אין ויוו יישוב ביטוי של חלבונים Optogenetic באמצעות סרטי משי/AAV
26 בפברואר 2019
כאן, אנו מציגים שיטה להעברת נגיפי ביטוי וקטורים למוח באמצעות סרטי משי fibroin. שיטה זו מאפשרת משלוח ממוקד של וקטורים ביטוי באמצעות סיבים אופטיים מצופים משי/AAV, סיבים אופטיים מחודדות וחלונות הגולגולת.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח של מערכות. כגון כיצד הפעילות של הרכבים עצביים תומכת בעיבוד חושי וקוגניטיבי במוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מקלה על מיקוד מדויק של חלבונים אופטוגנטיים כמו צ'אן רודופסין ו- GCaMP לאזורי עניין במוח, ללא צורך בהליך הזרקת וירוס נפרד.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו התצהיר של משי ווירוס שתלים אופטיים קטנים יכול לקחת קצת תרגול על מנת להשיג תוצאות לשחזור. ראשית, מערבבים AAV מופשר וחמש עד שבע נקודות חמישה אחוזים פיברוין משי מים ביחס של אחד לאחד בצינור PCR 200 מיקרוליטר. בעדינות pipette הפתרון פנימה ובחוץ מספר פעמים כדי לערבב ביסודיות את AAV ו fibroin.
כדי להפקיד את המשי / AAV, לטעון פיפטה הזרקה עם כמות הפתרון הנדרש עבור מספר שתלים סיבים שנעשו, בתוספת כ 30 אחוזים נוספים כדי להכיל הפסדים עקב סתימת פיפטה. לאחר מכן, הר מחזיק ferrule לתוך מנגנון סטריאוטוקסי מצויד microinjector. מניחים את מחזיק ferrule מעל microinjector ולהחיל את תערובת משי / AAV מלמטה.
לתמרן את פיפטה ההזרקה עד שהוא נוגע או כמעט נוגע במרכז פני השטח סיב אופטי, ולפלט 10 עד 20 nanoliters של פתרון משי / AAV. לאחר מכן, למשוך את פיפטה. לאחר מכן, להתבונן בולוס של משי / AAV על פני השטח השטוחים אשר מופיע כמו כיפה נוזלית כי מתייבש לסרט שטוח בתוך כדקה אחת.
חזרו על השלבים הקודמים עד להפקדת הכמות הרצויה של משי/AAV. בעת הכנת שתלים מרובים, להחיל את פתרון משי / AAV על שתל אחד ולאחר מכן לעבור מעיל שתלים אחרים, לפני החזרה הראשון. לאחר שעה אחת של ייבוש, מניחים את כל מחזיק ferrule לתוך תא ואקום ואקום להתייבש לילה בערך 125 טור וארבע מעלות צלזיוס.
ביום שלמחר, להעריך את הצורה והמיקום של סרט המשי וכתוצאה מכך תחת מיקרוסקופ בה עוצמה גבוהה. ודא שהסרטים מוגבלים לקצה משטח הסיב האופטי, דק יחסית וסימטרי. לציפוי סיבים אופטיים מחודדים, מקם את פיפט הזרקת המשי/AAV בצד הסיב האופטי בתחילת ההתחדדות, וודא שהפיגט נוגע בסיבים האופטיים.
להוציא 20 nanoliters של משי / AAV כדי להתחיל את תהליך הציפוי, להבטיח כי טיפה דבק סיבים אופטיים ונשאר בממשק של סיבים פיפטה. בעדינות פתיל את הטיפה לקראת סוף קצה הסיבים כמו משי / AAV מתייבש, ולשמור על פיפטה הזרקה במגע עם טיפת ייבוש, כדי למנוע סתימת קצה פיפטה. כאשר הבולוס הראשון התייבש כמעט לחלוטין, להוציא עוד 20 nanoliters ולהמשיך פתיל את טיפה לאורך ההתחדדות.
חזור על השלב הקודם על ידי הוצאת כמויות קטנות של משי / AAV, ובהדרגה ייבוש הפתרון במעלה הצד של ההתחדדות. לאחר הייבוש, להעריך את הצורה והמיקום של סרט משי וכתוצאה מכך תחת מיקרוסקופ בה עוצמה גבוהה. לציפוי שתלי עדשת GRIN, יש להפקיד משי/AAV בזריקה אחת על שתל עדשת GRIN.
