Name: הרומן תהליך הדפסת תלת-ממד Decellularized מטריצות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: למדו שיטת הדפסת תלת-ממד משולבת ליצירת פיגומי הנדסת רקמות המשלבים PCL ומטריצות מופרדות מתאים מסחוס חזיר. טכניקה זו מאפשרת יצירת מבנים מכניים יציבים התומכים בגידול תאים ללא פגיעה בחומר הביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט מומן באופן חלקי על ידי מענק מ רפואת ילדים אורטופדיים החברה של צפון אמריקה (POSNA) ולהעניק מכוני הבריאות הלאומיים NIBIB R21EB025378-01 (מענק מחקר בביו-הנדסה גישוש).

1. קבלת ו Preprocessing Microspheres
<ol><li>תוצרת microspheres עם המטריצה הרצוי אנקפסולציה (PLA-מיט)2. הערה: זה הכרחי כי microspheres הם בגודל אחיד. מסיבה זו, ניפוי המנזר microspheres לשימוש חיוני. למרות decellularization מטריקס וכימוס יש כבר מפורט פרסומים קודמים2, להלן סיכום קצר של התהליך.<ol>
<li>ראשית, למסוק את הסחוס פקקים של הגפיים האחוריות חזירי. Decellularize הסחוס בסדרה של שוטף עם 0.05% טריפסין/0.5 מ מ tetrasodium ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), המתואמת Dulbecco של הנשר בינוני (DMEM) ו- 1.5% חומצה peracetic ו- 2.0% טריטון X-100 במשך 4 שעות כל אחד עם מים מזוקקים שוטף לפני ואחרי כל שלב2.</li>
		<li>מסננים את המטריצה decellularized, תקפיא את התמונה, lyophilize, לטחון, להמיס בתוך תמיסת פפסין. בעקבות פירוק, מערבבים את הפתרון פפסין עם פלה אשר מומס דיכלורומתאן.</li>
		<li>להוסיף את התערובת dropwise 3% אלכוהול בתמיסה של מים. Centrifuge microspheres וכתוצאה מכך, שטיפה, ניקוז, lyophilize שוב. הערה: לקבלת פרטים מלאים על התהליך ראה את פרוטוקול שפורסמו בעבר2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניפוי microspheres.<ol>
<li>להבטיח כי כל הצלחות מסננת נוקו ביסודיות, יבשים לפני השימוש. אם נחוץ, נקי sieves באמצעות אולטראסאונד מנקה כדי להבטיח כי בכל התחומים יוסרו המסננת.</li>
		<li>להרכיב את המסננת בשייקר עם המגש מסננת מיקרומטר 106 בחלק העליון, המגש מיקרומטר 53 אחרי זה, וגם המסננת פאן בחלק התחתון.</li>
		<li>מקום יבש microspheres במגש העליון מסננת ומניחים את המכסה על המגש העליון. הפעל ניפוי גס במשך 8 עד 10 דקות חוזר בסדר למשך 8-10 דקות. הערה: טיימס מסננת ייתכן שתצטרך להיות גדל או קטן בהתאם האצווה.</li>
		<li>בזהירות להסיר את הלוחות מסננת אחד ולמקם אותם במהופך על נייר שוקלים גדולים. הקש על הצדדים בעדינות כדי להבטיח כי רוב הכדורים נפלו מתוך המסננת, על הנייר.</li>
		<li>למחוק את הכדורים מנופחים (> 106 מיקרומטר), מוחקים הספירות (< מיקרומטר 53). הוספת ספירות הן בטווח גודל 53 ל 106 מיקרומטר כדי שפופרת צנטרפוגה שכותרתו עם מספר אצווה וסוג ומניחים במקפיא-20 ° C עד להמשך השימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הערכות בקרת איכות ננו-ספירה
הערה: ראה איור 1.
<ol><li>ביצוע הערכת מאקרוסקופית-ויזואלית כדי לבדוק כי microspheres הם מדים כדורית, עם אין אגרגטים הנוכחי.</li>
	<li>להעריך את microspheres באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM).<ol>
<li>בשביל זה, המקום microspheres על גבי SEM צ'אק, להתיז בחוטי זהב-פלדיום באווירה ארגון באמצעות עם coater לרעוד. להוציא לעובי 4 nm.</li>
		<li>ציית תכונות פני השטח, מורפולוגיה, קטרים של microspheres באמצעות 10 kV האצת מתח ומרחק עבודה 10 מ מ כדי להבטיח את הייצור, ניפוי של microspheres היה מוצלח.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. נימה יצירה עבור הדפסת תלת-ממד
<ol><li>שיא, מדידת המסה של microspheres המתקבל שלבים 2 ו- 3; יש צורך לפחות 25 גרם.</li>
	<li>להוסיף אבקת polycaprolactone (PCL) microspheres עבור יחס משקל 1:4 של microspheres כדי PCL.</li>
	<li>לערבב את תערובת אבקה על מיניאטורי מתגלגל מערבל-סל ד 20 למשך 5 דקות ולאחר מכן להפוך את המיכל ומערבבים ב rpm 20 עבור 5 דקות נוספות (ראה איור 2).</li>
	<li>רבים extruders זמינים מסחרית (ראה את הטבלה של חומרים) יש מעילים בידוד כיוון טמפרטורות עבודה המיועד שלהם הם עבור התצהיר מאוחה מסורתי דוגמנות (FDM) חוטים. לשנות את מכבש (במקרה הצורך) על-ידי הסרת החומר בידודית, להשתמש בו בשילוב עם מאווררים שולחניים (אשר לנשוף אויר extruder ועל פילמנט מעוקם) לשימוש של המתקן בטמפרטורות נמוכות. הערה: מאווררים שולחניים אשר לנשוף אויר כדי לקרר את מכבש ואת הלהט שימושיים עבור הליך זה.</li>
	<li>תוכנית ההתקנה ההתקנה ציוד לשחול. ראו איור 3.<ol>
