Name: בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: למדו שיטה לבידוד קרטינוציטים אפידרמליים מעור עכברים בוגרים ליישומים במחקר תאי עור וקרצינוגנזה. הטכניקה מייצרת כ-30 מיליון תאים חיים עם שיעור הישרדות של כ-80%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

למחברים אין ותודות.

<ol><li>Morris, R. J., Tacker, K. C., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+primary+in+vitro+clonogenic+keratinocytes+from+normal+adult+murine+epidermis%2C+following+initiation%2C+and+during+promotion+of+epidermal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitation of primary in vitro clonogenic keratinocytes from normal adult murine epidermis, following initiation, and during promotion of epidermal tumors.</a> Cancer Research. 48 (22), 6285-6290 (1988).</li>
<li>Tani, H., Morris, R. J., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+for+murine+keratinocyte+stem+cells+based+on+cell+surface+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10960-10965 (2000).</li>
<li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 411-417 (2004).</li>
<li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+for+living+murine+keratinocytes+from+the+hair+follicle+bulge+with+the+cell+surface+marker+CD34%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34.</a> Journal of Investigative Dermatology. 120 (4), 501-511 (2003).</li>
<li>Redvers, R. P., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+primary+adult+murine+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of primary adult murine keratinocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 289, 15-22 (2005).</li>
<li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li>
<li>Blacker, K. L., Williams, M. L., Goldyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C-treated+3T3+fibroblasts+used+as+feeder+layers+for+human+keratinocyte+culture+retain+the+capacity+to+generate+eicosanoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C-treated 3T3 fibroblasts used as feeder layers for human keratinocyte culture retain the capacity to generate eicosanoids.</a> Journal of Investigative Dermatology. 89 (6), 536-539 (1987).</li>
<li>Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorris%2C+RJ+%22Procedure+for+harvesting+epidermal+cells+from+the+dorsal+epidermis+of+adult+mice+for+primary+cell+culture+in+%E2%80%9Chigh+calcium%E2%80%9D+defined+medium%22">Procedure for harvesting epidermal cells from the dorsal epidermis of adult mice for primary cell culture in “high calcium” defined medium</a>. , Cambridge University Press. (1994).</li>
<li>Wu, W. Y., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+harvest+and+assay+of+in+vitro+clonogenic+keratinocytes+stem+cells+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Method for the harvest and assay of in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice.</a> Methods in Molecular Biology. 289, 79-86 (2005).</li>
<li>Popova, N. V., Teti, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+keratinocyte+stem+cell+regulatory+loci+implicated+in+skin+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Identification of two keratinocyte stem cell regulatory loci implicated in skin carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 24 (3), 417-425 (2003).</li>
<li>Popova, N. V., Tryson, K. A., Wu, K. Q., Morris, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+keratinocyte+colony+number+is+genetically+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Evidence that the keratinocyte colony number is genetically controlled.</a> Experimental Dermatology. 11 (6), 503-508 (2002).</li>
<li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+microarray+transcriptome+profiling+of+CD34-enriched+mouse+keratinocyte+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive microarray transcriptome profiling of CD34-enriched mouse keratinocyte stem cells.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (12), 2904-2907 (2007).</li>
<li>Baer-Dubowska, W., Morris, R. J., Gill, R. D., DiGiovanni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+covalent+DNA+adducts+in+mouse+epidermal+subpopulations+after+topical+application+of+benzo%28a%29pyrene+and+7%2C12-dimethylbenz%28a%29anthracene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of covalent DNA adducts in mouse epidermal subpopulations after topical application of benzo(a)pyrene and 7,12-dimethylbenz(a)anthracene.</a> Cancer Research. 50 (10), 3048-3054 (1990).</li>
<li>Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal%2C+multipotency%2C+and+the+existence+of+two+cell+populations+within+an+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche.</a> Cell. 118 (5), 635-648 (2004).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

