הרומן תהליך הדפסת תלת-ממד Decellularized מטריצות
7 בינואר 2019
פרוטוקול זה מתאר את הייצור של polycaprolactone (PCL) נימה עם microspheres חומצה (PLA) polylactic מוטבע אשר מכילים decellularized מטריצות (DM) עבור הדפסת תלת-ממד של רקמות מבניות הנדסת מבנים.
שיטה זו מאפשרת הדפסה במשותף של רכיבים סינתטיים מבניים ורכיבים ביולוגיים עבור פיגומים מהונדסים ברקמות. פיגומים אלה יכולים לשכפל את סביבת הרקמה המקומית בצורה מדויקת יותר, אשר יכול להיות מועיל עבור תאים מתורבתים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה להדפיס מבנים קוליים מכניים מבלי לפגוע בחומר הביולוגי המוקפץ בתוך הפיגומים בטכניקת All-in-One להנדסת רקמות.
יש לייצר מיקרוספרות עם המטריצה הרצויה. מיקרוספרות אלה נעשו עם סחוס decellularized מגפיים אחוריות פורצ'ין. גודלם משתנה.
לעבוד עם מכונת מנופים כדי להשיג מיקרוספרות בגודל אחיד. ודא ששלושת מגשי המנזר נוקו ויובצו ביסודיות לפני השימוש. להרכיב את שייקר מנומר עם מגש רשת גדולה יותר על גבי מגש רשת קטנה באמצע.
שים את מחבת המסמן בתחתית. מניחים מיקרוספרות יבשות במגש העליון ביותר. לאחר מכן מניחים את המכסה על המגש.
מנומר גס במשך שמונה עד עשר דקות. ואז לסנון בסדר במשך שמונה עד עשר דקות. בזמן ההמתנה, לארגן נייר לשקול עבור הספירות הלוהטות.
כאשר ההתקנה הושלמה, הסר בזהירות מגש מנוון. מניחים את המגש הפוך על נייר השקילה. הקישו בעדינות על הצדדים כדי להבטיח שרוב הספירות ייפלו.
עם כל לוחות המסור מרוקנים על נייר לשקול, להשליך את הכדורים גדולים ו undersized. לתחומים הנותרים יש את הגודל הנכון לשימוש בשלבים הבאים. מניחים את הכדורים האלה לתוך צינור צנטריפוגה שכותרתו.
יש לאחסן את הצינור במקפיא של 20 מעלות עד לצורך. לשקול את החומר הדרוש כדי להפוך את החומר תריס. הפוך יחס משקל של 1 עד 4 של מיקרוספרות לאבקת פוליקפרלקטון עם לפחות 25 גרם של מיקרוספרות.
מעבירים את תערובת האבקה למיקסר מתגלגל מיניאטורי. מערבבים את האבקה ב 20 סיבובים לדקה במשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, לעצור את הסיבוב ולהפוך את המיכל.
לאחר מכן מערבבים ב 20 סל"ד במשך חמש דקות נוספות. כדי להמשיך, לקחת את התערובת להגדרה extruder ו סליל. הגדר את extruder כך השקע שלה הוא כ 60 ס"מ מן הפנינה של סליל.
ואז בגוף חימום extruder, להיות בטוח שאין ז'קט בידוד. מניחים מאוורר שולחן עבודה בערך באמצע הדרך בין extruder ו spooler כדי לקרר את extrudate. שים מאוורר נוסף ליד ז'קט החימום כדי לקרר אותו עם אוויר הסביבה.
לאחר מכן ודא את הזרבובית הנכונה מחובר extruder ולהגדיר את טמפרטורת גוף החימום. הפעל את מאווררי הקירור ואפשר לכלי להגיע למצב יציב. לאחר 20 עד 30 דקות, לקבל את תערובת PCL מיקרוספרה ולמלא את הופר extruder.
הפעל את סליל ואת auger extruder ליזום שחול חוט. השתמש במדפים ומושך ידנית את התוויב ההבלטה הראשוני. הזן את חוט החייב לסליל התסיסה.
כפי שהוא מובלט, להתבונן את התסיסה כדי לזהות את הרכבו. לאחר זמן מה, הרכב התסיסה ייראה אחיד אשר רצוי. לעטוף את הקלטת סביב הסימן כדי לסמן את תחילתו של האזור האחיד.