<li>תוכנית ההתקנה המתקן כך שקע שלה היא ~ 60 ס מ מן הים למנגנון ההדפסה ברקע, עם נתיב ישיר מהשפך ההבלטה לים ברקע. הערה: מנגנון יכולים באופן אופציונלי לגדול 3-4 ס מ מהספסל אם יימצא כי הסיב הוא שמוט עד לנקודה של נגיעה benchtop.</li>
		<li>למקם מאוורר שולחני ~ 15 ס מ הז'קט חימום וישיר אותו לעבר הז'קט חימום להציע קירור עם אויר לאורך כל פילמנט הייצור. מקום למאוורר הקירור השנייה בערך באמצע הדרך בין extruder ברקע, להפנות. את זה לכיוון extrudate כדי לסייע קירור הלהט עם אויר.</li>
		<li>להתאים את מיקום כנדרש לאורך כל התהליך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדרת המתקן ששונה חימום רכיב 52 ° C, להפעיל את שולחן העבודה קירור האוהדים, ולאפשר המכשיר לבוא שיווי משקל במשך 20-30 דק. ודא כי הצינור המתאים מחובר אל המתקן.</li>
	<li>לפני ההתחלה, מלא הופר extruder עם התערובת ננו-ספירה/PCL מהשלב 3.3. להפעיל את מנגנון ההדפסה ברקע, אוז'ה extruder ליזום ההבלטה של נימה.</li>
	<li>כאשר חוט הלהט הראשוני הנמתח, באופן ידני למשוך את extrudate מהשפך ההבלטה עם מלקחיים ואאכיל אותו מנגנון נימה.</li>
	<li>חוט הלהט הרצוי ייקח קצת זמן לצאת מנגנון ההדפסה ברקע. באמצעות מאגרים נפרדים או קלטת, בבירור לסמן כאשר הרכב פילמנט חזותית מופיע אחיד.</li>
	<li>לפקח מקרוב על התהליך ולשנות פרמטרים לפי הצורך. התאם את מכבש חום ההבלטה אוז'ה מהירות, מהירות ההדפסה ברקע כדי להשיג 1.75 מ מ קוטר פילמנט כפי שהיא נמדדת מחוגה. להתאים את האוהדים לפי הצורך כדי לקרר את הסיב כראוי כדי למנוע חתכים פילמנט שאינו עגול. לערבב ולמלא את הופר לפי הצורך. הערה: תשומת לב נדרש במהלך תהליך זה כדי להשיג פילמנט נאותה להדפסה תלת-ממד עוקבות. הפרמטרים לעיל ישתנה בהתאם לתנאי הסביבה, מילוי רמת אחידות של תערובת במכרז, תרמודינמיקה וזרימה דינמיקת קבוצות ספציפיות של PCL, microspheres.</li>
	<li>המשך הבלטת ממד עד כל האבקה שימש הופר הוא כמעט ריק. להוסיף אבקת PCL (ללא microspheres) הופר לחשוף את התערובת ננו-ספירה שנמצא כעת בתוך המתקן. המשך להוסיף אבקת PCL כדי הופר עד לא microspheres יותר גלויים ב- extrudate.</li>
	<li>הקפד לתייג והוא נפרד הסיב אשר מכיל את microspheres בריכוז הרצוי, כמו לאחר הסיב הוא מקורר זה קשה יותר להבחין בין חוט הלהט אחיד לבין נימה לא אחידה.</li>
	<li>המשך הבלטת ממד עד שיש אבקת מינימלי עזב במכרז, ולאחר מכן כבה את מנגנון ההדפסה ברקע, אוז'ה extruder, גוף החימום extruder, ואת האוהדים.</li>
</ol>4. הדפסה עם נימה
<ol><li>עיצוב גיאומטריית הצורה הרצויה וליצור משתמש במחשב בעזרת תוכנת עיצוב. לאחר מכן לחתוך את הדגם, להכתיב את toolpath באמצעות תוכנה עם פרוסות התואמת מכונת הדפסה 3D בשימוש.</li>
	<li>לטעון את הסיב משלב 3 על גבי כל מדפסת FDM סטנדרטי, מצוידים עם חרירי סטנדרטי לקוטר הרצוי (בדרך כלל 0.4 מ מ). מתחילים את הקטנות (בדרך כלל 65-70 ° C ו-300 מ מ/דקה מהירות קווית) נימה אישית הוא הפקיד--שכבה על ע י המכונה.</li>
	<li>ודא להקדיש תשומת לב מיוחדת השכבה הראשונה ולהתאים הגדרות לפי הצורך כדי לקבל הדפסה באיכות טובה. הערה: ניתן לבצע התאמות מהירות הדפסה, הדפסה טמפרטורה, פלטפורמה טמפרטורה, מכפיל ההבלטה של פרמטרים אחרים. עיין המדפסת ומדריך לפתרון בעיות עם פרוסות של היצרן לקבלת סיוע נוסף.</li>
</ol>5. בקרת איכות הערכה
<ol><li>למקם את המבנה מודפס ב- SEM חריטה, להתיז בחוטי זהב-פלדיום באווירה ארגון באמצעות עם coater לרעוד. להוציא לעובי 4 nm.</li>
	<li>להתבונן במיקרוסקופ באמצעות 10 kV האצת מתח ומרחק עבודה 10 מ מ לבדוק תכונות פני השטח עבור נוכחות או היעדרות של microspheres אם הוא ישים.</li>
</ol>6. בדיקות פונקציונליות של המבנה מודפס
הערה: phosphatase אלקליין (ALP) יכול לשמש פונדקאית עבור מטריצה decellularized כדי לקבוע אם חלבונים שעברו אנקפסולציה הם פעילים ביולוגית לאחר תהליך הייצור נימה. ALP משמש כי זה מזרז תגובה מצע, p-nitrophenyl פוספט, כדי לשנות צבע צהוב תוצרי לוואי, p-nitrophenol, פוספט אורגניים, אבל רק אם ALP קונפורמציה פונקציונלי.
<ol><li>להדפיס גיאומטריה (n = 3) יש לזה של מסה קצה לפחות 400 מ"ג עם חוט הלהט ננו-ספירה ALP (PLA-ALP/PCL) באמצעות פרמטרים ההדפסה זהה כמו פיגומים PLA-DM/PCL. גם להדפיס PCL-היחידה (PCL(-)) פיגומים של הגיאומטריה אותו כמו פיגומים PLA-ALP/PCL. להטביע אותם במאגר טריס-HCl 1 מ"ל, תקופת דגירה של 24 שעות ביממה-סיבוב 37 ° C ו 110 סל ד כדי לאפשר דיפוזיה אנזים.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל p-nitrophenyl פוספט, ניתרן hexahydrate, טריס-HCl. Incubate ב 37 מעלות צלזיוס, 110 סל ד עבור מתכוון 10 נוספים לקרוא את ספיגת supernatant-415 ננומטר.</li>
</ol>

