הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של השומן, כגון כיצד אינטראקציות בין תאיות ופיזיולוגיה של רקמת שומן משתנות על תנאים מטבוליים שונים כגון צום והשמנת יתר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא שומרת באופן אופטימלי על מבנה ה- 3D המקורי של השם ונמנעת מצעדי עיבוד ארוכים הנדרשים בדרך כלל עבור אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך המבנה של רקמת השומן, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות איברים אחרות, כגון מערכת העצבים, על ידי הר שלם מכתים את המוח.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הקשיים להשיג אתרי רקמת רכוש, מציאת תקופת הקיבוע הנכונה, ואת ריכוזי הנוגדנים האופטימליים. לאחר השלמת הניתוח, מעבירים את המנה המכילה את דגימות הרקמה בפרפורמלדהיד של 1% מהקרח לטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן להעביר את הרקמות או 12 או 24 גם צלחת תאים לכביסה מהירה יותר.

חשוב לזכור כי הליך הכתם של כל ההר חייב להתחיל מיד לאחר הניתוח, כי אין נקודות השהיה בין כל שלב. לשטוף את הרקמות עם PBS-0.3T על שייקר מוטה ב 22 מעלות עם מהירות בין 20 ל 25 הטיות לדקה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות.

לאחר מכן, הוסף כ- 0.5 למיליליטר אחד של חיץ חסימה המכיל 5% סרום בעלי חיים. הדגירה את הצלחת על שייקר באמצעות התנאים הקודמים במשך שעה אחת. שאפו את פתרון החסימה, והוסיפו מיליליטר של נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-PBS-0.3T עם 1% סרום לבעלי חיים לכל באר.

הדגירה את הצלחת לילה על שייקר בארבע מעלות צלזיוס עם הטיה של 22 מעלות ומהירות של 20 עד 25 הטיות לדקה. למחרת, להשתמש PBS-0.3T לשטוף את הרקמות בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות.

לאחר מכן, הוסיפו בין 0.5 למיליליטר של פתרונות נוגדנים משניים מתאימים ומדוללים לכל באר. עוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדרגים אותה על שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת פעמיים עם PBS-0.3T בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות לכל לשטוף.

אם יש צורך בהדמיה של טיפות נוזליות במהלך כתם השומנים הניטרלי, יש לשטוף פעמיים עם 1x PBS כאשר כל שטיפה נמשכה חמש דקות. מוסיפים את כתם השומנים הניטרלי מדולל ב- PBS, ומדגרים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. כדי להתחיל הדמיה, להשתמש במטלפות להניח את הרקמה שטוחה על 24 על ידי 60 מילימטר כיסוי זכוכית להחליק.

אם רצוי כתמי גרעינים עם DAPI, הוסף טיפה אחת עד שתי טיפות של מדיום הרכבה המכיל DAPI כדי להטביע לחלוטין את הרקמה ולמנוע ממנה להתייבש. לאחר מכן, מקם את השקופית על מערכת מיקרוסקופ לייזר קונפוקל הפוכה. כדי לקבל תמונות של רקמה מוכתמת כולה במישורי מוקד מרובים, בצע ערימות Z של 100 עד 150 מיקרומטר לעומק עם גודל צעד של ארבעה עד שישה מיקרומטרים בהגדלה הרצויה.

במחקר זה, כתמים בהר שלם משמשים לשימור ארכיטקטורת רקמת שומן. שלא כמו שיטות הכרוכות בשלבי עיבוד מרובים וקטעים, אשר יכול להוביל עיוות של מורפולוגיה רקמת השומן, שיטת הכתם כל הר יכול לשמר את המורפולוגיה של adipocytes, הבטחת דיוק בעת פרשנות תוצאות. overfixation של רקמת שומן מוביל פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי תיקון, אשר ניתן לציין על ידי אזורים זהים חופפים, כגון טירוסין הידרוקסילאז ו PECAM-1 אותות לראות כאן.

עם זאת, דגימות כתם קבועות כמו שצריך, שלם-הרכבה, מציגות אותות נפרדים ומובחנים, המציינים כי אותות אלה אינם שפעת אוטומטית. הדמיית רקמת שומן מוכתמת בהר שלם מאפשרת כימות של שינויים מורפולוגיים בתנאים ניסיוניים שונים. בפרט, רקמת שומן הוא vascularized מאוד, אשר חשוב לתווך הונוסטזיס מטבולי על שינויים מהירים ברמת האנרגיה.

לדוגמה, עכברי C57 שחורים 6J, שעוברים 24 שעות של צום, מציגים גודל adipocyte קטן משמעותית, אשר מצביע על lipolysis, מגמה בצפיפות כלי דם גבוהה בהשוואה לעכברים המוזנים ברציפות. ניקוי רקמות שומן עם iDISCO+מאפשר לרקמות השומן להיות שקופות אופטית. Immunolabeling של רקמת שומן שעבר ניקוי רקמות מראה ארבוריזציה עצבית צפופה הרבה יותר בהשוואה לזה שנצפה בכתמים בהר שלם ללא ניקוי רקמות באותה הגדלה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא overfix הדגימות שלך במשך יותר משעה בטמפרטורת החדר PFA, אחרת, זה יגדיל את שפעת אוטומטית ברקע. עם זאת, תקופת קיבוע זו יכולה להיות ממושכת אם דגימות קבועות בארבע מעלות צלזיוס. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו כימות באמצעות ImageJ, ניתן לבצע על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו איך ארכיטקטורה הסלולר, כגון אתרי adipocyte וצפיפות כלי הדם, לשנות בתגובה לתנאים פיזיולוגיים שונים.