שיטת הקציר keratinocyte תיאר כאן פותחה כדי לייצר תשואה גבוהה של keratinocyte ראשונית באפידרמיס העיקרי מאחורי של עכברים נקבה בוגרים. אלה keratinocytes מתאימים לזרימה cy, ליישום הביולוגיה המולקולרית, ואת התרבות התא הראשוני, כולל את הבקשה הclonogenic דיווחו כאן. זו שיטת הקציר keratinocyte גם היה שימושי ללמוד היבטים במורד הזרם השני של מסרטנים כימיים קרצינובגנזה וקידום הגידול1,13.
קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, עבור הקשיחות והתוכסות, עכברים נקבה של גיל 54 ± 2 ימים שימשו. זה איפשר לנו לבצע מושבה רגישה וכמותית בחני מזנים מרובים של עכברים ולהשתמש בהם כפנוטיפ בניתוח הצמדה המוביל לזיהוי של לפחות תא גזע חדש אחד הרגולציה10,11. שנית, מועיל לחתוך את העורות לחתיכות קטנות יותר, מכיוון שהטריסיזציה יעילה יותר מלנסות לשמור על העור כולו. שלישית, הזמן וטמפרטורת הטריפסין. מאוד חשובים ליכולתם הבאה יתר על כן, האדם צריך "לתקוע באופן משמעותי" על השערות שנותרו על הפילטר לעקור את התאים המחוברים. שלב זה חשוב לקבל תשואות גבוהות של תאים. יתרה מזאת, הטמפרטורה 32 ° c של החממה חשובה לטיפוח ארוך טווח של keratinocytes מעכברים למבוגרים. בסופו של דבר, בפרוטוקול זה, הקריאות המקבילות של מבחנה ובניסויים vivo1 מבוססים על תרבויות ראשיות ולא על קווי משנה או של תאי תאים. בעיקר, אם קצירת keratinocytes הראשי בפעם הראשונה באמצעות פרוטוקול זה, לשמור על דרמיס הנותרים לאחר גירוד כדי לאשר את ההסרה המלאה של זקיקי השיער יחד עם האפידרמיס על ידי התבוננות histopathological.
החוזק העיקרי של פרוטוקול זה לקצירת keratinocytes עכבר למבוגרים היא כי הוא מייצר תשואות גבוהות של תאים מיועדים להיות מתאימים עבור יישומים רבים במורד הזרם. המגבלה העיקרית היא שחלק מהתאפיסקופים הסלולריים עשויים להיות רגישים לטריסיזציה, כך שניתן יהיה להתפשר על הנוגדנים. לכן, כאשר בדיקת נוגדן משטח התא חדש, זה עשוי להיות נבון להשתמש dispase6 או thermolysin5 שיטה מבוססת לקציר להשוואה. המשמעות של פרוטוקול זה היא כי הוא נבדק בקפדנות, בכמת, והוחל על יישומים מגוונים כאלה כמו בחני עבור תאי גזע clonogenic1,9,10,11, עבור תרבויות המוני בביוכימיה8, עבור מיון facs בניתוח תאי גזע3,4, עבור ביולוגיה מולקולרית3,12, ועל רצפי רנ א מתמשך ו-DNA רצף.

העור מכסה את הגוף כולו ומשמש מגוון פונקציות (למשל, מכשול פיסי ראשוני, רגולציה ושימור לחות). במהלך חמשת העשורים האחרונים, מחקר בסיסי על עור העכבר הניב מידע חדש על המבנה והתפקוד של העור. מודל העור של העכבר עזר מאוד להבין את הביולוגיה הבסיסית מאחורי מנגנונים מולקולריים מורכבים של מסרטנים כימיים או אולטרה סגולה מושרה בקרינה. אלה מודלים העור העכבר סיפק תרומה משמעותית להבנת מחלות עור האדם ואת ההקלה שלהם. כדי לחקור ניתוח מולקולרי נוסף של keratinocytes העיקרי בביולוגיה התפתחותית זקיק השיער, תאי גזע מחקר, קרצינובגנזה, וחקר גנטי של האפידרמיס, הוא רצוי לעתים קרובות לבודד ותרבות האפיתל העיקרי keratinocytes מן העור עכברים להשתמש במקביל עם ניסויים vivo. הגורם מוטיבציה בפיתוח שיטה זו היה הצורך באופן מתורבת בתוך שיטת מבחנה בלתי עוריות ושיער זקיק תאי גזע1,2. היה גם צורך דחוף השעיות תא בודד של תאים עוריות מתאים לclonogenic בחני3, מיון תא מופעל פלואורסצנטית, וזרימה cy, try3,4. היתרונות של שיטה זו הם קציר חזק להגדיל את סדר הגודל על פני שיטות אחרות5,6, הכללת החלק האפיתל של זקיקי השיער, ואת היכולת הגבוהה של התאים שנקטפו. בשנות השמונים לא היו שיטות ידועות שיכולות לעמוד בדרישות הללו. בשנים הבאות, שיטה זו היה מעודן כדי להגדיל את תפוקת התאים. המגבלה העיקרית של שיטה זו תהיה מסווה של מספר טריפסין של נוגדנים רגישים שהיו מתפשרים על פעילות חיסונית6.
העכברים קיבלו טיפול בהתאם הנחיות ספציפיות הפתוגן חינם. אחד עד חמש עכברים נקבה 54 ± 2 ימים של גיל הושגו. בעכברים מבוגרים, הכדאיות של keratinocytes יופחת עקב שלב anagen (צמיחה) של מחזור השיער. כמו כן, תהליך הטריסינוניזציה קשה יותר בהשוואה לעכברים צעירים. הליך הקציר הותאם בהצלחה לעור הדליל של העכברים הנקביים בהשוואה לזכר. עכברים זכרים בדרך כלל לא משמשים ליבול keratinocyte כפי שיש להם נטייה להילחם אחד עם השני במהלך הדיור ולכן יכול להשאיר שריטות או פצעים על העור.