<ol><li>Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -T., Leahy, J. C. <a target="_blank" href="https://www.astm.org/DIGITAL_LIBRARY/STP/PAGES/STP15307S.htm">Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone.</a> Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).</li>
<li>Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -Y., Whitlock, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29394158">Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold.</a> Biofabrication. , (2018).</li>
<li>Partington, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+changes+caused+by+decellularization+may+compromise+mechanical+integrity+of+tracheal+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).</li>
<li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11071603">Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage.</a> Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).</li>
<li>Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+biodegradable+lumbar+interbody+fusion+cage+design+and+fabrication+using+integrated+global-local+topology+optimization+with+laser+sintering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering.</a> Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).</li>
<li>Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00158-010-0508-8">Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity.</a> Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).</li>
<li>Lin, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+bone+engineering+using+ex+vivo.+gene+therapy+and+topology-optimized%2C+biodegradable+polymer+composite+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds.</a> Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).</li>
<li>Lin, C. -Y., Hsiao, C. -C., Chen, P. -Q., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interbody+Fusion+Cage+Design+Using+Integrated+Global+Layout+and+Local+Microstructure+Topology+Optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization.</a> Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).</li>
<li>Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioresorbable+Airway+Splint+Created+with+a+Three-Dimensional+Printer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer.</a> New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).</li>
<li>Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornamenting+3D+printed+scaffolds+with+cell-laid+extracellular+matrix+for+bone+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration.</a> Biomaterials. 37, 230-241 (2015).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+interface+microstructure+on+interfacial+shear+strength+for+osteochondral+scaffolds+based+on+biomimetic+design+and+3D+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering+C%22%5BJournal%5D)">The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing.</a> Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).</li>
<li>Williams, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15763261">tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering.</a> Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).</li>
<li>Monibi, F. A., Cook, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Derived+Extracellular+Matrix+Bioscaffolds%3A+Emerging+Applications+in+Cartilage+and+Meniscus+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).</li>
<li>Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Host+Immune+Response+to+Tissue-Engineered+Organs%3A+Current+Problems+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).</li>
<li>Sutherland, A. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Microsphere-Based+Scaffolds+Containing+Decellularized+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage.</a> Macromolecular Bioscience. , (2015).</li>
<li>Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naturally+derived%2C+cytocompatible%2C+and+architecturally+optimized+scaffold+for+tendon+and+ligament+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration.</a> Biomaterials. , (2007).</li>
<li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclic+strain+on+tensile+properties+of+a+naturally+derived%2C+decellularized+tendon+scaffold+seeded+with+allogeneic+tenocytes+and+associated+messenger+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+surgical+orthopaedic+advances%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression.</a> Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).</li>
<li>Whitlock, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+process+for+optimizing+musculoskeletal+allograft+tissue+to+improve+safety%2C+ultrastructural+properties%2C+and+cell+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+-+Series+A%22%5BJournal%5D)">A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration.</a> Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).</li>
<li>Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21362080">Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment.</a> Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).</li>
<li>Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li>
<li>Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+kidneys+as+a+source+of+ECM+scaffold+for+kidney+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering+C%22%5BJournal%5D)">Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration.</a> Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).</li>
<li>Dean, R. L. <a target="_blank" href="https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/bmb.2002.494030060138">Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

