זיהוי של נוגדנים אנושיים Repertoires על ידי הדור הבא רצפי של עכבר
15 במרץ 2019
כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור ניתוח ו ויזואליזציה של המבנה ואת חוקת כל נוגדן repertoires. פעולה זו כוללת הרכישה של רצפי העצום של שימוש הדור הבא רצפי RNA נוגדן.
בסרטון זה, אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה לדמיין ולנתח רפרטואר נוגדנים ברמה הגלובלית. ניתן לתאר רפרטוארים שלמים של תאי B אצל אנשים ואת השינויים הדינמיים שלהם בתגובה לגירוי חיסוני. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי לנתח דגימות פתולוגיות מחולים של זיהומים ויראליים המתעוררים כדי לקבל את הנתונים עם תובנה חסרת תקדים לתוך הפתוגנזה של הזיהום.
אחד התחומים המרגשים ביותר עבור היישום הוא בקרת חיסון. יעילות החיסון יכולה להיות מוערכת על ידי ניתוח הדינמיקה של רפרטואר נוגדנים גלובלי אצל אנשים המנוהלים על ידי חיסונים. הפרט הם חדשים בשיטה זו ייתכן שיהיה צורך לייעל את תנאי PCR כי היעילות של הגברה גן נוגדנים תלוי בסוגי החומרים ההתחלתיים.
פלה-שר לזיהוי אמפילונים אימונוגלובולין. חשוב להדגים פעולות אלה באופן חזותי. הדגימו את ההליך יהיו מיס סיורי ימגוצ'י ומר הנבינג שו, טכנאי וסטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל בהליך זה, לנתח את הרקמה מעכבר שחור C57 בן שמונה שבועות ולהעביר אותו דרך רשת נירוסטה עם שני מיליליטר של PBS כדי להשיג תאים מפוזרים. מעבירים את ההשעיה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה שני מיליליטר וצנטריפוגה ב 600 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והוסף 800 מיקרוליטרים של מאגר ליזילינג ACK לכדור.
דגירה על קרח במשך שתי דקות כדי לריס תאי הדם האדומים ברקמה. לאחר מכן, לשטוף את תאי הרקמה שלוש פעמים באמצעות שלושה מיליליטר של PBS עבור כל לשטוף. צנטריפוגה שוב ב 600 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
השליכו את העל-טבעי והוסיפו 800 מיקרוליטרים של ריאגנט פנול/גואנידין איסקיוצ'ינאט לכדור ולמערבולת ביסודיות. דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של כלורופורם ומנערים ידנית למשך 15 שניות.
דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים g וב 25 מעלות צלזיוס כדי להפריד את השלבים. מעבירים את השלב הממימי העליון לצינור טרי.
הוסף אמצעי אחסון אחד של 70%אתנול. מערבולת בקצרה ולהחיל תערובת זו על עמוד ספין סיליקה. אלוט RNA עם 30 עד 100 microliters של מים.
לאחר מכן, השתמש פלואורומטר לכמת את ריכוז RNA הראשוני. אחסן את ה-RNA המטוהר במינוס 80 מעלות צלזיוס. ראשית, לסנתז את cDNA הגדיל הראשון משניים עד 10 מיקרוגרם של תבנית RNA הכוללת באמצעות פריימר CDS 5'RACE ואת oligonucleotide SMART-PCR על פי הוראות היצרן.
עבור אימונוגלובולין העכבר, PCR להגביר cDNA עם פולימראז DNA נאמנות גבוהה, באמצעות פריימר קדימה אוניברסלי פריימרים הפוכים ספציפיים בכיתה אימונוגלובולין, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עבור האימונוגלובולין האנושי, בצע את ה- PCR הראשון באמצעות פריימר קדימה אוניברסלי פריימרים הפוכים ספציפיים בכיתה אימונוגלובולין עם רצפי תגים. כלול את רצפי האינדקס עבור כל מדגם לפי PCR שני באמצעות פריימרים של רצף אינדקסים.
לאחר מכן, אלקטרופורזה אחד המוצרים PCR על ג'ל 2%agarose. דמיינו את רצועות הדנ"א על טרנסילומינטור UV ובלו את פרוסת הג'ל המכילה את הרצועה הרחבה בין 600 ל-800 זוגות בסיסים. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תוסף מחייב קרום לכל 10 מיליגרם פרוסת ג'ל.
מערבבים ומטמיבים ב-50 עד 65 מעלות עד שפרוסות הג'ל מתמוססות לחלוטין. לאחר מכן, להעביר את פתרון הג'ל על עמוד ספין קרום סיליקה. לשטוף את העמוד פעם אחת עם חיץ כביסה ולחמק ה-DNA עם 50 microliters של מים ללא גרעין.
