הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

פרוטוקול זה מתמקד בשתי שיטות ייבוש כימיות, הקסמתילדיסילאזאן ואלכוהול T-butyl והיישום שלהם הדמיה הן אורגניזמים פרוקריוטיים ואיקריוטיים באמצעות SEM. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת שימוש בציוד ייבוש מיוחד כגון מייבש נקודה קריטי להכנת דגימות לניתוח. פרוטוקול זה מתאר את השיטות לשימוש התייבשות כימית וניתוח SEM של שלושה סוגים של אורגניזמים, אך יהיה ישים באופן נרחב לבדיקת סוגים רבים של אורגניזמים ורקמות.

הפגנת ההליך תהיה מדיסון קון, סטודנטית לתואר ראשון מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להכין ציאנובקטריה על ידי קיבעון לילה. לאחר מכן, להעביר אותם לתוך אסדת סינון 10 מ"ל המכיל פוליקרבונט 25 מ"ל מסנן.

לאטום את הצד ואת המשפך של אסדת הסינון עם פקקי גומי כדי להכיל את התרבות במשפך. לאחר הסרת שני פקקים, להסיר את התיקון על ידי שאיבת אבק עדינה על בקבוק הסינון. כדי להכין euglenoids אצות חד-תאיות, לתקן אותם על ידי הוספת 3 טיפות של 4%osmium tetroxide ישירות לתרבות שהועברה בעבר לתוך אסדת סינון 10 מ"ל.

לאחר דגירה של 30 דקות, הסר את שני העצורים והסר את התיקון על ידי שאיבת אבק עדינה על בקבוק הסינון. לשטוף את euglenoids קבוע שלוש פעמים עם 5 מ"ל של 0.1 M פוספט חיץ pH 7.0 בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות כל תוך שמירה על הבקבוק ואת המשפך סגור עם פקק להחזיק את הכביסה. לאחר הסרת שני פקקים, להסיר כל לשטוף על ידי ואקום עדין על בקבוק הסינון.

כדי לייבש את המדגם תוך שמירה על טבילה רציפה, השתמש בסדרת אתנול מדורגת במשך עשר דקות בנפח של 5 מ"ל במשפך תוך שמירה על הבקבוק והמשפך סגורים עם העצורים כדי להכיל את האתנול במשפך. לאחר הסרת שני פקקים בעדינות ואקום על בקבוק הסינון כדי להסיר אתנול. מעבירים את הדגימה לצלחת שקילה חד פעמית מאלומיניום המכילה מספיק אתנול 100% כדי לכסות את הדגימה.

כדי לבצע ייבוש כימי של euglenoids באמצעות TBA, תחילה להחליף את הפתרון 100%אתנול בצלחת אלומיניום עם 1 כדי 1 פתרון של TBA ו 100% אתנול במשך עשרים דקות. לאחר מכן, החלף את הפתרון 1 עד 1 ב- 100%TBA למשך עשרים דקות וחזור על התהליך פעמיים. הסר TBA והחלף עם מספיק טרי 100%TBA כדי לכסות את המדגם.

מניחים את המנה על ארבע מעלות צלזיוס במשך עשר דקות כדי להקפיא את TBA. מעבירים את הדגימה ליירד ואקום עם חבילות ג'ל קפואות כדי לשמור על TBA קפוא. השתמש במשאבה סיבובית כדי לפנות ולשמור על ואקום כדי לאפשר לדגימה להתייבש על ידי סובלימציה ואקום של TBA קפוא לפחות שלוש שעות.

כדי להרים ציאנובקטריה באוגלנואידים, סמן את החלק התחתון של 25 מ"מ אלומיניום הרכבה stub כדי לציין מה ממוקם על גבי. לאחר מכן מקם כל מסנן על לשונית דבק פחמן מאובטחת בחלק העליון של ה stub. כדי להכין Drosophila melanogaster, לטבול זבובים הרדמה ב 1 מ"ל של תיקון במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס, לוודא שהם שקועים לחלוטין.

השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר את התיקון. לשטוף את מדגם Drosophila קבוע בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 0.1 M פוספט חיץ, pH 7.2 בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות. השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר כל לשטוף, נזהר לא להסיר את המדגם.

לאחר מכן, לייבש את המדגם בצינור microfuge בנפח של 1 מ"ל באמצעות סדרת אתנול מדורגת במשך עשר דקות כל אחד. השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר כל לשטוף, נזהר לא להסיר את המדגם. שמור את הדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל עם מספיק אתנול 100% כדי לכסות אותו.