<table><tbody><tr><td>0.4% טריפן כחול 1x ב 0.9% מלח</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES Buffer</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td>סטרילי</td></tr><tr><td>1.5 אינץ' מוט ערבוב מגנטי עם טבעת ציר</td><td>Bel-Art, Wayne</td><td>371101128</td><td>ב 2 אונקיות צנצנת Nalgene</td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטות חד פעמיות</td><td>BD Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור חרוטי סטרילי</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>352097 150 ס"מ2 (T-150) בקבוק תרבית</td><td>קורנינג</td><td>430825</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל מכסה בורג מיקרו צינור חרוטי</td><td>Sarstedt</td><td>72.608</td><td></td></tr><tr><td>2 אונקיות צנצנת Nalgene</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2118-0002</td><td>60 מ"ל</td></tr><tr><td>2.5% תמיסת טריפסין 10x</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>225 ס"מ2 (T-225) בקבוק תרבות</td><td>קורנינג</td><td>431082</td><td></td></tr><tr><td>32 אונקיות בקבוקי אחסון מרובעים של Nalgene: PETG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2019-1000</td><td>1000 מ"ל</td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת תרבות סטרילית</td><td>קורנינג</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צנרת חד פעמית</td><td>BD Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוט סטרילי</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ תרבות סטרילית צלחת</td><td>קורנינג</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>90 מ"מ קוטר מסנן רשת ספקטרה, 74 ומיקרו; m גודל נקבוביות</td><td>ספקטרום מעבדות</td><td>145956</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה (פניצילין-סטרפטומיצין)</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל בקר (BCS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Hyclone</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>BD Biosciences</td><td>354331</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Ram34 FITC נוגדן מצומד</td><td>BD Pharmingen</td><td>553733</td><td></td></tr><tr><td>CD49f (alpha6-integrin, GOH3) נוגדן מצומד PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>555736</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים, 70 ומיקרו; m סטרילי</td><td>BD Discovery Labware</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>קולגן, בקר, סוג I, 30 מ"ג</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell מיכל הקפאת תאים חסכוני עבור 1 או 2 מ"ל קריוביאלים</td><td>Biocison</td><td>BCS-136PK</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג 2 מ"ל בקבוקון קריוגני פוליפרופילן, עומד בפני עצמו עם</td><td>קורנינג</td> תחתון עגול <td>430659</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>סיגמא</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr>מי <td></td><td></td><td>Milli-Q מזוקקים</td><td>טריים; מי אוסמוזה הפוכה מזוקקים פעמיים</td></tr><tr><td>Dulbecco' s תמיסת מלח 1x, Ca2+ ו-Mg2+ free</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>14190-144</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Hyclone</td><td>SH 300070.03</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>סיגמא</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 4 oz. מיכל דגימה סטרילי</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-320-730</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 מ"ג/מ"ל 10</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>KGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3103</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene "Mr. Frosty" מקפיא תאים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene PC צנצנות עם פה רחב צד ישר, 16 אונקיות</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>2116-0500</td><td></td></tr><tr><td>מס' 22 להבי נירוסטה סטריליים</td><td>BD Bard-Parker</td><td>371222</td><td></td></tr><tr><td>מס' 4 ידיות אזמל</td><td>מכשירי מחקר ביו-רפואיים</td><td>26-1200</td><td>בכוס עם 70% אתנול</td></tr><tr><td>זוג אחד של מלקחיים לתחבושת עיניים בעקומה מלאה</td><td>Militex</td><td>18-784</td><td>בכוס עם 70% אתנול</td></tr><tr><td>זוג מספריים אחד</td><td>מכשירי</td> <td>מחקר ביו-רפואיים25-1050</td><td>בכוס עם 70% אתנול</td></tr><tr><td>זוג מלקחיים לתחבושת אגודל</td><td>Militex</td><td>6-4</td><td>בכוס עם 70% אתנול</td></tr><tr><td>Oster Pro-Cord/גוזם אלחוטי מס' 40 Jarden</td><td>Consumer Solutions/Oster</td><td>78997-010</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי מפלסטיק 100 מ"מ x 20 מ"מ סטרילי</td><td>קורנינג</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>מותג פיירקס משפך זכוכית רגיל ללא גבעול</td><td>קורנינג</td><td>6240-75</td><td></td></tr><tr><td>חולדה IgG2akappa נוגדן בקרת איזוטיפ FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553929</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2akappa PE נוגדן בקרת איזוטיפ</td><td>BD Pharmingen</td><td>555844</td><td></td></tr><tr><td>SFM</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>10725-018</td><td></td></tr><tr><td>SMEM</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>11380-037</td><td></td></tr><tr><td>SMEM: Ca2+ ו-Mg2+ מדיום חיוני מינימלי בחינם לתרבית</td><td>מתלים Life Technologies Gibco</td><td>11380-037</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי מפלסטיק סטריליות מרובעות</td><td>BD פלקון</td><td>351112</td><td></td></tr><tr><td>עכבר שוויצרי 3T3 פיברובלסטים</td><td>ATCC</td><td>CCL-92</td><td>בשימוש בתוך 10 מעברים</td></tr><tr><td>טריאדין; 10% פובידון-יוד תמיסה מקומית, 16 אונקיות</td> קבוצת <td>טריאדות</td><td>10-8216</td><td></td></tr><tr><td>VWR צלחות פטרי מפלסטיק, סטרילי Space Saver 100 x 10</td><td>VWR</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>Williams E Medium</td><td>Life Technologies Gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>תיק</td><td></td><td></td><td></td> זיפלוק</tr></tbody></table>