מעבר לגלגיליות הסלילים, נטר את קוטר התסיסה. השתמש calipers כדי לבדוק אם הקוטר קרוב הרצוי 1.75 מ"מ. כוונן את מהירויות ההדפסה ברקע ואת מהירויות ההבלטה והטמפרטורות לפי הצורך.
כדי להתאים את קוטר חוט, תחילה לשנות את מהירויות מנגנון ההדפסה ברקע ואת extruder. אתה יכול גם לשנות את טמפרטורת extruder, אם כי זה בדרך כלל לא הכרחי. המשך למלא את הופר הבלטה עד כל אבקה משמש.
כאשר הופר הוא כמעט ריק, להוסיף אבקת PCL להופר כדי לשטוף את תערובת המיקרוספרה. נטר את הבלטה בעת הוספת אבקת PCL. בהתחלה, מיקרוספרות עדיין יהיו גלויות בבלט.
בסופו של דבר, כאשר אין יותר מיקרוספרות גלויים, להפסיק להוסיף את PCL. יש להפריד ולתייג את התווית במיקרוספרות בריכוז הרצוי. כאשר יש אבקה מינימלית בהופר, להפסיק extruding ולכבות את הציוד.
ניתן להשתמש ב- filament במדפסת מידול תצהיר מותכת סטנדרטית. טען את חוט החיים לתוך המדפסת המצויד ב חרירים בקוטר הרצוי. כאשר הדגם טעון, הגדר את הטמפרטורה והמהירות ליניארית להדפסה והתחל להפקיד את התמיסה.
התבלין המותאם אישית מופקד שכבה אחר שכבה. שימו לב במיוחד לשכבה הראשונה והתאימו את ההגדרות לפי הצורך. קשה להבחין בין שני פיגומים מודפסים תלת-ממד אלה בקנה מידה זה.
אחד יש תכלית המכילה פוליקפרלקטון, PCL בלבד. השני יש סיסם PCL עם מיקרוספרות מוטבעות של חומצה פולילקטית מטריצות decelluarized. הפיגום PCL בלבד, הנצפי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה, נראה ברובו חלק.
לעומת זאת, עבור כלים אחרים, מיקרוספרות מוטבע PCL גלויים לאורך המדגם. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי מעל או מיקרוספרות קטן יכול להשפיע על דינמיקת הזרימה של החומר ב extruder. מסיבה זו, הקפד להכין כראוי את המיקרוספרות שלך לפני השימוש.
על מנת למזער את הפסולת, מומלץ ליצור קבוצה אחת גדולה של תריס נדרש עבור כל הניסויים ולא ליצור אצוות קטנות בתדירות גבוהה יותר. מומחיות בייצור תריסים תגיע עם הזמן. פיגומים המיוצרים בעקבות הליך זה ניתן להעריך עוד יותר במבחנה ו vivo כדי לענות על שאלות נוספות על אינדוקציה משופרת וכוח מכני בהשוואה פיגומים ביו מודפסים אחרים.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנדסת הרקמות לחקור אינדוקציה קונטרגנית של מטריצת חזירים נטולת קפאין בתוך פיגומים תלת-מימדיים. אל תשכח כי עבודה עם חלקיקים קטנים יכול להציג מפגעים נשימתיים. לבישת מסכת חלקיקים קטנה במהלך הליך זה מעודדת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה להדפסה משולבת של רכיבים סינתטיים מבניים ורכיבים ביולוגיים ליצירת פיגומים להנדסת רקמות. פיגומים אלו יכולים לשחזר באופן מדויק יותר את סביבת הרקמה הטבעית, ובכך להועיל לתאים המגודלים בהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- הנדסת רקמות
- הדפסה בתלת-ממד
- ביומטריאלים
רקע
- מטריצות דה-צלולריות (DM) משמשות לשיפור התפקוד של פיגומים.
- פוליקפרו לקטון (PCL) וחומצה פולילקטית (PLA) הם חומרים מרכזיים בייצור פיגומים.
- מיקרוספירות יכולות להכניס חומרים ביולוגים לתוך תכליל ללא פגיעה בהם.
- טכניקה זו מאפשרת שילוב של תכונות מכניות וביולוגיות בפיגומים.
מטרת המחקר
- ליצירת פיגומים להנדסת רקמות בעלי יציבות מכנית.
- לאנקפסולציה של מטריצות דה-צלולריזציה בתוך מיקרו-ספירות לשיפור תרבית תאים.