שניהם decellularized מטריצות, פיגומים PCL מודפס 3D הוכחו באופן עצמאי כדי לאפשר הדבקה ותיקון התפשטות של תאים, אימות והשימוש osteochondral10,11,12. השימוש של מטריקס decellularized ב גישות הנדסת רקמות תיקון היה נושא של עניין הרבה הצלחה של האחרונים עברו2,3,14,15. בעבר שציינו את ההעברה מוגברת, אדהזיה, התפשט...

טכניקות הנדסה הנוכחי של רקמות ליישומים קליניים כגון שחזור עצמות, סחוס, גיד, רצועה השתמש אוטומטית - allografts לתיקון רקמות שנפגעו. כל אחת מהטכניקות הללו מתבצע באופן שגרתי כמו "תקן הזהב" הקלינית על ידי קודם קצירת רקמה או מן המטופל או התאמה cadaveric, ולאחר מכן מציבים הרקמה לתוך האתר פגם2. עם זאת, אסטרטגיות אלו מוגבלים על ידי תורם אתר תחלואה, התורם מחסור לאתר פגמים גדולים, הסיכון לזיהום, ולא מצליח למצוא שתלי התואמים את הגיאומטריה הרצוי. בנוסף, מחקרים הראו כי allografts המשמש עבור שחזור לצמצם תכונות מכניות וחיסונים בהשוואה רקמות יליד3. עם שיקולים אלה בחשבון, מהנדסי רקמה לאחרונה פנו שלושה bioprinting תלת-ממדי (3D) כדי לייצר גיאומטריות מותאם אישית, מורכבים פעילים ביולוגית, נועד להכיל פגם בגודל וצורה תוך מתן מספיק תכונות מכניות עד שיפוץ וחיסונים תושלם.
באופן אידיאלי, לפיגום מודפס 3D מקובעים על עמוד השדרה פולימריים, באפשרותך לשמור את היציבות הנדרשת מכני של רקמה מקורית תכשירים incorporated מציעים רמזים הביוכימי הסמוכים תאים, שמוביל את ההגירה שלהם, התפשטות, בידול, רקמת ייצור2,5. למרבה הצער, רוב המבנים אשר מכילים רכיבים ביולוגיים נעשים עם ג'לים או פולימרים חלשים מכדי לעמוד ויוו כוחות מנוסים על ידי הרקמות ממוקד עבור שחזור אוטומטי/להשתלת. פולימרים אחרים כגון חומצה polylactic (PLA) הם bioresorbable, 3D להדפסה, מבחינה מבנית נשמע, אבל מודפסות ב והטמפרטורה מעל 210 ° C - עושה את זה בלתי אפשרי עבור תכשירים להיות מודפס במשותף במהלך ייצור. Polycaprolactone (PCL) הוא עוד אישר ה-FDA, bioresorbable פולימר שניתן 3D מודפס בטמפרטורה נמוכה יותר (65 ° C), אשר הפך פופולרי יותר ויותר בבדיית החולה הספציפי שתלים עם מורכבות מורפולוגיות5,6 ,-7,-8,-9. עם זאת, רוב bioprinters באמצעות טכנולוגיית פנאומטיים שיקשה להדפסת PCL בטמפרטורות נמוכות שבו פעילויות ביולוגיות יכול להישאר ללא פגע. עד כה, השתלבותם של פולימרים אלה עם אוטומטי/allografts biomaterial להדפסה הרומן טרם להתבצע. בהיעדר חומר כזה, סביר בגישה האמיתית רקמות מהונדסים רקמות השיקום. לכן, יש ביקשו לשלב ה-PLA, PCL, ואנו decellularized להשתלת מטריצות (DM) כדי לנצל את היתרונות של כל חומר כדי לייצר מבנה קיימא מסוגלת שיחזור רקמות מורכבות. תהליך זה יספק חוזק מכני ראשוני צורך להתנגד ויוו כוחות, יציבות תרמית כדי להכיל כתוסף בייצור מבנה המשרה כלפי היווצרות של הרקמה הרצויה.
בניסיון האחרונות כתובת הקשיים הנ ל, הראינו כי זה ריאלי כדי לתמצת סחוס decellularized מטריצה חוץ-תאית בתוך מכשול PLA הגנה תרמית יכול להיות extruded בתוך PCL חוטים, שמירה על היכולת של מיט להשפיע על התאים שמסביב מארח2. זה נתן השראה אותנו לחפש את גישות קליניות יעיל עבור שיקום הרקמה. במחקר הנוכחי, אנו מנצלים את הטכנולוגיה פלטפורמה לבנות פיגומים all-in-one זה כוללים את ה-PLA, מיט PCL (PLA-DM/PCL).
המטרה שלנו היא כדי לשפר את היעילות ואת התועלת של allografts בטכניקה biofabrication הרומן המוצע כדי לסכם באופן מדויק יותר רקמה מקורית, בסופו של דבר להשתמש בהם ביישומים שונים.