לאחר הייבוש, להעריך את הצורה והמיקום של סרט המשי וכתוצאה מכך תחת מיקרוסקופ כוח גבוה כדי להבטיח כי הסרט מכסה את פני השטח של העדשה. עבור ציפוי חלונות גולגולתיים מזכוכית, יד פיפטה טיפה חמישה מיקרוליטר של משי / AAV על פני השטח של כיסוי עגול שלושה מילימטר להחליק, כך טיפה מתפשטת כדי לכסות את משטח הזכוכית כולו. לאחר הייבוש, יש לאחסן את הסיבים האופטיים מצופים המשי/AAV במייבש ואקום מקורר ב-125 מעלות וארבע מעלות לפני השתלת המכשירים.
תמונות פלואורסצנטיות של חלבונים אופטוגנטיים המתויגים על ידי פלואורופור סיפקו מדד להיקף הביטוי של סרטי המשי/AAV, וסיבים אופטיים טיפוסיים יכולים להכיל בקלות 200 ננוליטר של משי/AAV. עם תרגול, ניסויים יכולים להשיג ביטוי אמין מאוד סביב קצה סיבים מושתלים. שתי בעיות אפשריות עם חלונות גולגולתיים מצופים אינן מספיקות, וסרטי משי שאינם מתמוססים ומטשטשים את שדה המבט.
כדי להגביר את הביטוי, ניתן לבצע כריתת דורה לפני השתלת החלון, ו/או הגדלת כמות הנגיף בסרט. הביטוי הטוב ביותר הושג באמצעות תערובת אחת עד ארבע של משי ו- AAV טיטר מניות, בהתאמה. כמות המשי בחלונות מצופים גדולה פי 10 עד 100 מאשר על שתלי סיבים, והסרט מוטמע פחות ברקמה, ולכן ייתכן שלא ייחשף לאותן רמות של פעילות פרוטאו-אוליטית שיכולה להמיס סרטי משי.
עם זאת, נוכחות של משי כלשהו חיוני להשגת הביטוי שלך מתחת לחלונות, ככל הנראה בגלל סרט עשוי וירוס לבד נשטף על ידי נוזל interstitial במהלך הניתוח. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להכין ולאחסן שתלים מצופים משי באופן שאנו מתארים. אחסון לא תקין עשוי לשנות את המאפיינים של סרטי משי, או להקטין את היעילות של וקטורים ביטוי ויראלי.
טכניקה זו יכולה להיות תועלת רבה עבור חוקרים בתחום מדעי המוח של מערכות כדי לחקור כיצד פעילות עצבית מניעה עיבוד חושי וקוגניטיבי במוחם של יונקים כגון עכברים, חולדות, או אפילו פרימטים לא אנושיים. אל תשכח כי עבודה עם וקטורים ביטוי ויראלי יכול להיות מסוכן וציוד מגן אישי, כגון כפפות, משקפי מגן, חלוקי מעבדה, תמיד צריך להיות משוחק תוך כדי עבודה עם וירוס הקשורים אדנו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה להחדרת וקטורי ביטוי ויראליים אל המוח באמצעות דפי משי פיברואין. הטכניקה מאפשרת מיקוד מדויק של חלבונים אופטוגנטיים לאזורי מוח ספציפיים, ובכך מקלה על מחקרים במדעי מערכות העצבים ללא צורך בהזרקות ויראליות נפרדות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים של מערכות (Systems neuroscience)
- החדרה באמצעות וקטורים ויראליים
- אופטוגנטיקה
רקע
- חוקר פעילות של מאסנבלי נוירונים הקשורה לעיבוד חושי וקוגניטיבי.
- מתמקד בטכניקות של הובלה ממוקדת עבור כלים אופטוגנטיים.
- עוסק באתגרים להשגת תוצאות הניתנות לשחזור ביישום של משי ווקטורים ויראליים.
- שם דגש על חשיבות נוכחותו של הווירוס בעת שימוש במשי כציפוי.
מטרת המחקר
- לשיפור המכוונות של חלבונים אופטוגנטיים כגון Chan rhodopsin ו-GCaMP.
- לפישוט תהליך העברת הווקטורים הויראליים באמצעות סרטי משי פיברוין (silk fibroin).
- לקידום המחקר בהבנת התקשורת והעיבוד העצבי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המתודולוגיה כוללת יישום של תערובות משי/AAV על סיבים אופטיים וחלונות גולגולתיים.
- נעשה שימוש במיקרוסקופיה בעוצמה גבוהה לצורך הערכת איכות של שיקוע שכבת המשי.
- מתוארים דרישות ההכנה והאחסון להשגת ביטוי ויראלי אופטימלי.
- כולל יחסי ערבוב ושלבים ספציפיים לערבוב ולשיקוע של משי ווקטורים ויראליים.
תוצאות עיקריות
- אפשר ביטוי מהימן של חלבונים אופטוגנטיים סביב קצותיהם של סיבים מושתלים.