בידוד של העכבר keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

הפרוטוקול המתואר כאן הוא שיטה אמינה של קצירת keratinocytes העיקרי מעכברים נקבה בוגרים (54 ± 2 ימים) מניב כ 30 x 106 תאים קיימא לכל עכבר. העכבר הראשי מבוגרים keratinocytes נקצרו מן העור החלק של עכברים נקבה. עכברים זכרים (~ 6 שבועות בן) ניתן להשתמש עבור קצירת keratinocyte בהתאם לדרישות של הניסוי. עכברים מורדמים הם מגולח ומעוקר עם שוטף סדרתי povidone יוד והאתנול פתרונות (70% אלכוהול). לאחר חיטוי העכברים, את העור העורמת מוסר את השומן התת עורי השריר מוסרים עם אזמל ומושלך. העורות חתוכים לחתיכות קטנות ומטופלים עם טריסיזציה קלה ונמוכה כדי לנתק את הדרסטיות הנמוכות מהאפידרמיס. Epidermises מגורד מעורבב במהירות נמוכה, מסוננים כדי להסיר את השערות, נספר, ו מחדש מושעה במדיום התרבות. שיטה זו מספקת תא השעיה מעולה יחיד של תאים מאוד מסוגלים לעבור יישומים רבים במורד הזרם.

