מערכת BW כתב ללמוד אינטראקציות קולטן-ליגנד
7 בינואר 2019
פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מערכת כתב כי ניתן להשתמש כדי לזהות ולכמת קולטן-ליגנד אינטראקציות.
מערכת הכתבים של BW מאפשרת ללמוד אינטראקציות קולטן-ליגנד. זה מאוד שימושי במקרים שבהם ligand של קולטן מסוים אינו ידוע או במקרים שבהם הניסויים עם ליגנד אנדוגני הם קשים מבחינה טכנית. שיטה זו רגישה וסודית לקולטן בודד, קלה לתפעול ולשכפול.
הפגנת ההליך תהיה שירה כחלון, פוסט-דוק למעבדה שלי. יום לפני transfection, צלחת 10 צלחות עם 10 מיליליטר של 100, 000 BW5147 תאים, ולהשלים RPMI. ואז למקם 100 מיקרוגרם של pcDNA3 פלסמיד בצינור.
מוסיפים נתרן אצטט ב- pH 5.3 לצינור. לאחר מכן, להוסיף 2.5 כרכים של 100%אתנול לתערובת פלסמיד. ואז להחגירה את תערובת פלסמיד לילה במינוס 20 מעלות צלזיוס.
24 שעות לאחר ציפוי תאי BW, לאסוף את התאים בשני צינורות 50 מיליליטר. ואז צנטריפוגה התאים ב 515 גרם של במשך חמש דקות, ולהשליך את העל טבעי. יש להשתמש שוב ב- RPMI פלוטון ללא תוספות ולחזור על הצנטריפוגה.
תן שימוש חוזר את גלולה וכתוצאה מכך 1 מיליליטר של RPMI ללא תוספות. מעבירים את גלולת התלייה ל-4 ס"מ על הקרח. צנטריפוגה הפלסמיד שעבר משקעים אתנול.
ואז לשטוף את הפלסמיד עם מיליליטר אחד של 70% אתנול. ולחזור על צנטריפוגה לעוד 20 דקות. הסר את כל האתנול, ולאפשר את גלולה להתייבש חלקית.
לאחר מכן להשתמש שוב את גלולה ב 100 microliters של RPMI שחומם מראש, ללא תוספות. לאחר מכן, מוסיפים את הפלסמיד המתווסף לתאים בקובט. דגירה התאים על קרח במשך חמש דקות.
לאחר מכן, אלקטרופוראט התאים. ואז להעביר את התאים אלקטרופולד לצינור 50 מיליליטר. מוסיפים 50 מיליליטר של מדיום שלם לצינור וצנטריפוגה במשך חמש דקות, ב 515 גרם.
השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את התאים ב-50 מיליליטר של מדיום שלם. לאחר מכן צלחת התאים ב 24 גם מנות תרבות, ו דגירה התאים במשך 48 שעות. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום מלא, בתוספת 10 מיליגרם למיליליטר של G418 לכל באר.
48 שעות לאחר מכן, להשליך מיליליטר אחד של הנפח העליון של כל באר. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של מדיום שלם בתוספת חמישה מיליגרם למיליליטר של G418 לכל באר. השתמש 50, 000 תאי BW מומרים עם המטרות הרצויות שלהם, באר אחת של צלחת 96 באר.
דגירה הצלחת במשך 48 שעות. ואז להקפיא את הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס. מצפים צלחת ELISA עם נוגדן נגד עכבר IL-2.
מניחים 05 מיקרוגרם של IL-2 נגד עכבר, בנפח של 50 מיקרוליטרים של PBS בכל באר. דגירה צלחת מצופה לילה בארבע מעלות צלזיוס. השתמש בתקופת דגירה קצרה ב 37 מעלות צלזיוס, כדי להפשיר את תאי BW הקפואים, שהיו בעבר דגירה עם המטרות שלהם.
ואז צנטריפוגה הצלחת, ולהעביר 100 microliters של supernatant מכל באר לצלחת ELISA מצופה מראש. ודגירה ב37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן להוסיף ביוטין נגד עכבר IL-2 לצלחת ELISA.