- הדגיש את הצורך בנוכחות משי להשגת ביטוי יעיל מתחת לחלונות גולגולתיים.
- תיאר את התנאים שאינם אידיאליים העלולים להשפיע על תוצאות הביטוי.
- הציג תובנות לגבי יחסי ערבוב אופטימליים של משי ו-AAV להבטחת התפקוד.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את היכולת לחקור מנגנונים ותהליכים עצביים המשפיעים על קוגניציה ותחושה.
- תומכת בפיתוח של כלים אופטוגנטיים מתקדמים במחקר בתחום מדעי המוח.
- בעלת השלכות להבנה משופרת של האופן שבו פעילויות נוירונליות ספציפיות מניעות תגובות התנהגותיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הגשה מדויקת וממוקמת של חלבונים אופטוגנטיים באמצעות דפי משי/AAV פותרת צוואר בקבוק קריטי בחקירת מעגלים עצביים על ידי ביטול הצורך בהזרקות ויראליות סטריאוטקסיות פולשניות. חידוש זה מגביר את מידת הביטחון בניבוי של מחקרים תפקודיים במדעי המוח על ידי מתן אפשרות לביטוי ממוקד וניתן לשחזור בממשק שבין המכשיר לרקמה. גישה זו תומכת בניסויים בעלי דיוק גבוה ובקנה מידה רחב, החיוניים עבור פורטפוליו של נוירוטכנולוגיה ומדעי המוח תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של תפקוד מעגלים עצביים על ידי הפיסוח של ביטוי חלבונים אופטוגנטיים בדיוק מרחבי.
- מפחית שונות פרוצדורלית ונזק לרקמה, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית חסונה במחקרים נוירוביולוגיים.
- משפר את הביטחון בניבוי הקשר בין פעילות נוירונלית לתוצרי התנהגות לצורך תיקוף מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- תומך בהכנה של מודלים מוכחים וניתנים לשחזור in vivo עבור תהליכי סריקה אופטוגנטית.
- מסטנדרט את הובלת החלבון בממשק השתל, ובכך משפר את השחזור של הבדיקה ואת העקביות של הפלט הכמותי.
- מקל על פריסה רחבה של השתלים אופטיים עבור סריקה גנטית או סריקת תרכובות במערכות עצביות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים של מעגלים עצביים הרלוונטיים למחלה על ידי אפשור מניפולציה ממוקדת במכרסמים ובפרימטים שאינם בני אדם.
- מספק רצף משלב מיפוי המעגלים בשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות נוירו-אקטיביות.
- מפחית סיכונים במחקרי תרגום על ידי מזעור השפעות חוץ-מטרה ומשתנים פרוצדורליים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
שיטה זו להכנת סרט מsilk/AAV משתלבת בממשק שבין השתלת מכשירים לבין מחקרים תפקודיים in vivo, ובכך היא מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לבין פיתוח מודלים פרה-קליניים במסלולי מחקר במדעי העצבים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקה מונחית-השערה של תפקוד מעגלים עצביים על ידי אפשור ביטוי חלבוני מדויק ומקומי.
- סריקה: מספק תוצאות אופטוגנטיות כמותיות וניתנות לשחזור עבור פיתוח בדיקות המשך.
- אנליזה: מספק מדידה מבוססת פלואורסצנציה של היקף הביטוי, ובכך תומך בניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: שומר על הלימה עם מודלים רלוונטיים למחלות על ידי תמיכה במניפולציה ממוקדת במגוון מינים.
- שימוש חוזר ברמת הארגון: מציע פלטפורמת הובלה מודולרית וניתנת להתאמה עבור סוגים שונים של שתלים אופטיים ופרדיגמות ניסיוניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים של מעגלים עצביים.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימות העבודה, מפחית את המורכבות הכירורגית ומשפר את השחזוריות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) וקידום יעיל של תיקי פיתוח במונחי הון במו"פ של נוירוטכנולוגיה.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתיעדוף מותאם סיכון של מטרות עצביות ומודלים ניסויים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בווקטורים ויראליים ובהכנת שתלים אופטיים.
- מחייב גישה למיקרוסקופיה בעוצמה גבוהה ותשתית ייבוש מבוקרת לצורך בקרת איכות.
- מצריך פרוטוקולים סטנדרטיים להשקעת שכבות ואחסונן כדי להבטיח הדירות.
- ניתן להתאמה לגאומטריות שונות של שתלים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור כל סוג התקן.
- תלוי בנהלי בטיחות נאותים לטיפול בווקטורים מסוג AAV ובצמצום השונות הפרוצדורלית.