בדרך כלל, תשואות של keratinocytes באפידרמיס לעכבר החל מ 20 x 106 כדי 30 x 106 טרילון כחול למעט תאים מתקבלים8,9. הכדאיות נעה בין 80%-90%. הקרינה האופיינית לזריעה הם סביב 30% מצורף 24 שעות ביממה. היווצרות המושבה על שכבות ממזין 3T3 הוקרן הוא סביב 60 מושבות לכל 1,000 תאים קיימא שנזרע עבור C57BL/6 עכברים, ו כ 30 מושבות לתאים 1,000 עבור עכברים מסוג שוויצרי10 ,11. התוצאות האופייניות ממערך המושבה מומחשות באיור 1. מספר תאי גזע שיער זקיק הוא כ 9% CD34+/cd49f+ תאי גזע עבור C57BL/6 עכברים12. תוצאות טיפוסיות מתוך הזרימה cy, מקבלים באיור 2.
מאפייני צמיחה של ארבעה מדיה שונים מומחשים באיור 3. התקשורת נבדקה כולל KGM-gold, SFM, המדיום E של ויליאם, ו-מוריס -2 (בינוני סידן מופחת שפותחה במעבדה מוריס מבוסס על ויליאמס E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig1.jpg"> איור 1: דוגמאות מייצגות מתוך שיטת הפעולה של מספר העכברים הבגירים. צילום זה מדגים את היווצרות המושבה keratinocyte מ-CD-1 עכברים נקבה 54 ימים של גיל שטופלו למריחה עם 1) אין טיפול, 2) אצטון ואחריו שבוע לאחר מכן על ידי אצטון פעמיים בשבוע במשך שבועיים, 3. DMBA שלאחר מכן שבוע לאחר מכן על ידי אצטון פעמיים בשבוע במשך שבועיים, 4) אצטון בעקבות שבוע לאחר מכן על ידי הסברתי פעמיים שבועי במשך שבועיים, ו-5) DMBA בעקבות שבוע לאחר מכן על ידי הסברתי פעמיים שבועי לשבועיים. לאחר שלהם טיפולים vivo, שנקטפו keratinocytes והזרע ב 1,000 תאים לכל מנה על שכבות מאכל של 3t3 הוקרן, ומתורבת במשך שבועיים, לאחר מכן הכלים היו קבועים עם פורמלין ומוכתם עם rhodamine B. הכלים בכל עמודה משכפל כל אחת מקבוצות הטיפול בעכבר. שים לב כי מספר מושבות גדולות גדל על הטיפול עם DMBA, ואת המספר הכולל של מושבות גדל הסברתי טיפול של העכברים לפני הקציר keratinocyte. קיצורים: DMBA: 7, 12-דימתילבנץ [a] פחם; הסברתי: 12-ו-טטרדאנולילפורובול-13-אצטט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig2.jpg"> איור 2: הדוגמה הנציגה של cy, להזרים הזרע של תאי גזע שיער מעכברים למבוגרים. בקצרה, keratinocytes הראשי מבודדים היו מבודדים מעור העכברים האלה מסוננים לפסולת תאית באמצעות מסנן התא. ההשעיה keratinocyte מבודדים היה מתויג עם CD49f או α6-אינטגרציה (PE) ו CD34 (FITC) נוגדנים יחד עם צבע חי מת ובקרות אחרות. השימוש בנוגדנים מסוג FITC ו-PE (Rat IgG2akappa) שימשו למטרת פיצוי (ראה טבלת חומרים). תאי גזע נבחרו באמצעות CD49f (PE ערוץ), אשר זיהה את הרכיב החיצוני של המי-desmosomes שנמצאו על בסיס באפידרמיס ובתאי זקיק השיער, ו CD34 (הערוץ FITC), אשר זיהה את תאי גזע השיער זקיק (כלומר, CD34-FITC+ ו-a6-PE+ (עמודה ימנית עליונה, סה כ 5%)). העמודה בצד ימין מראה את אוכלוסיות keratinocyte שונים כלומר CD34-FITC בלבד, CD34-FITC ו a6-PE תאים (כפול חיובי תא גזע האוכלוסיה), a6-PE בלבד, ותאים בלתי מוכתם. שים לב שיש שני CD34+ אוכלוסיות של תאי גזע כפי שדווחו6,14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58701/58701fig3.jpg"> איור 3: השוואה בין ארבעה מדיה שונים על התרבויות העיקריות של תאים באפידרמיס מפני עכברים נקבה מבוגרת. הkeratinocytes העיקרי היו מבודדים מהעור עכברים מעורבי ונספרו לזריעה באמצעות ארבעה מדיה שונים (KGM, SFM, וילם-E ומוריס -2). מספר שווה של keratinocytes הופרה ואחריו המבנה הכללי שלהם דפוס הצמיחה. שים לב keratinocytes מתרבים יש מעט שונה מורפולוגיות. KGM, SFM, ו-מוריס -2 כולם מופחת מדיה סידן יש את הצמיחה החזקה ביותר לאחר 14 ימים. לעומת זאת, התאים אינם ממשיכות כאשר מתורבתים במדיום E ויליאמס כי יש 1.4 מ"מ סידן ויחס גבוה של אשלגן כדי נתרן. באופן מפתיע, ויליאמס E בינוני עם תוספי ועשרים אחוז העובר סרום העוברי תומך בתרבויות שבטים keratinocyte הרבה יותר טוב מכל בינוני אחר נבדק, כנראה בגלל מועשר ויליאמס E בינונית מסייע התאים 3T3 המזין "להאכיל" טוב יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58701/58701fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פתרונות ומדיה</td>