באמצעות פלואורומטר, לכמת את האמפיקונים מטוהרים בריכה אמפילונים מכל מחלקה אימונוגלובולין בכמויות שוות עבור רצף NGS. לאחר מכן, השתמש באלקטרופורזה מבוססת מיקרו-קפרית עם שבב גודל DNA כדי לקבוע את הגודל והריכוז של הספריות. אחסן את הספריות במינוס 20 מעלות צלזיוס.
תחילה, צור גיליון אלקטרוני לדוגמה של רצף הפעלה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הפשיר מחסנית רייגנט והספריות. הפוך פתרון נורמלי 0.2 של נתרן הידרוקסיד לדלל את הספריות כדי להשיג את הריכוזים התותחנים הרצויים.
לאחר מכן, לשטוף ולייבש את תא הזרימה ולהוסיף 600 microliters של פתרון הספרייה מדולל denatured לתוך הבאר של מחסנית reagent, ולהתחיל את הריצוף לרוץ. פרספקטיבה של רפרטואר נוגדנים מורין ככלל ניתן להשיג תאים או רקמות כגון הטחול, מח עצם, בלוטות הלימפה, או דם. תוצאות מייצגות של IgM, IgG1, IgG2c, ו רפרטואר שרשרת אור אימונוגלובולין מתוך טחול עכבר נאיבי מוצגים כאן.
בסידור מחדש של V(D)J על-ידי התוויה תלת-מימדית V(D)J, הגודל של כל כדור מייצג את המספר היחסי של קריאות. במילים אחרות, הוא מייצג את מספר mRNAs נוגדנים בתאי B שלמים. רשת 3D מורכב 110 גנים שרשרת כבדה אימונוגלובולין V, 12 גנים שרשרת כבדה immunoglobulin D, וארבעה גנים שרשרת כבדה אימונוגלובולין J, אשר מיושרים כדי לשקף את הסדר שלהם על כרומוזום.
העלילה 2D VJ מציג את הפרופיל של סידור מחדש VJ רפרטואר IGL. האורך של כל מייצג מייצג את המספר היחסי של קריאות. ציר ה-X מייצג 101 גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין V-kappa, ושלושה גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין V-lambda, וציר Y מייצג ארבעה גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין J-kappa, ושלושה גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין J-lambda.
פרספקטיבה של רפרטואר נוגדנים אנושי ככלל ניתן לנתח מרקמות שונות כולל תאים מונונוקלאריים בדם היקפיים או רקמות פתולוגיות. התוצאות הייצוגיות של IgM, IgG סה"כ, IgA הכולל, IgD, IgE, ו IgL רפרטוארים של תאים מונונוקלאריים בדם היקפי תקין מוצגים כאן. בדומה לדגם המורין, פרופיל הרפרטואר של סידור מחדש של V(D)J מוצג בעלילה תלת-מימדית של V(D)J שבה גודלו של כל כדור מייצג את המספר היחסי של קריאות.
רשת 3D מורכבת 56 גנים שרשרת כבדה אימונוגלובולין V, 27 גנים שרשרת כבדה אימונוגלובולין D, ושישה גנים שרשרת כבדה אימונוגלובולין J, מיושר בסדר שהם מופיעים על כרומוזום. הפרופיל של סידור מחדש של VJ ברפרטואר IgL מתואר בעלילה של VJ הדו-מימדי שבה האורך של כל מייצג מייצג את המספר היחסי של קריאות. ציר ה-X מייצג 41 גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין V-kappa, ו-32 גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין V-lambda, וציר ה-Y מייצג חמישה גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין J-kappa, וחמישה גנים של שרשרת אור אימונוגלובולין J-lambda.
בחומר המחקר של פרוטוקול זה, מספר קטן של תאים ממוינים לפי ציטומטריה זרימה או אפילו cryosections של דגימות פתולוגיות הם שמיש. עם זאת, אופטימיזציה זהירה של תנאי PCR יהיה צורך. מכיוון שמידע התפוקה של פרוטוקול זה הוא עצום, אוריינות ביואינפורמטיקה תעזור למצוא את המבנה של רשת הנוגדנים.
זה יוביל ללא קשר להבנה עמוקה של המערכת החיסונית.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לניתוח ולהדמיה של רפרטוארי נוגדנים באמצעות רצף דור הבא (next-generation sequencing). גישה זו מאפשרת לבחון רפרטוארי תאי B והשינויים שחלים בהם בתגובה לגירוי חיסוני, ובכך מספקת תובנות לגבי יעילות חיסונים ופתוגנזה של מחלות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- גנומיקה
- פתולוגיה
רקע
- הבנת רפרטוריוני הנוגדנים היא קריטית להערכת תגובות חיסוניות.
- ריצוף הדור הבא מאפשר ניתוח מקיף של גנים של נוגדנים.
- ניתן להחיל שיטה זו הן על דגימות בריאות והן על דגימות פתולוגיות.
