העמודה, שמרו את הזרימה המכילה חלבוני היסטון. מתחת למכסה המנוע הכימי מוסיפים חומצה פרכלורית להיסטונים המטוהרים כדי להשיג ריכוז סופי של 4% חומצה פרכלורית. פיפטה למעלה ולמטה שש פעמים לערבב.
אם ההיסטונים בדגימה מרוכזים מאוד, הפתרון יהיה מעונן לאחר תוספת של חומצה פרכלורית. לאחר מכן, דגירה הצינור בארבע מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. אם משקעים אבן לילה מוצלח, גלולה לבנה קטנה תהיה גלויה בתחתית הבקבוקון לאחר צעד הצנטריפוגה.
בעת שטיפת גלולה בשלבים רצופים להבטיח את גלולה לא מופרע כפי שהוא יכול בקלות להתנתק מתחתית הבקבוקון. למחרת צנטריפוגה הדגימות במשך 75 דקות בצינורות מיקרוצנטריפוגה מצוננים מראש. בזהירות שאפו את העל-טבעי והוסיפו 500 מיקרוליטרים של חומצה פרכלורית קרה כקרח לדגימה המוגלתית.
לאחר צנטריפוגה המדגם במשך 10 דקות במהירות המרבית, שאף את העל-טבעי. הוסף 500 microliters של אצטון קר כקרח לדגימה דואג לא להפריע גלולה. לאחר מכן להסיר את supernatant ולאפשר את הצינורות להתייבש uncapped על קרח במשך 30 דקות.
לאחר מכן להסיר את הצינורות מן הקרח ולאפשר את המדגם להתייבש בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר גלולה יבשה resuspend אותו 30 microliters של מים סטריליים. מכסים את הצינורות ומאפשרים להיסטונים להתקוות מחדש על קרח למשך 30 עד 50 דקות.
לאחר בדיקה כי גלולה הוא resuspended, לסכם את הצינורות ולהסיר אותם מן הקרח. בפרוטוקול זה היסטון מתאים BV-2 מיקרוגליאלי אנושי טוהרו הרכב התמצית נותח. הג'ל המוכתם מדגים כי זמני החילוץ בין 15 דקות ל -24 שעות לא השפיעו על ההרכב הכולל של תמציות היסטון הגולמיות.
היעילות של כריכת אבן למטריצת העמוד נותחה באמצעות הכתמת הג'ל. יעילות העמודה הייתה כ-100% כפי שממדה היעדר חלבוני אבן-יסוד הניתנים לגילוי בזרימה של העמודה. ללא קשר למשך זמן החילוץ, כלומר.
15 דקות, שעתיים או 24 שעות. שטיפה בעמודה הראשונה מבטלת את הכמות הגדולה ביותר של חלבונים שאינם היסטון מהתמצית. שברי חלבון היסטון מטוהרים מהקבוצה מיצוי 24 שעות ביממה הכילו יותר היסטון H3 ו H4 בהשוואה 15 דקות ושתי שעות החילוץ.
אלוטיון העמודה הראשונה היה יעיל בכ-100%, כפי שמץ של היעדר חלבוני היסטון באלואט השני. לאחר מכן הוצאו היסטון גולמיים ממוח עכבר שלם ונמדדו שינויים שלאחר התרגום. בתגובה מעכבי HADC הפועל באופן נרחב, tributyrin, H4K12 אצטילציה מוגברת בתמצית.
עם זאת, הספציפיות של הנוגדן פחתה בשל נוכחות של זיהומים בתמצית הגולמית. פרוטוקול טיהור היסטון הושלם עם קליפת המוח הקדם-מצחית של עכברי A/D מהודקים משולשים שטופלו במעכבי Class I ו- IIb HDAC, M344, ושבר אבן הליבה הטהור היחיד הוערך לשינויים באצטילציה H4K12. סה"כ היסטון זוהו עלייה משמעותית של אצטילציה H4K12 נצפתה בתגובה M344.
בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור לבצע את נקודות הביקורת המרובות המתוארות בפרוטוקול כדי לאמת טיהור היסטון מוצלח לאורך כל התהליך. בעקבות הליך זה, ניתן לטפל בשאלות נוספות בנוגע לזרחון היסטון ולסטטוס מתילציה. פיתוח טכניקה זו סלל את הדרך לחוקרים במעבדה שלנו לנתח את המנגנונים הגנטיים המעורבים במחלת האלצהיימר.
עם זאת ניתן להשתמש בו במגוון מודלים של מחלות שבו שינוי כרומטין הוא המשוערות לשחק תפקיד משמעותי.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה שיטתית לניקוי של היסטונים H3 ו-H4, לצד כימות של שאריות האצטיל של אותם היסטונים. הפרוטוקול, שעבר אופטימיזציה על ידי סטודנט לתואר מתקדם, תוכנן כדי לשמר מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות טבעיות והוא תואם ליישומים בעלי תפוקה בינונית, מה שהופך אותו למתאים למחקר בתחומים כגון ויסות אפיגנטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה תאית
- אפיגנטיקה
רקע
- היסטונים חיוניים לאריזת ה-DNA ולבקרת ביטוי גנים.
- מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות של היסטונים חשובות לתהליכים ביולוגיים שונים.
- דרושות שיטות טהרה יעילות כדי לחקור מודיפיקציות אלו באופן ישיר.
- מחקר זה שואף להתגבר על המגבלות של שיטות קיימות בעלות תפוקה נמוכה.
מטרת המחקר
- מתן מדריך מקיף לניקוי של היסטונים H3 ו-H4.
- כימות של שאריות היסטון מאצטילטוריות מתוך תמריות של תאים ורקמות.
