Name: קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: למד הכנת תאים בודדים מהתימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול בעכברים לניתוח ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת זיהוי תת-אוכלוסיות של תאי T רגולטוריים במחקרים אימונולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר הנוכחי נתמך כלכלית על ידי המועצה למחקר השבדי, EXODIAB, קרן סוכרת שוודית, קרן סוכרת ילד שבדי, סאב Diabetesfonden רוצה שתיכנס לשם ו Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. המחברים גם רוצה תודה לכל-אולה Carlsson, סטלאן סנדלר שלהם תומך ודיונים.

ועדת האתיקה בעלי חיים מקומיים באוניברסיטת אופסלה אישרה את הניסויים בבעלי חיים.
1. קצירת איברים מבעלי חיים
<ol><li>להקריב את העכברים מאת נקע בצוואר הרחם.</li>
	<li>מקום בלוטות הרתי ומאוזנת טחולים בקבוקונים נצנוץ 20 mL או 15 מ"ל צינורות חרוט מלא עם 5 מ של Hanks´ תמיסת מלח (HBSS). המקום PDLNs 1.5 mL מיקרו צינורות מלאים 1 מ"ל של RPMI 1640. השתמש התימוס כל הטחול, ואני את כל PDLNs. הערה: איברים יש לשמור על קרח לאורך כל ההליך, החוקר צריך לנסות להיות מהיר תוך כדי הכנת המתלים תא בודד, במיוחד כאשר טיפול רקמות הרתי מאז תאים חיסוניים הרתי יכול להיות מושפל במהירות בטמפרטורות גבוהות.</li>
</ol>2. ותא בידוד של בלוטת התימוס וה טחול
<ol><li>מחצי ביסודיות את בלוטת התימוס וה טחול עם זוג מספריים כדי לשחרר את התאים החיסוניים. למחוק את הקפסולה הרתי, הטחול הנותרים.</li>
	<li>העברת התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 433 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי ליצור גלולה. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>כדי lyse כדוריות דם אדומות, resuspend התליה תא ב 5 מ של 0.2 מ' NH4קלרנית, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות היפוך הצינורות upside מטה בעדינות כל 2 דק הוסף 5 מ של HBSS בסוף הדגירה כדי לעצור את פירוק.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא כ 5 מ של HBSS. למלא את הצינורות HBSS.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא כ 5 מ של HBSS. למלא את הצינורות HBSS.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב 5 מ של HBSS עבור התימוס, 10 מ של הטחול.</li>
	<li>1 מ"ל של התליה תא הרתי והעברת µL 500 של התליה תא הטחול 5 מ ל עגול התחתון צינורות עם תא מסננת כמוסות. החל התליה תא את הפקקים מסננת של התא. הערה: רשת ניילון מיקרומטר 35 הוא שולב הכיפה. כ 5-10 מיליון תאים נאספו כל צינור.</li>
</ol>3. תא ותא בידוד מ- PDLN
<ol><li>מיקום רשת מתכת מיקרומטר 250 סטרילי מעל צינור חרוטי 15 מ"ל בארון תקשורת. יש לשטוף את רשת השינוי עם 1 מ"ל של RPMI.</li>
	<li>להעביר את בלוטות הלימפה מתכת רשת שינוי, לטחון אותם דרך הרשת בעזרת זוג מספריים. החל מ 1 ל RPMI על מתכת רשת שינוי כדי לשטוף את התאים לתוך הצינור. חזרה 3 פעמים יותר ולהסיר את רשת השינוי.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא כ 5 מ של RPMI. למלא את הצינורות RPMI.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא כ 5 מ של RPMI. למלא את הצינורות RPMI.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב- 2 מ של RPMI. העברת 2 מ"ל של התליה תא 5 מ ל עגול התחתון צינורות עם תא מסננת כמוסות. החל התליה תא את הפקקים מסננת של התא.</li>
</ol>4. דנ
<ol><li>Centrifuge את המתלים תאים התימוס, PDLN, טחול ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>כתם התאים עם נוגדנים השטח הבאים ב- 100 µL של cytometry זרימה מכתים מאגר (FACS מאגר): 0.75 נוגדן µg/100 µL FITC מצומדת CD4, 0.60 נוגדן CD8 APC-H7-מצומדת µL µg/100, µg/100 0.30 µL מצומדת PE CD25 נוגדן, 5 µL (1:20) נוגדנים Nrp1 מצומדת-APC. דגירה הצינורות על קרח למשך 40 דקות.</li>
	<li>להוסיף 200 µL FACS מאגר כל שפופרת. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. אני חוזר עוד פעם אחת.</li>
	<li>לתקן, permeabilize את התאים על ידי resuspending בגדר תא ב- 500 µL של המאגר קיבוע Permeabilization (PFB). הערה: PFB מוכן על ידי ערבוב חלק 1 של קיבעון/Permeabilization להתרכז בשלושה חלקים של קיבעון/Permeabilization Diluent.</li>
	<li>להשאיר את הצינורות במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: דגירה 1 h עובד גם.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב- 500 µL של Permeabilization שטיפה מאגר (PWB). Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. הערה: PWB מוכן על ידי דילול Permeabilization מאגר (10 x) 1:10 במים מזוקקים.</li>
	<li>כתם התאים עם נוגדנים תאיים הבאים ב- 100 µL של PWB: 0.30 נוגדן µg/100 µL PE-Cy7-מצומדת Foxp3, נוגדן PacificBlue מצומדת הליוס µL 4 (1:25). דגירה הצינורות על קרח לשעה.</li>
	<li>להוסיף 500 µL של PWB כל שפופרת. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב- 500 µL של PWB. Centrifuge הצינורות ב x 433 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב- 300 µL מאגר FACS.</li>
	<li>לנתח את התאים על cytometer זרימה.</li>
	<li>שער של תאים בודדים בהתבסס על הצד פיזור-אזור, גובה, רוחב, ו קדימה פיזור-אזור, גובה ורוחב. הפעל מיליון אירועים לניתוח.</li>
	<li>ייצוא קבצים FCS ניסויים ולנתח אותם באמצעות תוכנה מנתח cytometry זרימה.</li>
</ol>

