בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

השיטה שלנו לקצירת תאי אפידרמיס מעכברים בוגרים שימושית עבור יישומים במורד הזרם כגון תאי גזע keratinocyte. הטכניקה שלנו ניתנת לשחזור מאוד ו ניתן להשתמש בה בשילוב עם הליכים in vivo בעכברים בהקשר של מודל מסרטנים העור. לאחר קצירת דגימות עור הגב מעכברים בוגרים שעברו המתת דם, השתמש במלקחיים אוטוקלאבים ואזמל כדי למקם עור דורסי אחד בכל פעם בצד שעיר למטה לתוך צלחת פטרי דקה ולגרד את הרקמה התת עורית כולל השומן מרקמת העור הגחוני עד הרקמה היא שקופה למחצה.

מניחים את העור שרוט PBS עד כל העורות הנותרים האחרים מעובדים. לאחר מכן השתמש אזמל לחתוך את דגימות העור לתוך 0.5 על ידי אחד עד 1.5 ס"מ רצועות. מניחים את הצד השעיר של הרצועות בצלחת פטרי סטרילית לפני שהם צפים את הצד השעיר של הדגימות על פני השטח של PBS 20 מיליליטר בתוספת שני תמיסת ג'נטמיצין x, בתוספת 0.25% טריפסין בצלחת פטרי פלסטיק 100 על 20 מילימטר במשך שעתיים ב 32 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, מניחים צלחת פטרי סטרילית, מפלסטיק, מרובעת המכילה 15 מיליליטר של מדיום קציר ב שיפוע של 30 מעלות ולהשתמש במקלות מעוגלים כדי להעביר בזהירות רצועת עור צפה לתוך המנה. החזקת להב אזמל חדש בזווית ניצבת לעור ושימוש בכוח מספיק אך לא מוגזם, לגרד את האפידרמיס ואת השערות מן המדגם לתוך המדיום. כאשר כל הרצועות כבר גירד, בזהירות decant התא האפידרמלי המכיל supernatant לתוך צנצנת סטרילית 60 מיליליטר המכיל 1.5 אינץ ' מגנטי מערבב בר ולשטוף את צלחת פטרי עם מדיום קציר נוסף כדי לאסוף את כל התאים האפידרמיס שנותרו.

מביאים את הנפח הסופי בצנצנת ל-30 מיליליטר עם מדיום טרי, ומערבבים את תמיסת התא האפידרמיס ב-100 סיבובים בדקה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה המרגשת בארון biosafety להסיר את בר מערבב ולסנן את פתרון התא דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. השתמש ממטרות ולאחר מכן פיפטה ללחוץ על השערות ואת חומרי הקרנית שכבה דרך מסננת כדי לתפעל את הרקמה כדי לשחרר את תאי השיער לכודים ולהשתמש חמישה מיליליטר נוספים של מדיום קציר לשחרר את תאי השיער לכודים שנותרו לתוך הצינור.

זה קריטי כי תאי האפידרמיס ואת השערות הם מניפולציה כדי לשחרר את התאים זקיקי השיער. להביא את הנפח הכולל בצינור עד 50 מיליליטר עם מדיום טרי ולאסוף את התא לסינון על ידי צנטריפוגה. תן מחדש את גלולה ב 5 מיליליטר של מדיום קציר טרי על 20 triturations עם פיפט 5 מיליליטר.

קח 0.5 מיליליטר של אחד עד 20 דילול ולהעביר אותו לצינור microfuge 2 מיליליטר. לאחר ערבוב הדגימה בזהירות, יש ליטול 200 מיקרוליטרים מצינור המיקרופוג' ולערבב בעדינות עם נפח שווה של 0.4% פתרון כחול טריפאן. מערבבים בעדינות פתרון זה שלוש פעמים ומעבירים את התאים להמוציטומטר לספירת קרטינוציטים גרעינים.

ציון כל התאים הכחולים הכהים כמו תאים שאינם ניתנים לשימוש ציון תאים קטנים זהב ורדפל כמו תאים קיימא. ממוצע הכדאיות הוא כ-80%, ותפוקת הקרטינוציטים הסופית לעכבר צריכה להיות כ-30 מיליון תאים בני קיימא. לאחר הספירה, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת, ועל תרבות ההמונים resuspend פעמיים עד ארבע פעמים 10 כדי keratinocytes קיימא השישי לכל 35 צלחת פטרי מילימטר ב 2 מיליליטר של מדיום תרבות התא.

עבור מקדם היווצרות מושבה clonogenic, resuspend התאים באחת פעמים 10 כדי keratinocytes השלישי לכל ארבעה מיליליטר של שונה ויליאם E מדיום עם תוספי תזונה בריכוז סרום לכל קולגן מצופה 60 מילימטר צלחת פטרי על רנטגן מוקרן עכבר שוויצרי 3T3 שכבות הזנה. לתרבות ההמונים, לגדל את התרבויות ב 32 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני לתקופה המתאימה תרבות התא. שינוי המדיום 24 שעות לאחר הזריעה הראשונית לתרבות ההמונים ושלוש פעמים בשבוע לאחר מכן.

בסוף תרבות השיבוטים שאפו את המדיום ותקן את המושבות בפורמלין 10% במהלך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, להכתים את המושבות עם 0.5% rhodamine B במים autoclaved במשך שעה אחת, לפני שטיפה את הכלים במים אוטוקלאבים קרים עד המים זורמים צלולים. ואז לשים את הכלים על העפעפיים שלהם להתייבש לפני ספירת המושבות.

כאן, תוצאות אופייניות של keratinocyte המושבה היווצרות משגיח לאחר טיפולים אקטואליים שונים מוצגים. תאי גזע זקיקי השיער בדרך כלל לפצות כ 9% של התאים מבודדים עור עור הגב בוגר C57BL/6 העכבר כפי שהוערך על ידי כתמים ציטומטריים זרימה עבור סמני תא גזע זקיק שיער העכבר. בנתון זה ניתן לראות את מאפייני הצמיחה של מושבות תאי גזע קרטינוציטים לאחר תרבות בארבעה תנאים בינוניים שונים.

בעקבות הליך זה, התאים יכולים לשמש עבור ציטומטריית זרימה, מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, תרבות תאים וניתוחים ביולוגיים מולקולריים. טכניקה זו אפשרה לנו לקבוע כי מספר תאי גזע אפידרמליים הוא תכונה כמותית ומורכבת המובילה לזיהוי גן רגולטורי חדש של תאי גזע.