- התובנות שיירכשו יכולות להנחות פיתוח חיסונים ואסטרטגיות לטיפול במחלות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לוויזואליזציה וניתוח של רפרטוארים של נוגדנים.
- הערכת הדינמיקה של תגובות נוגדנים בהקשרים שונים.
- אספקת מסגרת להערכת יעילות של חיסונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח ועיבוד של רקמת עכבר להשגת תאי B.
- הפקת RNA וסינתזת cDNA להגברה של גנים של נוגדנים.
- ריצוף דור הבא (Next-generation sequencing) של גני נוגדנים שהוגברו.
- ויזואליזציה של נתוני הרפרטואר של הנוגדנים באמצעות תרשימים בתלת-ממד ובדו-ממד.
תוצאות עיקריות
- הגברה וריצוף מוצלחים של גנים של נוגדנים מדגימות של עכברים ובני אדם.
- ויזואליזציה של דפוסי ארגון מחדש של V(D)J ברפרטוארים של נוגדנים.
- הדגמה של שינויים דינמיים בתגובות נוגדנים לאחר חיסון.
- תובנות לגבי הרכבם של רפרטוארי נוגדנים במצב בריאותי ובמחלה.
מסקנות
- השיטה מספקת מסגרת איתנה לניתוח רפרטוירים של נוגדנים.
- הממצאים עשויים לשפר את ההבנה של תגובות חיסוניות ולהנחות אסטרטגיות טיפוליות.
- גישה זו ישימה לתחומי מחקר מגוונים, כולל פיתוח חיסונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי מקיף של רפרטוארי נוגדנים בעכברים ובבני אדם באמצעות רצף מהדור הבא (NGS) מאפשר תובבנות חסרת תקדים לגבי גיוון חיסוני ודינמיקה של תגובה חיסונית. יכולת זו היא קריטית להפחתת סיכונים בשלבי הגילוי המוקדמים, לתמיכה בהערכת חיסונים ולסבסוס מחקרים תרגומיים על מחלות ממסור חיסוני. ניתוח רפרטואר ברזולוציה גבוהה מחזק את הביטחון החזוי בנקודות תפנית מרכזיות בצינורות הפיתוח של הביופארמה המונחים על ידי אימונולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה גלובלית של גיוון תאי B ומנגנוני תגובה חיסונית.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מיפוי שימוש בגנים של V(D)J והתרחבות קלונית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מתוכן מנגנונית בתוכניות גילוי המתמקדות באימונולוגיה.
סינון ופיתוח בדיקות
- מספק תוצאות כמותיות ובספיקות גבוהה של שכיחויות גני נוגדנים לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר מיפוי שחזור של רפרטוארים חיסוניים לאורך דגימות ותנאים ביולוגיים.
- תומך בסריקה ניתנת להרחבה של התערבויות חיסוניות או טיפוליות באמצעות ניטור שינויים ברפרטואר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם נתוני רפרטואר חיסוני עם סמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה ואסטרטגיות לסיווג חולים.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני על ידי מעקב אחר דינמיקה חיסונית בתגובה לגירוי או פתולוגיה.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון בפיתוח חיסונים ובאימונותרפיה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו לאפיון רפרטואר נוגדנים המבוססת על NGS משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד למחקר תרגומי, ומאפשרת קבלת החלטות מונחית-נתונים בשלבים מרובים של תהליך הפיתוח.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת מיפוי ברזולוציה גבוהה של מגוון נוגדנים לצורך בחינת היפותזות והבהרת מסלולים.
- סריקה: מספקת תוצאים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך ניטור חיסוני ובדיקת מוכנות של הבדיקה (assay readiness).
- אנליטיקה: מייצרת מערכי נתונים של רצפים בקנה מידה רחב והדמיות (תרשימי V(D)J בתלת-ממד, תרשימי VJ דו-ממדיים) לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין שינויים ברפרטואר למצבי מחלה או לתגובות לוואקצינים, ובכך תומכת בהתאמה של סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת להרחבה ולהתאמה לניתוח רפרטואר חיסוני בתוכניות מחקר מגוונות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתוכניות המכוונות למערכת החיסון.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה לאפיון חיסוני ותומך ביכולת הרחבה לסריקה בשfected-throughput.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go והקצאת הון באמצעות אספקת נתונים חזקים על התגובה החיסונית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של נכסי אימונולוגיה וחיסונים מותאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהכנת ספריות NGS, אופטימיזציה של PCR ואנליזה ביואינפורמטית.
- דורש גישה לפלטפורמות ריצוף בעלות תפוקה גבוהה ותשתיות מחשוב.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של עיבוד דגימות ופרשנות נתונים.
- ניתן להתאמה לסוגי דגימות שונים, כולל תאים ממוינים ורקמות פתולוגיות, באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- אוריינות ביואינפורמטית היא חיונית לניהול ופרשנות של סטים של נתוני רפרטואר בקנה מידה גדול.
