אוסף זרע באיכות דיפרנציאלית בעזרת צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של הזרע, כגון הקובעים הכימיים של איכות הזרע. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להפריד כמויות גדולות של מדגם לפי איכות, כמו גם הסתגלות בהשוואה לשיטות חלופיות. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה ההבדלים באיכות הזרע, זה יכול להיות מיושם גם על דגימות אחרות כגון סוגי תאים מעורבים או רכיבים subcellular עם צפיפות שונה.

כדי להתחיל, לעשות שני 3 מיליליטר דילול פרקול בשני צינורות נפרדים. במבחנה נקייה, לדלל 1 מיליליטר של דגימת זרע עם 2 מיליליטר של PBS. מזלבים אותו בעדינות כדי לערבב את הפתרון.

הוסף 3 מיליליטר של מסיסות פרקול בצפיפות נמוכה יותר לצינור חרוט סטרילי. לאחר מכן, בזהירות pipette 3 מיליליטר של פתרון פרקול צפיפות גבוהה יותר מתחת לפתרון פרקול צפיפות נמוכה יותר. תוך הטיית הצינור חרוט בזווית של 45 מעלות, פיפטה 3 מיליליטר של מדגם הזרע מדולל על גבי שיפוע צפיפות פרקול.

לאחר הכנת צינור ריק, צנטריפוגה שני הצינורות ב 1500 Gs במשך 20 דקות. לבטח כי שלוש שכבות נפרדות של זרע נוצרו באמבטיה לאחר צנטריפוגה. באמצעות פיפטה לאסוף את שלוש שכבות הזרע, החל בשכבה העליונה, ואחריו השכבה האמצעית, וכלה גלולה קשה בתחתית הצינור.

מעבירים כל אחת מהשכבות לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי. לדלל כל דגימות הזרע עם 1.5 מיליליטר של PBS צנטריפוגה הדגימות ב 1500 Gs במשך עשר דקות. לבסוף, לשפוך את supernatant ולהשבת את כדורי עם חיץ תנועתיות.

בפרוטוקול זה, טכניקת הצנטריפוגה של צפיפות פרקול, או PDGC, שימשה להפרדת דגימת זרע לשלוש שכבות נפרדות. הזרע נפרד לשכבה איכותית מתחת לפתרון הצפיפות הגבוהה יותר, שכבה באיכות בינונית בין פתרונות הצפיפות הגבוהה והתחתון, ושכבה באיכות נמוכה מעל פתרון הצפיפות הנמוכה יותר. הבדלים אלה באיכות הזרע באים עדות על ידי הבדלים בכדאיות, ניידות וחדירה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי דגימות צריך להיות הביא לטמפרטורת החדר. ההצלחה של PDGC מסתמכת על הכנה זהירה של שיפוע, כמו גם אוסף זהיר של שכבות מבודדות. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקר שלנו בתחום פרדיומיקה הזרע לחקור סמנים ביולוגיים של פוריות במיני עופות.