<table><tbody><tr><td>מכונת מסננת</td><td>Haver & Boecker Tyler</td><td>Ro-Tap RX 29-E מסננת טהורה</td><td></td></tr><tr><td>90 אום</td><td>פישרברנד</td><td>170328156</td><td>מס' 170</td></tr><tr><td>מסננת 53 אום</td><td>פישרברנד</td><td></td><td>162513588 מס' 270</td></tr><tr><td>מסננת 106 אום</td><td>פישרברנד</td><td>162018121</td><td>מס' 140</td></tr><tr><td>ציפוי מקרטע</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים סורק</td><td>היטאצ'י, ארה"ב</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Filabot EX2</td><td>Filabot.com</td><td>FB00061</td><td></td></tr><tr><td>Filabot Spooler</td><td>Filabot.com</td><td>FB00073</td><td></td></tr><tr><td>CAPA 6506</td><td>Perstorp</td><td>24980-41-4</td><td></td></tr> מי <tr><td>מלח חוצץ פוספט, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>6 אינץ' אזור נוחות מאוורר</td><td>, אמזון</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים אולטרסאונד</td><td>קול פארמר</td><td>SK-08895-13</td><td></td></tr><tr><td>Dreamer</td><td>FlashForge</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מיקסר תופים</td><td>בהתאמה אישית n</td><td>/a</td><td>ציוד דומה: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no& gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Micro Balance</td><td>Mettler Toledo, Fisher Scientific</td><td>01-913-851</td><td></td></tr><tr><td>Simplify3D</td><td>Simplify3D</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>SolidWorks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microspheres</td><td>מיוצר בבית, ראה במקביל הוגש JoVE הגשת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-ניטרופניל פוספט, מלח דיסודיום, הקסהידראט</td><td>Millipore</td><td>4876-5GM</td><td></td></tr><tr><td>פוספטאז, אלקליין</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10 713 023 001</td><td></td></tr><tr><td>קורא ספיגה</td><td>Tecan</td><td>Sunrise</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6455-100ML</td><td></td></tr><tr><td>שייקר מחומם</td><td>חדש ברונסוויק סיינטיפיק</td><td>אקסלה E24</td><td></td></tr></tbody></table>

