Microfluidic Assay עבור הערכה של ליקוציט הדבקה על נגזר אנושיים לתאי גזע Pluripotent המושרה בתאי אנדותל (hiPSC-ECs)

פרוטוקול שלב אחר שלב זה מספק תיאור מפורט של הגדרת הניסוי, ניתוח נתונים להערכה של תגובות דלקתיות ב hiPSC-ECs וניתוח של אדהזיה ליקוציט תחת זרימה פיזיולוגיים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על הפונקציונליות והתגובות הדלקתיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים המושרים על ידי תאי אנדותל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תיאור מפורט של ההתקנה הניסיונית וניתוח נתונים להערכת הידבקות לויוציט לתאי אנדותל פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם. לציפוי שבבים מיקרופלואידיים, מניחים שבב ביולוגי סטרילי בצלחת פטרי סטרילית באורך 10 ס"מ ולהשתמש בקצה פיפט של 10 מיקרוליטר כדי להזריק 10 מיקרוליטרים של פתרון עבודה פיברונקין טרי מוכן לכל ערוץ של הביוצ'יפ.

מכסים את צלחת פטרי ומ מניחים אותה בתא לח למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לחמם מראש את הביוצ'יק בחממה של 37 מעלות צלזיוס, ולהשעות מחדש תאים אנדותל תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם שנקטפו מתרבות תאים 80 עד 100% בריכוז הרצוי במדיום טרי נטול סרום תא אנדותל. לאחר מכן, שאפו את תווי הפיברונכרן מכל הערוצים של השבב המיקרופלואידי, וערבבו ביסודיות את התאים כדי להשיג השעיית תא הומוגנית לפני השימוש בקצה פיפט של 10 מיקרוליטר כדי להזריק שישה מיקרוליטרים של תאים לכל ערוץ.

בדוק את השבב מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר כי התאים מופצים באופן אחיד עם צפיפות תאים גבוהה. לאחר 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 40 microliters של תא אנדותל סרום ללא בינוני מלא לתוך המאגרים הבינוניים משני צידי כל ערוץ. ולהחזיר את השבב הביולוגי לאנקובטור לשעה.

לאחר מכן, להוסיף עוד 50 microliters של תא אנדותל תא סרום ללא מלא לתוך המאגרים משני צידי כל ערוץ. להדמיה חיה של התאים המוזרעים, ודאו שהתכוננים המיקרופלואידיים מוכנים, שתא ההדמיה החיה מאוזן ל-37 מעלות צלזיוס, ושרמה CO2 הגיעה ל-5% מקם את השבב הביולוגי במחזיק שבבי המיקרוסקופ והעלה את מחזיק השבב לשלב ההדמיה של המיקרוסקופ. כדי לחבר את השבב למשאבה דרך הסעפת, מניחים את מתאם שמונה הפינים קרוב למאגרי השקע של השבב ומעמיקים את כל הפינים במדיום מבלי לחבר את הפינים לחלוטין.

בתוכנת המשאבה המיקרופלואידית, בחרו Washout/Connect לשבב ולחצו על 'הפעל את צעד ה-Assay' כדי לחלק 30 מיקרוליטרים של מדיום RPMI דרך כל סיכה. לאחר מכן הכנס את מתאם שמונה הפינים לשקע של השבב הביולוגי. השתמשו בפיפטה כדי לזמן ידני את המדיום מכל מאגרי ה-inlet של הביוצ'יפ, ובחרו Washout/Chip Washout ו-Run Assay Step כדי לבלבל ערוץ אחד בכל פעם עם 40 מיקרוליטרים של מדיום נטול סרום של תא אנדותל מלא כדי להסיר תאים מתים ופסולת.

כאשר כל הערוצים נשטפו להחליף את המדיום ממאגר inlet של ערוץ העניין עם 100 microliters של לויקוציטים אנושיים מדולל ל 2.5 פעמים 10 לשש תאים לריכוז מיליליטר במדיום RPMI. לחץ על תיאור הצגה/שלב של התא והגדר תיאור ערוץ/שלב נוכחי והגדר את ערוץ העניין כפעיל ואת שבעת הערוצים האחרים כלא פועל.

החלף את leukocytes הנותרים במאגר inlet עם 100 microliters של מדיום RPMI מלא. ולחץ על תיאור שלב Assay תא ולהפעיל צעד Assay כדי לפנק את הערוץ במשך חמש דקות עם מדיום RPMI כדי להסיר את כל לויקוציטים שאינם עקביים. לאחר מכן לרכוש תמונות לפחות שלוש עד ארבע עמדות שונות בערוץ כדי לדמיין את leukocytes דבק.

כדי לכמת את לויוציטים חסיד לפתוח את תוכנת עיבוד תמונה CellProfiler ולייבא את הקובץ צינור הרוזן לויוציטים. תחת מודולי קלט, בחר תמונות ו גרור ושחרר את התיקיה עם התמונות הגולמיות של leukocytes חסידים לחלון הרשימה קובץ. תחת מודולי ניתוח, בחר זהה אובייקטים ראשיים וציין את הקטרים המינימליים והמקסימליים של לויקושיטים חסידים בפיקסלים.

תחת מודולי ניתוח, בחר מסנןObjects. לאחר מכן בחרו בקריטריוני הסינון והזינו את האזור המינימלי המקובל של העצמים בפיקסלים ולחצו על 'נתח תמונות' כדי להתחיל בניתוח. דיסוציאציה אופטימלית של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאים אנושיים צריכים לגרום להשעיה של תא יחיד ללא גושי תאים.

בדרך כלל, 15 דקות לאחר ההזרקה תאי ה אנדותל יתחברו לתחתית הערוץ ויתחילו להתפשט. בתוך שעה אחת של ההזרקה תאי אנדותל צריך ליצור monolayer התפשט היטב על פני הערוץ שבו הם מוכנים לשימוש בהסטת זרימה. שימוש בתוכנת עיבוד התמונה החופשית בקוד פתוח כפי שהוכח מאפשר סינון של אובייקטים מזוהים המבוססים על שטח מינימלי, והדרה של אובייקטים שזוהו באופן כוזב כגון פסולת תאים, שפעת אוטומטית או כל אות פלואורסצנטי לא ספציפי אחר.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לייעל את הגירוי עם ציטוקינות פרו דלקתיות ולכלול תאי אנדותל ורידים אנושיים ראשוניים כשליטה חיובית. אל תשכח כי עבודה עם תאים ראשוניים של יונקים וקווי תאים יכול להיות מסוכן מאוד, כי אמצעי זהירות כגון לבישת מעיל מעבדה, כפפות והגנה על העיניים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.