			<td>ערות</td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרונות קצירת מזון</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2.5% טריפסין (5 מ ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>הערוץ הPBS של דולבוקו (500 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>גנאמיצין (2 מ ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS עם 2x הגברות (45 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>תמיסת מלח באגירה מפוספז (PBS) עם 2x בעלי בנייה</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>טריפסין תמיסה</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרונות לתרבות התאים</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל הציפוי-מענה:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M הפסי (1 מ ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>116 מ"מ CaCl2 (1 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>סרום של שור 1.0 mg/mL (10 מ"ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>בינונית תרבותית של תאים (100 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פיברוטין (1 מ ג)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>קולגן לנפיחות (1 מ ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פתרון הקפאת תא</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(2 מ ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dמאמ עם 10% BCS ו-עט-דלקת</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>קציר בינוני</td>
			<td>צריך להיות ללא סידן</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x שאמיאמצין (1 מ ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS (50 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>סמימ (500 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>התקשורת האלקטרונית של ויליאמס High-סידן עם:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF (5 μg/mL) 1 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>גלוטמין 14.5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>הידרוקורטיזון (1 מ"ג/mL) 0.5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>אינסולין 1 מ ל</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>לינאואסיד-BSA (0.1 mg/mL) 0.5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>חומצות אמינו 4 מ ל</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ויטמינים של הגברת 5 מ ל</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פניצילין-סטרפטומיצין 5 מ ל</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>העברת (5mg/mL) 1 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ויט A (1 מ"ג/1000 μL) 57.5 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vit E 1 mg/mL (4 ° צ') 3.5 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vit D2 (10 מ"ג/mL) 50 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3T3 פיברובלסט בינונית צמיחה מלאה (CGM)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>סינכרון BCS (100 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM (900 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פניצילין-סטרפטומיצין (10 מ"ל)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>KGM</td>
			<td>בינונית המשמשת לתרבות המונית היא בינונית-סידן מופחתת</td>
		</tr>
<tr>
<td>מוריס 2 בינוני עם תוספי אותו כמו ויליאמס ' E</td>
			<td>גרסה מופחתת של סידן של ויליאמס E עם תוספי</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מתכוני פתרונות ומדיה.