הרומן תהליך הדפסת תלת-ממד decellularized מטריצות

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Bioprinting תלת-ממד שואפת ליצור מותאם אישית פיגומים פעילים ביולוגית, להתאים את הגודל הרצוי ואת הגיאומטריה. שדרה גומי סינתטי אשר בהתקשותו יכול לספק יציבות מכנית דומה רקמה מקורית סוכנים וחיסונים מציעים רמזים ההלחנה כדי ובתאים, המוביל שלהם ההעברה, התפשטות של בידול כדי לשקם את רקמות המקורי / האיברים1,2. למרבה הצער, רבים תואמת הדפסת תלת-ממד, bioresorbable פולימרים (כגון חומצה polylactic, פלה) הם מודפסים בטמפרטורה של 210 ° C ומעלה - טמפרטורות אשר פוגמים תכשירים. מצד שני, הוא polycaprolactone (PCL), סוג אחר של פוליאסטר, bioresorbable, חומר להדפסה תלת-ממד בעל עדינה ההדפסה לטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס. לכן, זה היה שיערו הזה decellularized מטריצה חוץ-תאית (DM) הנכלל מחסום PLA הגנה תרמית יכול להדפיס תוך PCL פילמנט ולהישאר קונפורמציה פונקציונלי שלה. בעבודה זאת, תיקון osteochondral היה היישום שעבורו נבחנה ההשערה. ככזה, סחוס חזירי היה decellularized, במארז polylactic חומצה microspheres (PLA) אשר היו אז extruded עם polycaprolactone (PCL) לתוך פילמנט לייצר מבנים תלת-ממד באמצעות התמזגו התצהיר דוגמנות. המבנה עם או בלי microspheres את (PLA-DM/PCL ו- PCL(-), בהתאמה) הוערכו ההבדלים תכונות פני השטח.

לאחר ניפוי, microspheres צריך להופיע במדים, להשתחרר מן אגרגטים. תחת SEM, microspheres sieved ייתכן נקבוביות קטנות על פני השטח, אבל אחרת יהיה כדורית וחלק, כפי שמוצג באיור1. חוטים הבלטת כל צריך להיות של קוטר אחיד, חתך מעגלי. פילמנט המכיל microspheres (PLA-DM/PCL) יהיו מעט יותר מט תוך PCL בלבד (PCL(-)) פילמנט ייראה מבריק יותר. חוט הלהט PLA-DM/PCL גם ארגיש גסה למגע בהרבה הסיב PCL(-). פיגומים יודפס בגיאומטריה הרצויה אשר הוכתב על ידי תוכנת בשלב 4.1. איכות לגרדום וה...

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של polycaprolactone (PCL) נימה עם microspheres חומצה (PLA) polylactic מוטבע אשר מכילים decellularized מטריצות (DM) עבור הדפסת תלת-ממד של רקמות מבניות הנדסת מבנים.