- השגת תוצאות איכותיות וניתנות לשחזור כדי להקל על מחקרים של בקרה אפיגנטית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תרבית תאים והפקה באמצעות בופרים קרים (בטמפרטורת קרח).
- טיהור היסטונים באמצעות כרומטוגרפיית עמודה ו-SDS-PAGE.
- נטרול של היסטונים לצורך קישור יעיל לעמודה והשבה.
- הליכים מדורגים הכוללים הומוגניזציה, סנטריפוגציה ואלוציה לבידוד אופטימלי של היסטונים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול משיג יעילות של כמעט 100% בקישור ובטיהור של היסטונים.
- זמני המיצוי משפיעים על תנובת ההיסטונים, כאשר מיצוי ממושך יותר מוביל להתאוששות גבוהה יותר של H3 ו-H4.
- טיהור מלא מאפשר את ניתוח ההיסטונים המאצטילים בהקשר של מחקרים אפיגנטיים.
מסקנות
- שיטה זו מדגימה אסטרטגיה יעילה לניקוי היסטונים השומרת על המודיפיקציות הטבעיות שלהם.
- הטכניקה ניתנת להתאמה לניתוחים בעוצמה בינונית, ובכך היא משפרת את יכולות המחקר בלימודי אפיגנטיקה.
- להשלכות להבנת מודיפיקציות של היסטונים במודלי מחלות שונים יש משמעות רבה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת כימות מהימן של סימני היסטון מאצטילים מתמציות של תאים ורקמות מוח, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בתהליכי גילוי תרופות אפיגנטיות. על ידי שימור שינויים פוסט-טרנסלציונליים טבעיים, היא מחזקת את הפחתת הסיכונים המכניסטיים במחקרים פרה-קליניים של מחלות ניו روندגנרטיביות. התאימות של הפרוטוקול לזרימות עבודה בעלות תפוקה בינונית משפרת את רמת הביטחון החיזויית בקמפיינים של זיהוי מולקולות מובילות (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של אצטילציה של היסטונים כסמן ביולוגי מכניסטי לבקרה תעתוקית במודלים של מחלות.
- ערך תפעולי: מספק בידוד הדיר השגח של היסטוני הליבה H3 ו-H4 לצורך הערכת מטרות תפקודית.
- ערך ניבוי: תומך בהערכת יעילותם של מעכבי HDAC באמצעות קריאות כמותיות של אצטילציה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר סובסטראטים מטוהרי היסטון המתאימים לבדיקות אצטילציה מבוססות נוגדנים או ספקטרומטריית מסות.
- ערך תפעולי: משיג יעילות קישור לעמודה של כמעט 100%, מה שמבטיח כמות קלט עקבית לשלב הכימות הבא.
- יכולת הרחבה: תואם ליישומים בעלי תפוקה בינונית, מה שמאפשר סריקה של ספריות תרכובות המכוונות למודifiers אפיגנטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקל על התאמת סמנים ביולוגיים על ידי כימות שינויים באצטילציה המגיבים למחלה ברקמת מוח.
- רלוונטיות למודל פרה-קליני: הוכח כי יעיל במודלים טרנסגניים של מחלת אלצהיימר שטופלו במעכבי HDAC.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר הערכה אובייקטיבית של מעורבות המטרה (target engagement) ושל מודולציה של מסלולים לפני מחקרים in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף שבין שלבי הגילוי המוקדמים ועד לשלב הפרה-קליני, ותומכת בבדיקת היפותזות, בהכנה של בדיקות (assays) ובקבלת החלטות מבוססת נתונים בתוכניות המכוונות למטרות אפיגנטיות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בתיקוף פונקציונלי של אצטילציה של היסטונים כצומת בקרה בשכתוב כרומטין.
- סריקה: מספק תכליסי היסטונים כמותיים וניתנים לשחזור להערכת השפעות של תרכובות על סימני אצטילציה.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה מדויקת של שאריות מאצטילציה, ומספק קריאות קריטיות עבור מודולציה של המטרה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים in vitro למודלים פרה-קליניים באמצעות טיהור עקבי של היסטונים ממקורות תאים ורקמות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר לכימות של סממנים אפיגנטיים הפרוסים על פני פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במנגנון המטרה על ידי שימור PTMs טבעיים במהלך הניקוי.
- ערך תפעולי: מבטל שונות הנובעת משיטות בעלות תפוקה נמוכה, ובכך משפר את הדיוק של הבדיקה (assay reproducibility).
- ערך אסטרטגי: מפחית את אי-הוודאות הביולוגית בבחירת מטרות אפיגנטיות, ובכך משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפרויקט (go/no-go).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מסווג סיכונים של משנים אפיגנטיים בהתבסס על נתונים כמותיים של מודולציה של המטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביוכימיה של חלבונים ובניתוח אפיגנטי.
- תלוי בגישה לציוד לצנטריפוגציה, אלקטרופורזה וכרומטוגרפיה בעמודים.
- מחייב פרוטוקולי ניטרול והפקה סטנדרטיים להבטחת התאוששות ההיסטונים.
- חובה להתחשב במשתנים ספציפיים לרקמה בעת התאמה למודלים פרה-קליניים מגוונים.
- מוגבל על ידי הצורך בטיפול זהיר למניעת דגרדציה של היסטונים במהלך שלבי השקיעה בחומצה.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
Preparation of the Sample Extract
2:38
Preparation of the Crude Histone Extract
3:33
Evaluation of the Presence of Histone and/or Non-histone Protein in Histone Extract
4:14
Purification of Core Histones
5:13
Precipitation of Core Histones
7:02
Results: Human Microglial BV2 Histone Purified and Quantification in Wild Type and Transgenic Mouse Brain
9:02
Conclusion
