רביב Transcriptomics מבוססי Barcoding תא בודד של רקמות בוגרות יונקים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון הבנת שינויים בביטוי גנים על פני אלפי תאים בודדים לאחר פציעה או מחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לנתח תמלילים של תאים בודדים בתוך רקמה מורכבת, ולהעריך טוב יותר את הדינמיקה התפקודית בתוך אוכלוסייה נתונה. היתרון של הפרוטוקול שלנו הוא שהוא מספק שיטות מקיפות, מבידוד של תאים בודדים ברקמות ראשוניות, לניתוח והדמיה של ערכת נתונים זו.

למרות שיטה זו מתחילה מתלים חד-תאיים מהעור ומהעצב, ניתן ליישם את שיטות רצף שאנו מתארים כדי לחקור כל רקמת יונקים. הדגמת הליך זה יהיה אלודי Labit, ו Wisoo שין, שני חניכים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לנתח את העצב הסיאטי של עכבר המתת חום על ידי תחילה חיתוך העור הרחק מהאזור האחורי של החלק האחורי של העכבר.

השתמש בלהב אזמל סטרילי לעשות חתך לאורך הירך. לאחר מכן השתמש מלקעות ומספריים עדין כדי לחשוף ולהסיר את העצב הסיאטי. כדי לנתח את העור האחורי הגבי, השתמש במקלפים וב מספריים עדין כדי לבצע חתכים מכתף לכתף, על פני העכוז, ולמטה מאחור.

לשטוף את הרקמות פעמיים עם HBSS קר כקרח. תחת מיקרוסקופ ניתוח, הסר רקמת חיבור לא רצויה, מרבצי שומן או פסולת. לעור בלבד, חותכים את העור לפרוסות דקות, באמצעות להב אזמל סטרילי.

כדי להשיג את עור הדרמיס, לצוף את פרוסות העור ב dispase, ב HBSS בצלחת 10 ס"מ, במשך 30 עד 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש מדפים עדין לקלף ולהפריד את האפידרמיס מן הדרמיס, ולאחר מכן להשליך את האפידרמיס. לאחר מכן, לעור ולעצבים, השתמשו בזוג להבי אזמל סטריליים כדי לטחון כל דגימה לחתיכות של מילימטר אחד עד שניים.

מניחים את חתיכות הרקמה לתוך מופשר טרי, שני גרם לכל מיליליטר קולגנס קר ארבע אנזים בצינור חרוט 15 מיליליטר. דגירה כל מדגם באנזים באמבטיה 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם רעידות עדינות כל 10 דקות. ב 30 דקות, להשתמש pipetter P1000 כדי triturate הרקמה 20 עד 30 פעמים, ולחזור לאמבט המים.

חזור על טריטורציה כל 30 דקות עד שהפתרון נראה מעונן, וגושים של רקמה הם ניתו במידה רבה. לעור בלבד, בשעה האחרונה של הדגירה, מוסיפים מיליגרם אחד למיליליטר DNAse לדגימה של העור. מאז כמה סוגי תאים רגישים יותר מאחרים ללחץ מכני, טכניקות דיסוציאציה מוגזמת יכול להטות את האוכלוסייה שלך.

דיסוציאציה כללית היא קריטית להשגת תשואות תאים גבוהות, וייצוג מדויק של הרכב רקמות. לאחר מכן, השתמש במסנן 40 מיקרומטר על גבי צינור חרוט 50 מיליליטר כדי לסנן כל דגימת רקמה פעמיים. שטפו את המסנן באחוז אחד של BSA/HBSS.

לאחר צנטריפוגה הדגימות כמתואר בכתב היד, להשעות מחדש את גלולת התא ב HBSS, המכיל אחוז אחד BSA, באמצעות קצה רחב נשא, ומקום על קרח. תוספת של צבע הכדאיות יעזור לך לייעל את ההכנה שלך. אתה צריך לכוון לפחות 80 אחוז תאים קיימא.

לאחר אופטימיזציה, זה וצעדים אחרים בקרת איכות ניתן להשמיט על מנת לזרז את תהליך הדיסוציאציה, אשר ישמור טוב יותר על איכות RNA ולהפחית את אובדן התא. כדי לבודד תאים בני קיימא ובריאים באמצעות FACS, הכינו תחילה צינורות צרים-תחתונים ב-15 מיליליטר עם שמונה מיליליטר של קר כקרח באחוז אחד של BSA/HBSS לאוספים לדוגמה. כדי להבטיח כי הממשק בין פני השטח של הנוזל ואת החלק הפנימי של הצינור הוא לח, כדי למנוע מתח סטטי פני השטח, להפוך את הצינורות לפני אוספים.

מיד לאחר מיון התאים FACS, לאחר התאים נאספים בצינור 15 מיליליטר, להשתמש מיליליטר אחד של אחוז אחד BSA / HBSS לשטוף ולדחוף את כל התאים למטה מפני השטח הצדדיים של הצינור. ואז צנטריפוגה כל מדגם ב 260 גרם במשך שמונה דקות. לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את גלולת התא באחוז אחד BSA / HBSS, ולהוסיף 33.8 microliters לצינור, ולשמור את הצינור על קרח.

