המוטיבים אן יציב, 1 י ו- 2D Nanostructures בנוי מולקולות DNA מעגלי קטן

שיטה זו מרחיבה את ננוטכנולוגיה DNA מחומרי המקור של אוליגונוקלאוטיד ליניארי, DAS, לתוך כמה DAS מעגלי יותר. היתרונות העיקריים של טכניים אלה הם שזה פשוט, חזק ובמחיר סביר עבור רוב המעבדות. לטיהור דנ"א מעגלי, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של פורמאמיד לפתרון של דנ"א עגול טרי, שלם, לנפח סופי של 140 מיקרוליטר עם ערבוב.

לטעון 16 עד 20 microliters של פתרון DNA מעגלי לכל שבע עד תשעה denaturing דף ג'ל בארות. מערבבים שני מיקרוליטרים של צבע טעינה עם שמונה מיקרוליטרים של הדנ"א ליניארי הקדמה המתאים, ולהזריק את התערובת לתוך היטב התייחסות נפרדת. לאחר מכן להפעיל את הג'ל במשך כשעתיים ב 10 וולט אחוזים, לעצור את הריצה כאשר קסילן cyanol FF ניתן לראות כשני שלישים במורד הג'ל.

לובשים כפפות גומי ומ המשקפיים, מעבירים את הג'ל לצלחת כרומטוגרפיה פלואורסצנטית בשכבה דקה, ולהשתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את רצועות ג'ל היעד, כפי שמצליל על ידי הקרנת UV. מניחים את רצועות הג'ל בצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר לייבוש, ואז מועכים את הג'לים המיובשים לעיסה, ומוסיפים מים מיוצבים בנפח כפול של ג'ל, לרעידות לילה בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, לסנן את התערובת לתוך צינור microcentrifuge שני מיליליטר, לשטוף את הצדדים של הצינור הראשון עם נפח קטן של מים מיוננים כדי לשחזר כל DNA שיורית, וסינון שוב לשלב את supernates.

לאחר מכן לטהר את ה-DNA המעגלי באמצעות משקעים אתנול, ולאחסן את ה-DNA במינוס 20 מעלות צלזיוס. עבור חישול סיר אחד, לערבב שני microliters של חיץ מגנזיום טריס אצטט 10-קיפול EDTA, מיקרוליטר אחד של כל 10 פתרון מלאי DNA מיקרומולארי של קבוצה של גדילים ליניאריים ועגולים ביחסים טוחנים שווים, ומאגר טריס EDTA נוסף במבחנת PCR 200 מיקרוליטר, לנפח סופי של 20 microliters. ואז anneal פתרון ההרכבה בבקבוק תרמי מ 95 עד 25 מעלות צלזיוס, מעל 48 שעות.

לחיטוי דו-שלבי של סריגים אינסופיים, ערבבו שני מיקרוליטרים של חיץ מגנזיום טריס אצטט פי 10, מיקרוליטר אחד של כל 10 תווי DNA מיקרומולרים של סט גדילים ליניאריים ועגולים ביחסים טוחנים שווים, ומאגר טריס EDTA נוסף במבחנת PCR של 200 מיקרוליטר, לנפח סופי של 20 מיקרוליטר. בשלב חישול אריח המשנה הראשון, anneal כל פתרון אריח משנה מבשר בתרמוצ'יקלר PCR, באמצעות שיטת קירור ליניארית מהירה מ 95 עד 25 מעלות צלזיוס, מעל שעתיים וחצי. כדי להכין את פתרון ההרכבה, עבור כל אחד מארבעת הסריגים האינסופיים, מערבבים 10 מיקרוליטרים של כל אחד משני פתרונות אריחי המשנה המתאימים יחד, לריכוז סופי של 0.25 מיקרומולר לכל גדיל.

בשלב חישול הסריג השני, anneal תערובת 20 microliter בתרמוצ'ילר PCR, בשיטת קירור איטית. עבור חישול שני שלבים של שני סריגים מלבנים סופיים, מערבבים מיקרוליטר אחד של חיץ מגנזיום טריס אצטט 10 קיפול, 0.5 microliters של כל 10 פתרון מלאי DNA מיקרומולארי של קבוצה של גדילים ליניאריים ועגולים ביחסים טוחנים שווים, ומאגר טריס EDTA נוסף במבחנת PCR 200 מיקרוליטר, לנפח סופי של 10 microliters. בשלב ההתוות הראשון, Anneal כל פתרון אריח משנה מבשר בתרמוצ'ילר PCR, באמצעות שיטת קירור ליניארית מהירה, כפי שהוכח, מ 95 עד 25 מעלות צלזיוס, על פני שעתיים וחצי, ולערבב את פתרונות אריחי המשנה annealed, כל אחד עם 2 microliters, יחד במבחנת PCR 200 מיקרוליטר, לנפח סופי של 64 מיקרוליטר.