לאחר הדגירה והכביסה, מוסיפים לצלחת סטרפטבידין מצומד HRP. לאחר הדגירה והכביסה, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון המצע TMB, לכל באר של צלחת ELISA. לבסוף לקרוא את צלחת ELISA ב 650 ננומטר.
בדוגמה זו, תאי CLL היו טרום דגירה עם נוגדנים שונים נגד CD20. ולאחר מכן הדגירה במשותף עם תאי BW מנופים המבטאים את קולטני Fc CD16, לפני ניתוח עם ELISA. לאחר ניתוח עם ELISA התוצאות כומתו.
רמות הצפיפות האופטית הוסבו לריכוזי עכבר IL-2, בהתבסס על העקומה הסטנדרטית. בניסוי נוסף, מינונים שונים של נוגדנים נגד CD20 היו טרום דגירה עם תאי CLL. ואז דגירה עם תאי BW מנופחים.
החלקיק מכיל ארבעה חלקים עיקריים. שיבוט, חילוף של תאי BW, הפעלה ו ELISA. יש לאמת כל אחד מהחלקים באופן עצמאי.
בעקבות הליך זה, ניסויים נוספים יכולים להתבצע עם תאים המבטאים את הקולטנים הא אנדוגניים, כגון הרג חומצות עם תאי NK כדי ללמוד אינטראקציות עם קולטני תא NK. השתמשנו במערכת זו כדי לגלות ליגנדים חדשים של קולטני תא NK. לדוגמה, hemagglutinin הוא ליגנד של NKp46, ו- PVL הוא ליגנד של TG.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את מערכת ה-BW Reporter, שיטה רגישה וספציפית לחקר אינטראקציות בין רצפטור לליגנד, במיוחד כאשר הליגנד אינו ידוע או שקשה לעבוד איתו. המערכת משתמשת בתאי BW5147 של עכבר שעברו טרנספקציה עם מבנה רצפטור כימרי, מה שמאפשר כימות של הפעלת הרצפטור באמצעות הפרשת interleukin-2 (IL-2) המזוהה על ידי ELISA. גישה זו מקלה על ניתוח הפעלת רצפטורים על ידי ליגנדים שונים, כולל נוגדנים ומולקולות על פני השטח של התא.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- אינטראקציות רספטור-ליגנד הן בסיסיות לתהליכים ביולוגיים רבים.
- ניסויים ישירים עם קולטנים וליגנדים טבעיים עלולים להיות מאתגרים בשל ליגנדים שאינם ידועים או בשל קשיים טכניים.
- מערכות דגלים (Reporter systems) יכולות לספק זיהוי רגיש וספציפי של הפעלת קולטנים.
- דרושים בדיקות כמותיות כדי למדוד את רמות הפעלת הרצפטורים.
מטרת המחקר
- פיתוח והדגמה של מערכת רבּורטרית (reporter system) לזיהוי אינטראקציות בין רספטור לליגנד.
- מתן אפשרות לכימות של אקטיבציית רספטורים גם כאשר הליגנד אינו ידוע.
- אספקת שיטה הניתנת לשחזור וקלה לתפעול למחקרי רספטורים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שבטיב של הדומיין החוץ-תאי של רספטור ספציפי המחובר ל-CD3ζ של עכבר.
- טרנספקציה של תאי BW5147 של עכבר עם מבנה הרספטור הכימרי באמצעות אלקטרופורציה.
- סלקציה של תאים שעברו טרנספקציה באמצעות האנטיביוטיקה G418.
- אינקובציה של תאי BW שעברו טרנספקציה עם תאי מטרה או נוגדנים.
- מדידה של IL-2 מופרש של עכבר באמצעות ELISA כמדד להפעלה של הרספטור.
תוצאות עיקריות
- מערכת הדוחות מזהה בהצלחה הפעלה של רצפטורים ספציפיים על ידי ליגנדים שונים.
- מדידה כמותית של הפרשת IL-2 נמצאה במתאם עם רמות הפעלת הרצפטורים.
- המערכת שימשה לחקר הפעלה של רצפטורי Fcγ אנושיים על ידי נוגדני anti-CD20 בתאי CLL.