הרומן תהליך הדפסת תלת-ממד Decellularized מטריצות

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

שיטה זו מאפשרת הדפסה במשותף של רכיבים סינתטיים מבניים ורכיבים ביולוגיים עבור פיגומים מהונדסים ברקמות. פיגומים אלה יכולים לשכפל את סביבת הרקמה המקומית בצורה מדויקת יותר, אשר יכול להיות מועיל עבור תאים מתורבתים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה להדפיס מבנים קוליים מכניים מבלי לפגוע בחומר הביולוגי המוקפץ בתוך הפיגומים בטכניקת All-in-One להנדסת רקמות.יש לייצר מיקרוספרות עם המטריצה הרצויה. מיקרוספרות אלה נעשו עם סחוס decellularized מגפיים אחוריות פורצ'ין. גודלם משתנה.לעבוד עם מכונת מנופים כדי להשיג מיקרוספרות בגודל אחיד. ודא ששלושת מגשי המנזר נוקו ויובצו ביסודיות לפני השימוש. להרכיב את שייקר מנומר עם מגש רשת גדולה יותר על גבי מגש רשת קטנה באמצע.שים את מחבת המסמן בתחתית. מניחים מיקרוספרות יבשות במגש העליון ביותר. לאחר מכן מניחים את המכסה על המגש.מנומר גס במשך שמונה עד עשר דקות. ואז לסנון בסדר במשך שמונה עד עשר דקות. בזמן ההמתנה, לארגן נייר לשקול עבור הספירות הלוהטות.כאשר ההתקנה הושלמה, הסר בזהירות מגש מנוון. מניחים את המגש הפוך על נייר השקילה. הקישו בעדינות על הצדדים כדי להבטיח שרוב הספירות ייפלו.עם כל לוחות המסור מרוקנים על נייר לשקול, להשליך את הכדורים גדולים ו undersized. לתחומים הנותרים יש את הגודל הנכון לשימוש בשלבים הבאים. מניחים את הכדורים האלה לתוך צינור צנטריפוגה שכותרתו.יש לאחסן את הצינור במקפיא של 20 מעלות עד לצורך. לשקול את החומר הדרוש כדי להפוך את החומר תריס. הפוך יחס משקל של 1 עד 4 של מיקרוספרות לאבקת פוליקפרלקטון עם לפחות 25 גרם של מיקרוספרות.מעבירים את תערובת האבקה למיקסר מתגלגל מיניאטורי. מערבבים את האבקה ב 20 סיבובים לדקה במשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, לעצור את הסיבוב ולהפוך את המיכל.לאחר מכן מערבבים ב 20 סל"ד במשך חמש דקות נוספות. כדי להמשיך, לקחת את התערובת להגדרה extruder ו סליל. הגדר את extruder כך השקע שלה הוא כ 60 ס"מ מן הפנינה של סליל.ואז בגוף חימום extruder, להיות בטוח שאין ז'קט בידוד. מניחים מאוורר שולחן עבודה בערך באמצע הדרך בין extruder ו spooler כדי לקרר את extrudate. שים מאוורר נוסף ליד ז'קט החימום כדי לקרר אותו עם אוויר הסביבה.לאחר מכן ודא את הזרבובית הנכונה מחובר extruder ולהגדיר את טמפרטורת גוף החימום. הפעל את מאווררי הקירור ואפשר לכלי להגיע למצב יציב. לאחר 20 עד 30 דקות, לקבל את תערובת PCL מיקרוספרה ולמלא את הופר extruder.הפעל את סליל ואת auger extruder ליזום שחול חוט. השתמש במדפים ומושך ידנית את התוויב ההבלטה הראשוני. הזן את חוט החייב לסליל התסיסה.כפי שהוא מובלט, להתבונן את התסיסה כדי לזהות את הרכבו. לאחר זמן מה, הרכב התסיסה ייראה אחיד אשר רצוי. לעטוף את הקלטת סביב הסימן כדי לסמן את תחילתו של האזור האחיד.מעבר לגלגיליות הסלילים, נטר את קוטר התסיסה. השתמש calipers כדי לבדוק אם הקוטר קרוב הרצוי 1.75 מ"מ. כוונן את מהירויות ההדפסה ברקע ואת מהירויות ההבלטה והטמפרטורות לפי הצורך.כדי להתאים את קוטר חוט, תחילה לשנות את מהירויות מנגנון ההדפסה ברקע ואת extruder. אתה יכול גם לשנות את טמפרטורת extruder, אם כי זה בדרך כלל לא הכרחי. המשך למלא את הופר הבלטה עד כל אבקה משמש.כאשר הופר הוא כמעט ריק, להוסיף אבקת PCL להופר כדי לשטוף את תערובת המיקרוספרה. נטר את הבלטה בעת הוספת אבקת PCL. בהתחלה, מיקרוספרות עדיין יהיו גלויות בבלט.בסופו של דבר, כאשר אין יותר מיקרוספרות גלויים, להפסיק להוסיף את PCL. יש להפריד ולתייג את התווית במיקרוספרות בריכוז הרצוי. כאשר יש אבקה מינימלית בהופר, להפסיק extruding ולכבות את הציוד.ניתן להשתמש ב- filament במדפסת מידול תצהיר מותכת סטנדרטית. טען את חוט החיים לתוך המדפסת המצויד ב חרירים בקוטר הרצוי. כאשר הדגם טעון, הגדר את הטמפרטורה והמהירות ליניארית להדפסה והתחל להפקיד את התמיסה.התבלין המותאם אישית מופקד שכבה אחר שכבה. שימו לב במיוחד לשכבה הראשונה והתאימו את ההגדרות לפי הצורך. קשה להבחין בין שני פיגומים מודפסים תלת-ממד אלה בקנה מידה זה.אחד יש תכלית המכילה פוליקפרלקטון, PCL בלבד. השני יש סיסם PCL עם מיקרוספרות מוטבעות של חומצה פולילקטית מטריצות decelluarized. הפיגום PCL בלבד, הנצפי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה, נראה ברובו חלק.לעומת זאת, עבור כלים אחרים, מיקרוספרות מוטבע PCL גלויים לאורך המדגם. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי מעל או מיקרוספרות קטן יכול להשפיע על דינמיקת הזרימה של החומר ב extruder. מסיבה זו, הקפד להכין כראוי את המיקרוספרות שלך לפני השימוש.על מנת למזער את הפסולת, מומלץ ליצור קבוצה אחת גדולה של תריס נדרש עבור כל הניסויים ולא ליצור אצוות קטנות בתדירות גבוהה יותר. מומחיות בייצור תריסים תגיע עם הזמן. פיגומים המיוצרים בעקבות הליך זה ניתן להעריך עוד יותר במבחנה ו vivo כדי לענות על שאלות נוספות על אינדוקציה משופרת וכוח מכני בהשוואה פיגומים ביו מודפסים אחרים.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנדסת הרקמות לחקור אינדוקציה קונטרגנית של מטריצת חזירים נטולת קפאין בתוך פיגומים תלת-מימדיים. אל תשכח כי עבודה עם חלקיקים קטנים יכול להציג מפגעים נשימתיים. לבישת מסכת חלקיקים קטנה במהלך הליך זה מעודדת.

novel-process-for-3d-printing-decellularized-matrices

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מטריקס רקמות ספציפיות (ECM) הוא מתווך המפתח תפקוד התא. מאמר זה מתאר שיטות סינתזת קצף טהור הנגזרות ECM ו- microcarriers כי הם יציבים בתרבות ללא צורך crosslinking כימי עבור יישומי 3D מתקדם במודלי תרבית תאים במבחנה או כפי bioscaffolds פרו-רגנרטיבית.