לאחר מכן, בשלב חישול השני, anneal תערובת 64 microliter בתרמוציקלר, באמצעות שיטת קירור איטי, כפי שהוכח. לטיהור אלקטרופורזה של הסריגים הסופיים, הכינו ג'ל מקורי של 2%agarose והעמיסו 20 מיקרוליטרים של תמיסת הסריג הסופי לכל באר, יחד עם תוספת של 5 מיקרוליטרים של סולם דנ"א של 100 עד 3000 זוג בסיס, באר נפרדת. לאחר הפעלת הג'ל במשך שעתיים ב 5 וולט בסנטימטר באמבט מי קרח, לחתוך את רצועות ג'ל היעד בערך ברמה של 1000 סמן זוג הבסיס תחת אור UV, כפי שהוכח, לחתוך את רצועות ג'ל לחתיכות בסדר.

מניחים את הג'לים המרוסק בעמודת סינון, ומצרכים את העמודה כדי לחלץ את הסריגים. לאחר מכן, לאסוף את הפתרון עבור הדמיה מיקרוסקופית כוח אטומי. לטיהור סריג סופי על ידי פוליאתלן גליקול, או PEG, לערבב 50 microliters של פתרון סריג סופי עם נפח שווה של 15%PEG 8000 מאגר, צנטריפוגה הפתרון, ולהשעות מחדש את גלולה ב 100 microliters של חיץ PEG, עבור צנטריפוגה נוספת.

לאחר הצנטריפוגה השנייה, להשעות את גלולה טריס אצטט מאגר מגנזיום EDTA, עבור הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי. להדמיית מיקרוסקופ כוח אטומי דו-ממדי אינסופי, יש לנקות שכבה טרייה של נציץ ולהפקיד שני מיקרוליטרים של הדגימה הנפרדת על פני השטח הנקיים. אפשרו לסריגי הדנ"א שתי דקות לספוג למשטח הנציץ, לפני שטיפת פני השטח פעמיים, עם 100 מיקרוליטרים של מים מיוננים לכל שטיפה, וייבשו את פני השטח באוויר דחוס לאחר הכביסה השנייה.

כדי להשיג תמונות מיקרוסקופ של הכוח האטומי של סריגי הדנ"א האינסופיים באוויר, פתח את מצב ההקשה בתוכנת ההדמיה והגדר את גודל הסריקה ל-0.5 עד 5 מיקרומטר, את רזולוציית הסריקה ל-512 קווים ואת קצב הסריקה בין 1 ל-3.5 הרץ. לאחר מכן, סרוק את משטח הנציה באמצעות בדיקות מיקרוסקופ כוח אטומי משולש. להדמיית סריגי דנ"א סופיים, יש לחשוף שכבה טרייה של נציץ, כפי שהוכח, ולהפקיד 80 מיקרוליטרים של מאגר מגנזיום EDTA קיפול אחד על משטח הנציה הנקי.

לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של דגימות סופיות לתוך המאגר, ולאפשר את סריגים DNA שתי דקות לספוג על פני השטח נציץ, לפני הוספת עוד 50 microliters של טריס אצטט מאגר מגנזיום EDTA לבדיקה. לאחר מכן, הגדר את גודל הסריקה ל- 0.5 למיקרומטר אחד, את רזולוציית הסריקה ל- 256 קווים ואת קצב הסריקה ל- 1.5 הרץ, לפני סריקת פני השטח באמצעות הבדיקות המשולשות, כפי שהוכח. הדנ"א המעגלי נע מעט לאט יותר מאשר הדנ"א ליניארי מבשר בדף denaturing, כי הנקבובית בתוך ה-DNA המעגלי הוא חדר ומפגר על ידי סיבי ג'ל.

למשפחות ההתכנסות המעגליות של 64 נוקלאוטייד יש רק רצועה אחת ברורה ונקייה לכל אסיפה, המאשרת את יציבות המוטיבים המונומריים שלהן. עם זאת, משפחות ההרכבה העגולות של אריחי נוקלאוטידים 84 מריחות סביב הלהקות העיקריות שלהן, מה שמצביע על נוכחותם של מוצרים משניים. ללא קשר לקטין על ידי מוצרים של מקורבים שגויים, סריגים מצוינים עם תשואות גבוהות ניתן להרכיב ממוטיבים מונומר היעד.

לכל הרכבה יש תכונות מורפולוגיות משלה בסולם המיקרומטר, כגון ננו-חוטים, צינוריות, ננו-ספירלים, ננו-רובונים וננו-רקטגלים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע, במיוחד, זיהום פסולת במהלך או מחוץ למדרגות. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקרים בתחום הננוטכנולוגיה של הדנ"א כדי לחקור בני משפחה חדשים של כמה ננוטכנולוגיה DNA מעגלית יותר.