שלב זה נועד להיעשות באמצעות רייגנטים המתקבלים מערכת מתוקקנת. יש לבצע את כל השלבים שהוכחו בהתאם להוראות היצרן. כדי להתכונן לדור GEM, מניחים שבב במחזיק השבב, להכין תערובת אב תא על קרח, על פי פרוטוקול היצרן.

הוסף 56.2 microliters של תערובת האב לצינור המכיל 33.8 microliters של השעיה עצמית. כדי להכין את השבב, תחילה ב 50 אחוז גליצרול ל בארות שלא ישמשו. לאחר מכן להוסיף 90 microliters של תערובת אב התא גם אחד, 40 microliters של חרוזי ג'ל גם שתיים, ו 270 microliters של שמן חלוקה לגם שלוש.

כסו את השבב עם אטם. כדי לטעון את השבב ולהפעיל בבקר תא יחיד, להוציא תחילה את המגש. שים את השבב במגש.

משוך את המגש ולחץ על הפעל. לאחר הריצה המלאה, לאסוף 100 microliters של המדגם, ולמקום בצינור PCR. מקם צינורות PCR במכונת PCR מוגדרת מראש, ופעל בהתאם להערכה.

לאחר הריצה, GEMs יכלול באורך מלא, cDNA ברקוד, מ mRNA polyadenylated. מניחים את הצינורות במינוס 20 מעלות צלזיוס לילה. המשך בבניית ספריה, רצף, יישור וניתוח.

לאחר שהדגימות רצף מיושר כמתואר בכתב היד, להפקיד את הנתונים על מאגר ציבורי, כגון GEO של NCBI. לשם כך, הירשם לחשבון השולח. תחילה, השלם את שליחת GEO על-ידי הורדת גליון המטה-נתונים.

הקפד לכלול גליון מטה-נתונים אחד בלבד לכל שליחה של פרוייקט. מקם את הגיליון האלקטרוני בספריה. שנית, הוסף את קובץ הנתונים הגולמי שנוצר מקובץ ה- Script של ספירת טווחי התאים עבור כל הספריות לספריה.

התיקיה השלישית היא קבצי נתונים מעובדים. מקם קבצי נתונים מעובדים שנוצרו מקובץ Script של ספירת טווחי תאים עבור כל הספריות בספריה. השתמש באישורי שרת FTP של שולח GEO כדי להעביר את הספריה המכילה את כל שלושת הרכיבים.

לאחר הפעלת Cell Ranger, ניתן לעבד עוד יותר מטריסות ברקוד גנים מוכנות לניתוח באמצעות ביואינפורמטיקה מתקדמת. ראשית, בדיקות כמות טרום עיבוד נעשו באמצעות חבילת Seurat R, שיצרה חלקות כינור ופזר כדי לדמיין את מספר הגנים, מספר המזהים המולקולריים הייחודיים ואחוז הגנים המיטוכונדריים לזיהוי מכפילי תאים וחריגים. לבחירת הרכיבים העיקריים, או המחשבים, נעשה שימוש בחלקות מרפק, שבהן לא נכללו מחשבים מעבר לרמה של סטיית התקן של ציר המחשב.

גם ההחלטה על קיבוץ באשכולות הייתה מניפולציה. רזולוציה נמוכה הובילה לפחות אשכולות תאים, כאשר סביר להניח שכל אשכול מייצג סוג תא מוגדר. רזולוציה גבוהה הובילה להסתברות תאים גבוהה יותר, המייצגת סוגי משנה, או מצבי מעבר, של אוכלוסיית תאים.

הגדרות אשכול ברזולוציה נמוכה שימשו לניתוח נוסף של מפות חום ביטוי כדי לזהות את הגנים המובעים ביותר באשכול נתון. גנים של מועמדים בודדים הוצגו על חלקות tSNE, תוך שימוש בפונקציית העלילה התכונתית של Seurat, שאיפשרה פענוח, בין אם היו אשכולות שייצגו, למשל, מקרופאגים. הן אשכול 2 והן ארבעה מבוטא CD68, סמן pan-macrophage.

חבילות אחרות מספקות גם כלים לבקרת איכות, לדוגמה, Monocle, חבילת R המשמשת לבניית מסלולי תאים, מסירה תאים באיכות ירודה ומבטיחה שהתפלגות ה- mRNA בכל התאים תיווך כרגיל, ותפול בין הגבול העליון והתחתון. תאים בודדים סווגו ונספרו אז, תוך שימוש בגנים ידועים של סמן שושלת, ותאים המבטאים סמנים מעניינים הוקצו לסוג התא מספר אחד. נקבע כי סוג תא מספר אחד היו פיברובלסטים.

אוכלוסייה זו הוערכה לבנות מסלול התפתחותי fibroblasts. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו PCR כמותי, בהכלאה situ, כימיה חיסונית צריכה להתבצע כדי לאמת את הדיוק של תוצאות ביטוי הגנים שלך. רצף mRNA חד-תאי סלל כעת את הדרך לחוקרים בתחומים רבים ושונים לחקור את ההטרוגניות של התא לתא, ולזהות דינמיקה תפקודית בתוך רקמות שונות במהלך הונוסטזיס, וכיצד אלה עשויים להשתנות לאחר פציעה או בהתפתחות המחלה.