- ניתן לבצע סטנדרטיזציה לתוצאות באמצעות המרת צפיפות אופטית לריכוז IL-2 באמצעות עקומות סטנדרט.
מסקנות
- מערכת ה-BW Reporter היא כלי חסון לניתוח אינטראקציות בין רספטור לליגנד.
- השיטה ישימה גם כאשר הליגנד אינו ידוע או ששימושו בניסויים הוא קשה.
- השיטה רגישה, ספציפית, ומאפשרת ניתוח כמותי של הפעלת רצפטורים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכת ה-BW Reporter מאפשרת בחינה רגישה וכמותית של אינטראקציות בין רספטור לליגנד, גם כאשר הליגנד אינו ידוע או מהווה אתגר טכני. יכולת זו פותרת צוואר בקבוק קריטי בשלבי הגילוי המוקדמים ובתיקוף המטרה (target validation) על ידי אספקת פלטפורמה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה למחקרי הפעלה תפקודית של רספטורים. המערכת תומכת בהפחתת סיכונים בפריסה רחבה של פורטפוליו ומאיצה את הביטחון במנגנוני הפעולה בנקודות מפנה מרכזיות בפיתוח תרופות ביולוגיות ונוגדנים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של הפעלת רצפטורים על ידי ליגנדים מגוונים, כולל ליגנדים שאינם ידועים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד אירועי הפעלה ספציפיים לרצפטור.
- מקל על מיון מהיר של מטרות פוטנציאליות בהתבסס על פרופילים כמותיים של הפעלה.
- מספק קריאת תוצאות סטנדרטית לבדיקה של מסלולים מבוססת השערות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פלט כמותי הניתן לשחזור המבוסס על ELISA עבור תהליכי סינון המשכיים.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובשחזוריות בין מעבדות עבור מחקרי רספטור-ליגנד.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה (scalable) של מועמדים לליגנדים מבוססי תאים או נוגדנים.
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך הערכה ברמת ביטחון גבוהה של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתוני הפעלת רצפטורים עם נוגדנים או טיפולים תאיים הרלוונטיים למחלה.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מעורבות רצפטורים פונקציונלית.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של מועמדים ביולוגיים בהתבסס על ספי thresholds (ספי כניסה) כמותיים של אקטיבציה.
- מאפשר פיתוח של סמנים ביולוגיים תרגומיים כאשר הפעלת רספטורים היא נקודת קצה מרכזית.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
מערכת רפורטר זו מתאימה משלבי הגילוי המוקדמים, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד לתיקוף פרה-קליני, ומספקת פלטפורמה רב-פעמית לבחינה פונקציונלית של אינטראקציית רצפטור-ליגנד.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות הפעלת קולטנים בתגובה לליגנדים מועמדים.
- סריקה: מספקת תוצרי ELISA כמותיים וסטנדרטיים להשוואת יעילות וספציפיות של ליגנדים.
- אנליטיקה: מאפשרת המרה של צפיפות אופטית לריכוז IL-2 לצורך ניתוח סטטיסטי איתן בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי למחקרים פרה-קליניים על ידי תיקוף של מעורבות תפקודית של מטרות טיפוליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מספקת מערכת מודולרית וסתגלנית למגוון מחקרי קולטן-ליגנד בתוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות הפעלת רספטורים סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לסריקה פונקציונלית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מועמדים ביולוגיים ומועמדים של נוגדנים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בשכפול מולקולרי וטרנספקציה של תאים לצורך יצירת רצפטורים כימריים.
- נדרשת גישה למכשור ELISA ותשתית אנליטית לקבלת תוצאות כמותיות.
- נדרש סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה ושל תהליכי ניתוח הנתונים בין צוותים שונים.
- ניתן להתאימה לסוגי רצפטורים ולמקורות ליגנדים שונים, כולל נוגדנים ומולקולות על פני השטח של התא.
- ההצלחה תלויה באימות עצמאי של כל רכיב בזרימת העבודה כדי להבטיח תוצאות מהימנות.