<ol><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4%2BCD25%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
<li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+regulatory+T+cells+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Helios%2C+an+Ikaros+transcription+factor+family+member%2C+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li>
<li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells%2C+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li>
<li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767(2015).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633(2015).</li>
<li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229(2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

במחקר זה, אנחנו מבודדים תאים בודדים בלוטות הרתי, PDLNs, טחולים של עכברים הנהון, חקרה את הביטוי של הליוס, Nrp1 ב CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg תאים באמצעות cytometry זרימה. במחקר הנוכחי, הנהון עכברים שימשו, אשר הוא מודל מאתר של סוכרת מסוג 1. במחקר הקודם, השתמשנו פראי סוג העכבר זנים CD-1 ועכברים C57BL/6 לחקור אם הליוס או Nrp1 הוא סמן טוב יותר להבחנה בין tTreg תאים מתאי pTreg. במחקר הזה, השתמשנו פרוטוקול דומה כדי לקבוע תת-קבוצות של תאים Treg תמים עכברים9. מצאנו ...

הרגולציה ותאי T (Treg) הם קריטיים עבור הומאוסטזיס של מערכת החיסון. Treg תאים מוגדרים על-ידי הביטוי של פני השטח אנטיגנים CD4 ו CD25 ולאחר שעתוק מקדם forkhead P3 תיבת (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. קודם הראה כי CD25 מתבטאת צורונים על תאי T משתיק קול עכברים4, אשר סיפקה תצפית חלוצית לצורך זיהוי תאים אנושיים Treg. תאים Treg לשחק תפקיד מרכזי סובלנות המערכת החיסונית מצידה בעל יכולת מדכאים באמצעות מגוון של מנגנונים, כולל cytolysis באמצעות ההפרשה של granzymes כדי לגרום אפופטוזיס, צריכת ציטוקין וניגוד דרך הביטוי של ציטוטוקסיות לימפוציטים-T אנטיגן 45. בנוסף, הם יכולים להפריש ציטוקינים מעכבות כגון הפיכת גורם הגדילה בטא (TGF-β), אינטרלויקין-10 (IL-10) ו- IL-355. Treg תאים באופן טבעי הנגזרות התימוס, ובמקרה הזה והם מיועדים תאים Treg (tTreg) נגזר הרתי, או שהם יכולה להיגרם באיברים ההיקפיים באותו מקרה נקראים תאים Treg (pTreg) באופן עקיף המושרה.
הליוס, חבר של משפחת פקטור שעתוק Ikaros, דווח כדי להיות סמן להבחנה בין תאים tTreg, pTreg תאים6. מאוחר יותר, שתי קבוצות אחרות דיווחו כי Neuropilin 1 (Nrp1), קולטן השלישי semaphorin, יכול לשמש כסמן משטח של תאים tTreg תחת תנאים מסוימים,7,8. למרות זאת, סינג ואח הראו כי הליוס הוא סמן טוב יותר בהקשר זה נאיבי עכברים9.
קבוצות משנה של תאים Treg לשחק תפקיד מרכזי שמירה על הומאוסטזיס מערכת החיסון, הגנה מפני מחלת חיסון עצמי ולדלקת. לכן, חשוב לקבוע את המספרים ואת הפרופורציות של אוכלוסיות אלה ברקמות הלימפה והן הלא-הלימפה. כדי להשיג זאת, יש להכין את המתלים תא בודד מן האיברים האלה. מספר פרוטוקולים המתוארים או בשימוש במחקרים קודמים. בעיקר, dissociators אוטומטי שימשו דוחות שפורסמו בעבר10,11. שימוש dissociators אוטומטי הוא נוח והוא חסכון בזמן, אבל זה הליך יקר. לכן, השתמשנו בשיטה ידנית כדי להכין המתלים תא בודד מאתר בלוטות הרתי, הלבלב ניקוז הלימפה (PDLNs), טחולים normoglycemic (הנד) שאינו שמנים בעכברים סוכרתיים, תאים בודדים מבודדת מן האיברים האלה. בשיטה זו נעשה שימוש במחקרים קודמים שלנו ומצאנו כי השיטה הידנית להכנת התליה תא בודד הוא יעיל כמו dissociator אוטומטי שיטה9,12,13,14. יתר על כן, השתמשנו cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg תאים, תת-קבוצות של Treg תאים תאים tTreg ו- pTreg. התאים tTreg ו- pTreg היו מכובדים באמצעות הליוס Nrp1 כסמני תא tTreg. לכן, התוצאות שלנו עולה כי השיטה הידנית עבור הכנת את התאים לעבוד בצורה יעילה המתלים מוכן תא בודד יכול לשמש עוד יותר עבור מחקרים באמצעות cytometry זרימה.

<table><tbody><tr><td>עכברי</td><td></td><td></td> NOD <td>לחם ביתי</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Statens veterin&auml; rmedicinska anstalt</td><td>991750</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD Millipore</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / סט מאגר צביעה של גורם שעתוק</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td>מכיל תרכיז קיבוע/פרמביליזציה, מדלל קיבוע/פרמביליזציה ומאגר פרמביליזציה (פי 10)</td></tr><tr><td>eBioscience Flow Cytometry מאגר צביעה</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>CD4 נוגדן חד שבטי (RM4-5), FITC, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0042-85</td><td></td></tr><tr><td>CD25 נוגדן חד שבטי (PC61.5), PE, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>12-0251-83</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen&nbsp; APC-H7 עכברוש נגד עכבר CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>560182</td><td></td></tr><tr><td>עכבר Neuropilin-1 נוגדן מצומד APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5994A</td><td></td></tr><tr><td>FOXP3 נוגדן חד שבטי (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>25-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>פסיפיק כחול נגד עכברים/נוגדן הליוס אנושי</td><td>BioLegend</td><td>137220</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול, עם מכסה הצמד מסננת תאים</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td>A 35 &micro; רשת ניילון m משולבת בכובע הצמד במיקום כפול</td></tr><tr><td>צינור 15 מ"ל, 120 מ"מ x17 מ"מ, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו צינור 1.5 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני נצנוץ חד פעמיים</td><td>WHEATON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Flow Cytometry תוכנה לניתוח ציטומטריה</td><td>Inivai</td><td>Technologies Flowlogic</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת קבוצות משנה תא t רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות cytometry זרימה