כדי לבצע ייבוש כימי של הזבובים באמצעות HMDS, החלף תחילה את תותב האתנול 100%עם פתרון 1 עד 2 של HMDS ו 100%אתנול במשך עשרים דקות. לאחר מכן החלף את הפתרון עם פתרון 2 ל 1 של HMDS ו 100%אתנול במשך עשרים דקות. לבסוף, החלף פתרון זה ב- 100%HMDS למשך עשרים דקות ולאחר מכן חזור על התהליך פעם אחת.

מעבירים את הדגימה שנמצאת בצינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מ"ל ו HMDS לתוך צלחת שקילה אלומיניום חד פעמי. החלף את 100% HMDS עם מספיק טרי 100% HMDS כדי לכסות את המדגם. מניחים את המדגם בתוך צלחת האלומיניום ישירות ברדס אדים כימי להתייבש עם מכסה רופף כגון קופסה כדי למנוע פסולת ליפול על המדגם ולאפשר לו להתייבש במשך 12 עד 24 שעות.

כדי להר דרוסופילה, סמן את החלק התחתון של תותב הרכבה מאלומיניום. השתמש פינצטה מדויקת כדי למקם את הזבובים היבשים במיקום הרצוי על לשונית דבק פחמן מאובטח לראש ספח תחת מיקרוסקופ ניתוח. החל דבק מוליך כסף סביב הקצוות החיצוניים של stubs.

השתמשו בקיסם כדי לחבר את צבע הכסף לזבובים, כדי להבטיח מוליכות, ולוודא שהצבע לא נוגע באזור ההדמיה הרצוי. מניחים את stubs בתיבת מחזיק יתן, ולאחר מכן מניחים את תיבת מחזיק סטוב פתוח במייבש ולאפשר צבע כסף להתייבש לפחות שלוש שעות. כדי להכין את מנגנון ציפוי sputter, לבצע 4 עד 5 סומק של גז ארגון.

בהתאם לדגימות שיש לצפות, הגדר את שעון הזמן להגדרות שונות כמתואר בכתב היד. Sputter מצופה את ספלים בעקבות הוראות היצרנים. לבסוף, דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה הכולל גלאי אלקטרונים משני עם הגדרות התלויות המדגם בשימוש.

הכנה מוצלחת של ציאנובקטריה עבור SEM באמצעות פרוטוקול זה הניבה תמונות שבהן פרטים של התא, כולל צורה ומרקם של פני השטח גלויים, כמו גם נדן של ריר והקרנות מהתאים. תמונת SEM של מיני מים מתוקים סיסיליים מקולורדו מראה נדן גלוי של ריר. תמונת SEM של חיידק מים מתוקים מאוהיו חושפת תאים בודדים שלעיתים יוצרים מושבות המוחזקות יחד על ידי שכבה דקה של ריר.

בלטים דמויי תכלת נמשכים מהתאים הבודדים. תמונות של מינים סיביות לא ידועים מ שפך מליחות גבוהה במימי החוף של טקסס מראות תאים בודדים ומפרידים. SEM שימש כדי לדמיין את רצועות pellicle של שני מינים אוגלנואידים שונים.

כאשר משווים מונומורפינה ו Aenigmatica עם מונומורפינה פסאודו pyrum, הסידור סלילי גלוי של רצועות pellicle להגיח בקצה האחורי כדי ליצור זנב, לסייע פילוגניה לסיום. תמונות SEM של עיניים drosophila נורמלי להראות מערך מסודר של זיפים עדשות אבל ביטוי של חלבונים הקשורים למחלת אלצהיימר ליצור פנוטיפ העין המחוספסת. גנים המדכאים או משפרים את פנוטיפ העין המחוספסת עשויים למלא תפקיד פיזיולוגי בהתקדמות המחלה.

להלן דוגמאות לנפילות בור פוטנציאליות שיש להימנע מהן, כולל דוגמה למבנה הקרוס של העין מטכניקת ייבוש לא נכונה וטעינת אלקטרונים מקידוש לא מספיק של sputter המופיע במהלך רכישת תמונה. הפרוטוקולים המתוארים כאן השתמשו באורגניזמים בעלי שותפות מכובדת, אך כולם נוחים לניתוח SEM כדי לאסוף מידע שימושי ומורפולוגי שהוא קריטי לתגליות מדעיות המשתרעות על פני דיסציפלינות משנה רבות של ביולוגיה. אל תשכח כי עבודה עם אלכוהול T-Butyl, Hexamethyldisilazane, ו osmium tetroxide יכול להיות מסוכן ואת אמצעי הבטיחות המתאימים תמיד יש לראות כדי להגן על משתמשים, במיוחד סטודנטים אשר יהיה טיפול בכימיקלים אלה.