הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק

פרוטוקול זה מתקשר ההכנה גזע המוח-עמוד השדרה של מבהיר את הכנת פרוסות רוחבי גזע המוח באופן מקיף שלב אחר שלב. זה נועד להגדיל את הפארמצבטית ולשפר את הסבירות של קבלת פרוסות קיימא, לאורך זמן, בקצב אחיד-פעיל עבור הקלטה פלט עצבית מהאזורים הנשימה של גזע המוח.

שיטה זו מקלה על ניתוח להתרבות ו חיתוך של מוחות מכרסמים לניתוח שנתפס של רשת הנשימה מדולרי Mirian. טכניקה זו מציעה גמישות ניסיונית רבה, מה שמאפשר להכין ביטול חסימה במבחנה או הכנת פרוסה להקלטה. שיטה זו עשויה לשמש לניסויים אלקטרופיזיולוגיים כדי לחקור את מעגל הבקרה העצבית המייצרת מקצבי נשימה ולהבין את הפתולוגיה ואת פירוק הנשימה במכרסמים מהונדסים גנטית.

לאחר ניתוח של neuraxis, להעביר במהירות את תא המטען המבודד של החיה לתא ניתוח aerated תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהנח את הרקמה הגב בצד למעלה, עם הקצה rostral מול החלק הקדמי של התא. הצמד את הרקמה בכתפיים ואת הקצה האידיוט ביותר של חוט השדרה ולעשות חתך midsagittal דרך הגולגולת בעקבות התפר הקודקודי, כדי למנוע פגיעה בקליפת המוח ואת גזע המוח מתחת לגולגולת. החל בתפר הסגיטלי ועובד באופן כללי, לחטוף את התפרים העורפיים של הגולגולת כדי ליצור מדפים של עצם שעשויים לבוא לידי ביטוי מוצמד לעגון ולייצב את החלק rostral של הגולגולת.

לאחר המשקף את שני מדפים הגולגולת, בלו את שאר קליפת המוח, משאיר את החלק caudal של המוח הקטן יחסית שלם לבצע כריתת למין הגב. השתמש מספריים קפיץ מיקרו מדפים כדי להסיר את השרירים המקיפים את הגולגולת ואת עמוד החוליות. הסר את הרקמה לאורך הצד הגבי של בית החזה, משאיר את הצלעות שלמות בזהירות לחתוך את התהליכים הצדדיים של למינה החוליות.

לאחר חיתוך כל רקמה overlying את הפונס medulla, vermis, המוח הקטן, פונס ותחילת חוט השדרה, יהיה גלוי בבירור. כדי לבצע כריתת גחון, מניחים את הרקמה בצד הגב למטה ומצמידים בבית החזה ואת הקצה האוקולי ביותר של עמוד השדרה. השתמש מדפים הגולגולת להצמיד את הצד rostral של הרקמה ולהסיר את החצי הגחוני של בית החזה, כולל עצם החזה ואת כל איברי הבטן.

לנתח את הרקמה הרכה המחוברת לבית החזה כדי לחשוף את הצלעות וחוט השדרה ולהסיר את הלשון, הוושט, קנה הנשימה, הגרון וכל הרקמה הרכה האחרת ואת השרירים מעל בסיס הגולגולת ועמוד השדרה. על מנת לזהות את המשטח הקשה, לנתח את הרקמה overlying זה צלחת מלבנית של עצם בבסיס הגולגולת, הכולל חריץ בצורת v. ואז לחתוך לאורך קו האמצע של המשטח, בזהירות להרים את הרקמה כלפי מעלה ולבצע חתך רוחבי כדי להסיר אותו.

כדי להתחיל כריתת למין גחונית, להסיר את למינה, חושף את פני השטח הגחוניים של גזע המוח ואת חוט השדרה מן החוליה הצווארית הראשונה לחוליה בית החזה בערך שבע ולתוך חמישה עד 10 מילימטרים לאורך שני צידי עמוד השדרה בלמינה. כאשר חוט השדרה נחשף, חותכים את השורשים כ-20 עד 25 מילימטרים דו-צדדיים, לאורך עמוד השדרה ל- T7 בקירוב ומרימים בזהירות את הקצה הרוזטרלי של C1, C2 ו- C3 עם מדפים מחוברים או מכופפים כדי לאפשר חיתוך מתחת לעצם להסרת שלוש החוליות. כאשר האורך הרצוי של חוט השדרה בודד מעמוד החוליות, בצע חתך רוחבי כדי להסיר את רקמת חוט השדרה.

לאחר הסרת דורה, מניחים את גזע המוח במרכז פלטפורמת הפרפין על בלוק חיתוך הפלסטיק ולהשתמש סיכות חרקים עדין, גזוז לא יותר מסנטימטר אחד אורך להצמיד את הקצה caudal של גזע המוח דרך חוט השדרה דיסטלי. לאחר מכן ליישר את בלוק חיתוך מכוסה פרפין עם גזע המוח מוצמד במחזיק בלוק ויטון, כך הלהב יהיה לחתוך בניצב לפנים rostral של גזע המוח. לאחר מכן, בצע פרוסה ראשונית כדי להסיר 200 עד 300 מיקרומטר של רקמה לא אחידה מחוץ לעצם על הקצה ביותר של הרקמה, ביצוע התאמות קטנות לפי הצורך כדי להבטיח ליניאריות PARP וחתכים קטנים כדי להסיר כל רקמה אחידה.

שורשי glossopharyngeal יהפכו גלויים בקצה השני של גזע המוח, לחתוך פרוסה 300 כדי 500 מיקרומטר של גזע המוח מן סמנים נוירואנטומיים rostral אלה כדי ללכוד את תסביך טרום Botzinger ואת מעגלי השידור הקשורים. כל שלבי הליך החותך הם קריטיים ליצירת פרוסה ניתנת לשחזור ובת קיימא, עם כל המעגלים העצביים הדרושים בכיוון הנכון כדי לייצר קצב חזק. כל האלמנטים המינימלי הדרושים במעגל העצבי ליצירת ומשדר קצב מעורר השראה ניתן ללכוד פרוסה דקה באמצעות שיטה זו.

כולל תסביך טרום בוצינגר, נוירונים טרום מוטוריים מקרינים לנוירונים המוטוריים ההיפוגלוסלים ושורש העצבים ההיפוגלוסל. תסביך טרום בוצינגר, שורשי עצב הגולגולת ההיפוגלוסל או ה -12 ושורשי העצבים C4 יכולים לשמש להקלטה השראה. ההיבט העיקרי של הליך זה הוא בידוד זהיר של השורשים ואישור כי גזע המוח אינו פגום לפני חיתוך הפרוסה הסופית.

בעקבות הליך זה, הקלטות electrophysiology יכול להתבצע באמצעות שיטות מהדק תיקון, הקלטות סלולריות נוספות או אלקטרודות יניקה כדי להקליט את הפעילות החשמלית המיוצרת על ידי הרשת. פרוטוקולים שפורסמו בעבר סיפקו פרט קטן צעד אחר צעד, מה שמקשה על חוקרים חדשים להשתמש בשיטה זו מבלי לנסוע למעבדה אחרת ולהבלות זמן עם חוקר מתובל.