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

פרוטוקול זה מתאר את decellularization מלא של שריר הלב האנושי תוך שמירה על מרכיביו מטריצה חוץ-תאית. עיבוד נוסף של התוצאות מטריצה חוץ-תאית בייצור של microparticles ו הידרוג וההספק עצמית של cytoprotective.

עיבוד של רקמת הלב האנושי כלפי עצמי בהרכבת הידרוג במבחנה ויישומים In Vivo מטריצה חוץ-תאית

פיגומים הסחוס, נגזר decellularized יכול לשמש בדומה לפיגום כדי לתקן סחוס מדריך וכאמצעי לחדש רקמות osteochondral. מאמר זה מתאר את התהליך decellularization בפירוט ומספק הצעות להשתמש פיגומים אלו בהגדרות במבחנה.

ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים

המטרה של פרוטוקול זה הוא ייצור של סיבי מטריצה חוץ-תאית כל ממוקד עבור תיקון הפצע אשר מתאימים להערכה פרה כחלק שתל משובי לגרדום. סיבים אלו המיוצר על ידי התרבות של fibroblasts על ממברנות הולופייבר, שחולצו על ידי פירוק הממברנות.

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

Decellularized מטריקס מסחטות (dECM) יכול לספק רמזים מיקרו סביבתי מתאים כדי ללכוד את הפונקציות הטמונות של רקמות היעד במבנה מהונדס. מאמר זה מהבהיר את הפרוטוקולים עבור decellularization של רקמת הלבלב, הערכה של רקמת הלבלב הנגזרת dECM ביודיו, והדור של בנייה רקמת הלבלב 3D באמצעות טכניקת ביוריטינג.

רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

פרוטוקול זה מדגיש שיטה להערכה מהירה של תאימות ביולוגית של ננו-תאי גבישי (CNC)/אגרוז דיו ביו-חומרים מרוכבים הידרוג'ל עם תאי פין שמקורם במח העצם של העכבר במונחים של כדאיות התא וביטוי פנוטיפי של קולטני פני השטח של התא, קיט (CD117) וקולטן IgE בעל זיקה גבוהה (FcεRI).

ייצור של דיו ביו-חומרים אגרוז משובץ ננו-תאית לגבישית

בעבודה זו, פרוטוקול דה-צלולריזציה עבר אופטימיזציה להשגת מטריצות דה-צלולריות של שרירי השלד של עכבר העובר. מיובלסטים C2C12 יכולים ליישב מטריצות אלה, להתרבות ולהבדיל. מודל זה במבחנה יכול לשמש לחקר התנהגות התא בהקשר של מחלות שרירי שלד כגון ניוון שרירים.

הכנת מטריצות תלת ממדיות דה-צלולריות משריר השלד של עכבר העובר לתרבית תאים

הפרוטוקול מבהיר שתי מתודולוגיות דה-צלולריזציה נפרדות המיושמות על רקמות ריאה מקומיות של בקר, ומספק תיאור מקיף של האפיונים שלהן.

פיתוח ואפיון הידרוג'לים מטריקס חוץ-תאיים ריאתיים דה-צלולריים

מטריצת הטחול הדה-צלולרית (DSM) טומנת בחובה יישומים מבטיחים בתחום הנדסת רקמת הכבד. פרוטוקול זה מתאר את ההליך להכנת DSM של חולדות, הכולל קצירת טחול של חולדות, דה-צלולריזציה שלהם באמצעות זילוח והערכת ה-DSM המתקבל כדי לאשר את מאפייניו.

ייצור מטריצת טחול דה-צלולרית שמקורה בחולדות

פרוטוקול זה מתאר את ייצור מבני העצם התלת-ממדיים באמצעות אוסטאוציטים אנושיים המוטמעים בהידרוג'לים של ג'לטין מתקרילט (GelMA) בתוספת מטריצה חוץ-תאית מפורקת תאים. השיטה זולה, ניתנת להרחבה ותואמת לציוד מעבדה בסיסי, ומספקת פלטפורמה תרגומית לחקר תהליכי מחלות שריר-שלד.

פלטפורמת תרביות עצם תלת-ממדית המשתמשת באוסטאוציטים אנושיים ובמטריצה חוץ-תאית מנותקת למידול מחלות שריר-שלד

למדו שיטת הדפסת תלת-ממד משולבת ליצירת פיגומי הנדסת רקמות המשלבים PCL ומטריצות מופרדות מתאים מסחוס חזיר. טכניקה זו מאפשרת יצירת מבנים מכניים יציבים התומכים בגידול תאים ללא פגיעה בחומר הביולוגי.

הרומן תהליך הדפסת תלת-ממד Decellularized מטריצות

גלה סרטונים נוספים