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

המערכת החיסונית שלנו מורכב מספר ומגוון של תאים חיסוניים כולל הרגולציה ותאי T תאים (Treg). Treg תאים מתחלקים שתי קבוצות משנה, תאים Treg (tTreg) נגזר הרתי ותאים Treg (pTreg) באופן עקיף המושרה. הם נמצאים איברים שונים של הגוף שלנו, ניתן להבחין באמצעות סמנים ספציפיים, כגון הליוס ו- Neuropilin 1. בעבר דווח כי תאים tTreg הם באופן פונקציונלי יותר מדכא מאשר תאים pTreg. לכן, חשוב לקבוע את הפרופורציה של תאים הן tTreg והן pTreg, כאשר חוקרים אוכלוסיות הטרוגניות תא. במסמך זה, אספנו הרתי בלוטות לימפה המנקזים הלבלב, טחולים מ normoglycemic בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים להבחין tTreg תאים מתאי pTreg באמצעות cytometry זרימה. הכנו באופן ידני את המתלים תא בודד מן האיברים האלה. Fluorochrome מצומדת CD4 משטח, CD8, CD25, נוגדנים Neuropilin 1 שימשו כדי להכתים את התאים. הם נשמרו במקרר למשך הלילה. ביום הבא, התאים היו מוכתמים נוגדנים Foxp3 ואת הליוס תאיים fluorochrome מצומדת. סמנים אלה שימשו כדי לאפיין את שתי קבוצות משנה של תאים Treg. פרוטוקול זה מדגים דרך פשוטה אך מעשית כדי להכין תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול, להשתמש בהם עבור ניתוח cytometric תזרים עוקבות.

לחקור את הביטוי של Nrp1, הליוס על תאים tTreg ו- pTreg, אנו מוכנים תאים בודדים מן בלוטות הרתי, PDLNs, טחולים normoglycemic הנד עכברים, מוכתם אותם Treg תא הסמנים CD4, CD25, Foxp3, הליוס ו Nrp1 עבור זרימה cytometric ניתוח. התוצאות נותחו כפי שמוצג עם הנציג של gating אסטרטגיות (איור 1). מצאנו כי היחס של הליוס+ תאים בין CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg תאים היה גבוה מזה של Nrp1+ תאי כל שלושת האיברים (<strong...

במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול ללימוד נוסף תאים אלה באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, פרוטוקול זה שימש לקביעת תת-קבוצות של הרגולציה ותאי T באמצעות cytometry זרימה.