- לפיתוח שיטה המשלבת רכיבים מבניים וביולוגיים בתהליך הדפסה אחד.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ייצור של חוט PCL עם מיקרוספירות PLA מוטמעות.
- שימוש בסחוס שעבר דסלולריזציה מגפיים אחוריים של חזיר.
- טכניקות הדפסה בתלת-ממד לייצור פיגומים.
- אפיון של גודל ותכונות המיקרוספירות.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של פיגומים השומרים על שלמות מבנית.
- הדגמה של היכולת להקיף חומרים ביולוגיים באופן יעיל.
- הצגה של תנאי תרבית תאים משופרים בתוך הפיגומים.
- תיקוף של השיטה לייצור מבנים מורכבים של הנדסת רקמות.
מסקנות
- שיטה זו מגבירה את הפוטנציאל ליצירת פיגומים תאיים (scaffolds) פונקציונליים.
- טכניקות הדפסה משולבת (Co-printing) יכולות לגשר על הפער בין חומרים סינתטיים לביולוגיים.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול רפואה רגנרטיבית ותיקון רקמות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שילוב של מטריצות דסלולריזציה (decellularized matrices) בתוך פיגומים המודפסים בתלת-ממד מאפשר יצירת מבני הנדסת רקמות המשלבים שלמות מכנית עם פונקציונליות ביולוגית. גישה זו נותנת מענה לאתגר קריטי בשלבי הגילוי המוקדמים ובמחקרים פרה-קליניים על ידי שימור הפעילות הביולוגית במהלך הייצור, ובכך תומכת בביטחון ניבוי במידול רקמות. שיטה זו ממצבת את ההדפסה הביולוגית כפלטפורמה לפיתוח מערכות הרלוונטיות למחלות וקידום מחקר בתחום הביו-חומרים התרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של אינטראקציות בין תאים למטריקס בסביבת תלת-ממד מבוקרת.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של רמזים בביומטריאלים המשפיעים על התנהגות תאי אב.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי שימור פעילותם של סוכנים ביולוגיים במהלך ייצור הפיגום.
- משפר את רמת הביטחון החזיונית בהנחות עבודה בתחום הנדסת הרקמות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פיגומים תלת-ממדיים סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור בדיקות מבוססות תאים המשך.
- מאפשר השוואה כמותית של מאפייני פני השטח של הפיגום ותגובות תאים.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת תרכובות או חומרי ביולוגיה.
- מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות להערכה מהימנה של אותים רגנרטיביים.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- מתאימה את הרכב הפיגום לסביבות רקמה הרלוונטיות למחלה עבור מחקרים תרגומיים.
- מאפשרת רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות לתיקון רקמות.
- תומכת בהחלטות קידום מבוססות ניהול סיכונים על ידי שמירה על התפקוד הביולוגי במבנים.
- מקלה על הערכה של ביצועי הפיגום in vitro ו-in vivo.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים, פיתוח בדיקות ומחקר פרה-קליני, על ידי כך שהיא מאפשרת ייצור של פיגומים תלת-ממדיים (3D scaffolds) הפעילים ביולוגית ועמידים מבחינה מכנית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות על אינטראקציות בין תאים למטריצה ובצמצום סיכונים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת תוצרי פיגום כמותיים הניתנים לשחזור לצורך מוכנות של בדיקה.
- אנליזה: מספקת תכונות פני שטח והרכב מדידים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: שומרת על רמזים תפקודיים של חומרי ביו-חומרים לצורך התאמה למודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: קובעת זרימת עבודה ניתנת לשימוש חוזר עבור יישומים מגוונים של הנדסת רקמות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון בחיזוי ואת תיקוף המטרה בהנדסת רקמות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של ייצור פיגומים עם תוצרים הניתנים לשחזור ולהרחבה.
- ערך אסטרטגי: מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים ותומך בקבלת החלטות יעילה לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם-סיכון של תוכניות לרפואה רגנרטיבית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בעיבוד חומרי ביו-מטריאלים ובמכשור הדפסה בתלת-ממד.
- נדרשת תשתית אנליטית לאפיון פיגומים (scaffolds) ובקרת איכות.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת מיקרו-ספירות ופרמטרי אקסטרוזיה.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור סוגי רקמות שונים או סוכנים ביולוגיים.
- טיפול נכון בחלקיקים והרחבת קנה מידה של המנות חיוניים להבטחת השחזוריות והבטיחות.