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד keratinocytes עוריות מן העור העורבי של עכברים מבוגרים עבור מגוון של יישומים במורד הזרם כגון ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה, מיון תא מופעל פלואורסצנטית, ו העיקרי בשימוש בלתי מתורבת (למשל, clonogenic keratinocytes).

בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

השיטה שלנו לקצירת תאי אפידרמיס מעכברים בוגרים שימושית עבור יישומים במורד הזרם כגון תאי גזע keratinocyte. הטכניקה שלנו ניתנת לשחזור מאוד ו ניתן להשתמש בה בשילוב עם הליכים in vivo בעכברים בהקשר של מודל מסרטנים העור. לאחר קצירת דגימות עור הגב מעכברים בוגרים שעברו המתת דם, השתמש במלקחיים אוטוקלאבים ואזמל כדי למקם עור דורסי אחד בכל פעם בצד שעיר למטה לתוך צלחת פטרי דקה ולגרד את הרקמה התת עורית כולל השומן מרקמת העור הגחוני עד הרקמה היא שקופה למחצה.מניחים את העור שרוט PBS עד כל העורות הנותרים האחרים מעובדים. לאחר מכן השתמש אזמל לחתוך את דגימות העור לתוך 0.5 על ידי אחד עד 1.5 ס"מ רצועות. מניחים את הצד השעיר של הרצועות בצלחת פטרי סטרילית לפני שהם צפים את הצד השעיר של הדגימות על פני השטח של PBS 20 מיליליטר בתוספת שני תמיסת ג'נטמיצין x, בתוספת 0.25% טריפסין בצלחת פטרי פלסטיק 100 על 20 מילימטר במשך שעתיים ב 32 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, מניחים צלחת פטרי סטרילית, מפלסטיק, מרובעת המכילה 15 מיליליטר של מדיום קציר ב שיפוע של 30 מעלות ולהשתמש במקלות מעוגלים כדי להעביר בזהירות רצועת עור צפה לתוך המנה. החזקת להב אזמל חדש בזווית ניצבת לעור ושימוש בכוח מספיק אך לא מוגזם, לגרד את האפידרמיס ואת השערות מן המדגם לתוך המדיום. כאשר כל הרצועות כבר גירד, בזהירות decant התא האפידרמלי המכיל supernatant לתוך צנצנת סטרילית 60 מיליליטר המכיל 1.5 אינץ ' מגנטי מערבב בר ולשטוף את צלחת פטרי עם מדיום קציר נוסף כדי לאסוף את כל התאים האפידרמיס שנותרו.מביאים את הנפח הסופי בצנצנת ל-30 מיליליטר עם מדיום טרי, ומערבבים את תמיסת התא האפידרמיס ב-100 סיבובים בדקה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה המרגשת בארון biosafety להסיר את בר מערבב ולסנן את פתרון התא דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. השתמש ממטרות ולאחר מכן פיפטה ללחוץ על השערות ואת חומרי הקרנית שכבה דרך מסננת כדי לתפעל את הרקמה כדי לשחרר את תאי השיער לכודים ולהשתמש חמישה מיליליטר נוספים של מדיום קציר לשחרר את תאי השיער לכודים שנותרו לתוך הצינור.זה קריטי כי תאי האפידרמיס ואת השערות הם מניפולציה כדי לשחרר את התאים זקיקי השיער. להביא את הנפח הכולל בצינור עד 50 מיליליטר עם מדיום טרי ולאסוף את התא לסינון על ידי צנטריפוגה. תן מחדש את גלולה ב 5 מיליליטר של מדיום קציר טרי על 20 triturations עם פיפט 5 מיליליטר.קח 0.5 מיליליטר של אחד עד 20 דילול ולהעביר אותו לצינור microfuge 2 מיליליטר. לאחר ערבוב הדגימה בזהירות, יש ליטול 200 מיקרוליטרים מצינור המיקרופוג' ולערבב בעדינות עם נפח שווה של 0.4% פתרון כחול טריפאן. מערבבים בעדינות פתרון זה שלוש פעמים ומעבירים את התאים להמוציטומטר לספירת קרטינוציטים גרעינים.ציון כל התאים הכחולים הכהים כמו תאים שאינם ניתנים לשימוש ציון תאים קטנים זהב ורדפל כמו תאים קיימא. ממוצע הכדאיות הוא כ-80%, ותפוקת הקרטינוציטים הסופית לעכבר צריכה להיות כ-30 מיליון תאים בני קיימא. לאחר הספירה, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת, ועל תרבות ההמונים resuspend פעמיים עד ארבע פעמים 10 כדי keratinocytes קיימא השישי לכל 35 צלחת פטרי מילימטר ב 2 מיליליטר של מדיום תרבות התא.עבור מקדם היווצרות מושבה clonogenic, resuspend התאים באחת פעמים 10 כדי keratinocytes השלישי לכל ארבעה מיליליטר של שונה ויליאם E מדיום עם תוספי תזונה בריכוז סרום לכל קולגן מצופה 60 מילימטר צלחת פטרי על רנטגן מוקרן עכבר שוויצרי 3T3 שכבות הזנה. לתרבות ההמונים, לגדל את התרבויות ב 32 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני לתקופה המתאימה תרבות התא. שינוי המדיום 24 שעות לאחר הזריעה הראשונית לתרבות ההמונים ושלוש פעמים בשבוע לאחר מכן.בסוף תרבות השיבוטים שאפו את המדיום ותקן את המושבות בפורמלין 10% במהלך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, להכתים את המושבות עם 0.5% rhodamine B במים autoclaved במשך שעה אחת, לפני שטיפה את הכלים במים אוטוקלאבים קרים עד המים זורמים צלולים. ואז לשים את הכלים על העפעפיים שלהם להתייבש לפני ספירת המושבות.כאן, תוצאות אופייניות של keratinocyte המושבה היווצרות משגיח לאחר טיפולים אקטואליים שונים מוצגים. תאי גזע זקיקי השיער בדרך כלל לפצות כ 9% של התאים מבודדים עור עור הגב בוגר C57BL/6 העכבר כפי שהוערך על ידי כתמים ציטומטריים זרימה עבור סמני תא גזע זקיק שיער העכבר. בנתון זה ניתן לראות את מאפייני הצמיחה של מושבות תאי גזע קרטינוציטים לאחר תרבות בארבעה תנאים בינוניים שונים.בעקבות הליך זה, התאים יכולים לשמש עבור ציטומטריית זרימה, מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, תרבות תאים וניתוחים ביולוגיים מולקולריים. טכניקה זו אפשרה לנו לקבוע כי מספר תאי גזע אפידרמליים הוא תכונה כמותית ומורכבת המובילה לזיהוי גן רגולטורי חדש של תאי גזע.