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

פרוטוקול זה מסייע בחקירת תפקידם של תאי החיסון באיברים מסוימים בבריאות ובפתולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי זוהי טכניקה חסכונית שכן היא טכניקה ידנית. הדגמת ההליך תהיה Zhengkang לואו, דוקטורנט מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, מניחים את בלוטות התימית והטחול מעכברים שהומות בעבר לתוך 20 מיליליטר phials scintillation, או 15 מ"ל צינורות חרוטיים, מלא 5 מ"ל של תווי מלח מאוזנים של האנק. מניחים את בלוטות הלימפה ניקוז הלבלב לתוך 1.5 מ"ל מיקרו צינורות מלא 1 מ"ל של RPMI-1640. הקפד להשתמש בכל התימוס והטחול, ובכל מחשבי ה- PDLNs.שמור את האיברים על קרח לאורך כל ההליך. באמצעות זוג מספריים, לסחוט ביסודיות את התימוס והטחול כדי לשחרר את התאים החיסוניים. השלך את שאר הכמוסות התימוסיות והטחולות.מעבירים את ההשעיה התא לצינור חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 433 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהשליך את supernatant. כדי לתפור את תאי הדם האדומים, להשעות מחדש את ההשעיה התא ב 5 מ"ל של 0.2 כלוריד אמוניום מולאר, דגירה בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות.להפוך את הצינורות בעדינות כל שתי דקות. בסוף הדגירה, מוסיפים 5 מ"ל של HBSS כדי לעצור את התסיסה. צנטריפוגה הצינורות ב 433 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים בכ- 5 מ"ל של HBSS. לאחר מכן, למלא את הצינורות עם HBSS. חזור על תהליך זה, מ צנטריפוגה הדגימות למילוי הצינור עם HBSS, פעם אחת.צנטריפוגה הצינורות שוב ב 433 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי, והשהה מחדש את גלולת הכדור ב- HBSS. השג צינורות עגולים תחתונים 5 מ"ל עם כובעי מסננת תאים.העברה 1 מ"ל של ההשעיה תא התימית ו 500 microlitres של ההשעיה תא הטחול על הצינורות על ידי החלת ההשעיה על כובעי מאמץ התא. ראשית, מניחים צינור חרוט 15 מ"ל לתוך מתלה. מניחים רשת מתכת סטרילית 250 מיקרומטר מעל הצינור.שוטפים את רשת שינוי עם 1 מ"ל של RPMI. לאחר מכן, להעביר את בלוטות הלימפה רשת מתכת ולהשתמש זוג פינצטה לטחון אותם דרך רשת. החל 1 מ"ל של RPMI על רשת שינוי כדי לשטוף את התאים לתוך הצינור.חזור על תהליך זה של העברה ושחזה בלוטות הלימפה שלוש פעמים עבור כל מדגם, ולאחר מכן להסיר את רשת. צנטריפוגה הצינורות ב 433 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים בכ- 5 מ"ל של RPMI.לאחר מכן, למלא את הצינורות עם RPMI. חזור על תהליך זה, מ צנטריפוגה הדגימות למילוי הצינור עם RPMI, פעם אחת. צנטריפוגה הצינורות שוב ב 433 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת התא ב-2 מ"ל של RPMI. מעבירים 2 מ"ל של ההשעיה התא לתוך 5 מ"ל צינורות עגולים תחתונים עם כובעים מסננת תא. ראשית, צנטריפוגה ההשעיה התא מן התימוס, טחול ו PDLN דגימות ב 433 פעמים g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעי. הכתם את התאים בנוגדני פני השטח כמתואר בפרוטוקול הטקסט, והמדגר את הצינורות על הקרח במשך 40 דקות. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר FACS לכל צינור.צנטריפוגה ב 433 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהשליך את supernatant. חזור על תהליך זה, הוספת המאגר, צנטריפוגה ומחילה של העל-טבעי, פעם אחת. להשעות מחדש את גלולת התא ב 500 microliters של מאגר קיבוע חדירה כדי לתקן ולחלחל את התאים.מעבירים את הצינורות למקרר ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, צנטריפוגה הצינורות ב 433 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי, והשהה מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטרים של חיץ כביסה חדיר.צנטריפוגה התאים שוב ב 433 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. הכתם את התאים בנוגדנים תאיים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דגירה הצינורות על קרח במשך שעה אחת.לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של חיץ כביסה permeabilization לכל צינור. צנטריפוגה ב 433 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור ב-500 מיקרוליטרים של חיץ כביסה חדיר.צנטריפוגה פעם נוספת ב 433 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת התא ב- 300 מיקרוליטרים של מאגר FACS. לאחר מכן, נתח את התאים על ציטרומטר זרימה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.במחקר זה, תאים בודדים מבודדים בלוטות התימית, PDLNs וטחול של עכברי NOD גליקמי נורמלי, והם מוכתמים סמני תא Treg, CD4, CD25, Foxp3, הליוס, ו נוירופילין-1 לניתוח ציטומטרי זרימה. התוצאות מנותחות ומוצגות כאן כאסטרטגיות גת מייצגות. חלקם של תאים חיוביים הליוס בין CD4 חיובי, CD8 שלילי, CD25 חיובי, Foxp3 חיובי Treg תאים נתפסת להיות גבוה יותר מזה של תאים חיוביים Nrp1 בכל שלושת האיברים.יותר מ 80% של תאי Treg התימוס נראים לבטא הליוס, אשר גבוה יותר מאשר PDLN, ואת הטחול. שיעור התאים החיוביים NrP1 בקרב תאי Treg חיוביים הליוס נראה גבוה יותר PDLN מאשר אלה התימוס או הטחול. רוב תאי ה-Treg החיוביים של Nrp1 מבטאים גם הליוס, ואת שיעור התאים החיוביים הליוס בקרב תאי Treg חיוביים Nrp1 נראה להיות גבוה יותר התימוס והטחול מאשר PDLN.יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך הליוס הוא סמן טוב יותר כדי לזהות תאי Treg מאשר Nrp1. בלוטות הלימפה הם קטנים, אבל כמה סמנים תאיים דורשים מספר רב של תאים כדי לתת אות טוב ציטומטריה זרימה. אין אפשרות לבצע פעולות שירות אחרות לאחר הליך זה מאחר שהתאים כבר מוכתמים ומתים.אבל ארבעת סמני התאים של החיה יכולים להיות מוחלפים כדי לחקור סוגים אחרים של תאים חיסוניים.

determination-regulatory-t-cell-subsets-murine-thymus-pancreatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

זוהי שיטה מהירה ומקיפה של immunophenotyping מיאלואידית תאים מדכאי נגזרות (MDSC) ומעשירה...

הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (MDSC) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (AutoMACS)

אנו מציגים שיטת זרימת cytometry מבוסס לבחון התפתחות תא...

בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאים בודדים מבלוטות לימפה מנקזות לבלב מורין (PDLNs) ואפיון תאי T רגולטוריים (Tregs) מאוכלוסיית התא הבודד באמצעות ציטומטריית זרימה. Tregs מזוהים על סמך הביטוי החיובי של סמני פני התא CD4, CD25 ו-Nrp1, יחד עם גורמי השעתוק הגרעיניים Foxp3 ו-Helios.

זיהוי תת-קבוצות תאי T רגולטוריות מבלוטות לימפה מנקזות לבלב מורין

עם פונקציות מפעיל להבדיל מתת תא T אחר, תאי Th17 היו מעורבים באופן מרכזי באוטואימוניות דלקתיות. במבחנה פרוטוקול בידול Th17 זו מספק אמצעי כדי לקבוע אם לימפוציטים מסוג CD4 + T נאיביים יכולים להתמיין לתאי Th17, ולבחון את תפקידם באוטואימוניות ותגובת מארח נוסף.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

תאי T נאיביים CD4+ מקוטבים לתת-קבוצות שונות בהתאם לסביבה בזמן ההפעלה.  ניתן להשיג את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתת-קבוצות אפקטורים שונות במבחנה באמצעות הוספת גירויים של קולטני תאי T ואותות ציטוקינים ספציפיים.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

מאמר זה מתאר ספקטרלי cytometry, גישה חדשה ב cytometry הזרימה המשתמשת צורות של ספקטרום פליטה להבחין fluorochromes. אלגוריתם מחליף פיצויים יכול לטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. גישה חדשה זו מאפשרת הניתוח הראוי של תאים מבודדים איברים מוצקים.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

מאמר זה מדגים שיטה חזקה לכמת המיטוכונדריה או lysosomes בתאים חיים. השילוב של צבעי ספציפיים ליזוזום או המיטוכונדריה עם נוגדנים fluorescently מצומדת סמני פני השטח מאפשר כימות של אלה organelles אוכלוסיות מעורבות לתאים, כמו ראשי תאים שנקטפו דגימות רקמה, באמצעות cytometry זרימה ססגוניות.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול cytometric זרימה כדי לזהות CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאים B, תאי NK ומונוציטים בדם היקפי האנושי באמצעות fluorochromes רק שני במקום שבעה. עם גישה זו, ניתן לרשום חמישה סמנים נוספים על רוב זרימה cytometers.

אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ציטומיטרי זרימה מפורט ושחזור כדי לזהות מונוציט / מקרופאג ותת-תאים T-ערכות באמצעות שניהם אקסטרה-ותוך תאי כתמים כתמים בתוך הטחול murine, מח עצם, בלוטות הלימפה ורקמות synovial, ניצול מודל כירורגי מבוסס של דלקת מפרקים ניוונית מורין.

ניתוח ציתום זרימה של תת-סטים של תאים חיסוניים בתוך הטחול מורין, מח העצם, בלוטות הלימפה ורקמות Synovial במודל דלקת מפרקים ניוונית

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

פרוטוקול זה מספק אסטרטגיית קו-קולטורציה במבחנה לחקר השפעות תאי T רגולטוריים על התרבות והבדייל של תאי T אפקטוריים.

In-Vitro ניתוח פונקציונלי של תאי T רגולטוריים: התמקדות בהתרבות ובהתמיינות

למד הכנת תאים בודדים מהתימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול בעכברים לניתוח ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת זיהוי תת-אוכלוסיות של תאי T רגולטוריים במחקרים אימונולוגיים.

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

גלה סרטונים נוספים