isolation-mouse-epidermal-keratinocytes-their-vitro-clonogenic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדרך המהירה, החזקה של בידוד קיימא גזע בוגרים לתאי האפיתל של העור האנושי הוא תיאר. השיטה משתמשת עיכול אנזימטי של מטריקס הקולגן בעור, ואחריו מריטת זקיקי השיער ובידוד של המתלים תא בודד או שברי רקמה תרבית תאים.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

ניתוח רקמות ספציפית של מודל התחדשות זקיקי שיער באמצעות lentivirus לתווך רווח או פסד--of-פונקציה.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

סרטון זה מתאר את בידודם של קרטינוציטים – התאים הבולטים ביותר בשכבת האפידרמיס של העור האנושי, על ידי שימוש בשילוב של עיכול אנזימטי ושיטות שיבוש מכני. שיטה זו מסייעת בצמיחה מועדפת של קרטינוציטים על פני סוגי תאי עור אחרים באמצעות מדיום גידול סלקטיבי.

בידוד קרטינוציטים בעור האדם: שיטה לתרבית קרטינוציטים ראשוניים מדגימות עור

בסרטון זה אנו מבצעים בדיקה קלונוגנית של קרטינוציטים שנקצרו מעכברים בוגרים כדי לקבוע את יכולתם של תאים בודדים להתרבות וליצור מושבות. טכניקת קצירת קרטינוציטים זו שימושית לחקר היבטים אחרים במורד הזרם של קרצינוגנזה כימית עורית וקידום גידולים.

בדיקת היווצרות מושבות קרטינוציטים: בדיקת מבחנה להערכת יכולתם של קרטינוציטים לגדול למושבות

מודל אידיאלי לחקר ביולוגיה של תאי גזע בוגרים הוא זקיק שיער העכבר. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אוכלוסיות שונות של זקיקי שיער, תאי גזע וקרטינוציטים אפידרמיסיים, תוך שימוש בעיכול אנזימטי של עור הגב של העכבר ואחריו ניתוח FACS.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

אפידרמיס keratinocytes טופס מחסום עור פונקציונלי ממוקמים בקו הקדמי של ההגנה המארחת נגד עלבונות סביבתיים חיצוניים. כאן אנו מתארים שיטות לבידוד ואת התרבות העיקרית של keratinocytes אפידרמיס עור ניאונטלי ומבוגר העכבר, אינדוקציה של בידול מסוף ותגובה דלקתית מופעלת UVB מ keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבודד ביעילות keratinocytes האדם העיקרי של רקמות העור למבוגרים. שיטה זו מפשטת את הפרוצדורה המקובלת על-ידי שימוש Y-27632 מעכב את רוק המדיום חיסון להפריד באופן ספונטני תאים אפידרמיס מתאי עורי.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד keratinocytes העור מדגמי העכבר, כדי להכתים עם מתכת מתויג נוגדנים, ולנתח תאים ויטראז על ידי cy, try המונית כדי לפרופיל את דפוס הביטוי של חלבונים של עניין בשלבים שונים מחזור התא.

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיפוח שיטתי של כדורי אפידרמיס בתרבות השעיה תלת-ממדית. פרוטוקול זה כולל יישומים נרחבים לשימוש במגוון סוגי רקמות אפיתל ולדוגמנות של מספר מחלות ותנאים אנושיים.

הקמת מערכת תרבית אפידרמיס כדורית בעלת תפוקה גבוהה למודל פלסטיות תאי גזע קרטינוציטים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבות של קרטינוציטים אוראליים הנגזרים מחך העכבר הבוגר. כמו כן, דווח על שיטת הערכה באמצעות חיסונים.

בידוד ותרבות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מחך העכבר למבוגרים

המחקר של ריפוי פצעים הקשורים לפגיעה בשרירים-שלד דורש לעתים קרובות הערכה של אינטראקציות במבחנה בין תאי שוואן (SCs), קרטינוציטים ופיברובלסטים. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאים ראשוניים אלה מהעורלה האנושית.

בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

למדו שיטה לבידוד קרטינוציטים אפידרמליים מעור עכברים בוגרים ליישומים במחקר תאי עור וקרצינוגנזה. הטכניקה מייצרת כ-30 מיליון תאים חיים עם שיעור הישרדות של כ-80%.

בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

גלה סרטונים נוספים