Fluorogenic פפטיד Assay המחשוף, למסך לפעילות הפרוטאוליטי: יישומים עבור הקורונה ספייק הפעלת חלבון

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביוכימיה, כגון שינוי פרוטאוליטי של חלבונים, כמו גם אפיון של מעכבים ופרוטאזות ופפטידסים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הקרנה מהירה של הפעילות הפרוטופוליטית של פרוטאזות על פפטידים, המייצגת את צד המחשוף של החלבון הנתון. השימוש כאן הוא ללמוד פרוטאזות המפעילות היתוך ויראלי.

הצעד הראשון בעיצוב פפטיד הוא לרכוש את רצף חלבון ההיתוך המעניין ממאגר מידע ציבורי כגון NCBI או מסד הנתונים של פתוגן הנגיף. בחר את אתר זיהוי פרוטאז ממשיך פפטיד היתוך ולכלול שתיים עד שלוש חומצות אמינו במעלה הזרם במורד הזרם של רצף זה. בעת הזמנת פפטיד, לשנות אותו עם העברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטיות או זוג FRET, Mca בסוף שליחות ו DNP ב c terminus.

במהלך ההתרגשות, Mca מתרגשת ו פולטת אנרגיית אור כי הוא מרווה על ידי Dnp כל עוד הזוג נמצא בסביבה קרובה זה לזה. עם זאת, אם המחשוף מתרחש, Dnp לא יוכל להתרוות את הפליטה אשר לאחר מכן ניתן לקרוא על ידי קורא לוח הפלואורסצנטיות. תן את הפפטיד מחדש בהתאם להמלצות היצרנים על ידי צינורות בעדינות למעלה ולמטה.

לדוגמה, תן שימוש חוזר באתנול של 70% לריכוז סופי של מילימולר אחד. אם הפפטיד אינו מתכלה היטב על ידי צינור, מניחים את הצינור המכיל את הפפטיד והממס באמבט sonication עד שהוא resuspended באופן מלא. לוותר על 100 aliquots microliter של פפטיד לתוך שיכוך אור או צינורות עמידים כדי להגן על פפטיד מפני הלבנה.

אחסן את האליקוטים במינוס 20 מעלות צלזיוס. התחל הליך זה על-ידי הפעלת קורא הלוחות והמתנה עד לסיום הבדיקה העצמית. לאחר מכן, פתח את תוכנת ההפעלה במחשב המצורף וודא שהיא מחוברת לקורא הלוחות.

פתח את הגדרת הטמפרטורה והגדר אותה לטמפרטורה הנדרשת לביצועים אופטימליים עבור הפרוטאז, שהוא 30 מעלות צלזיוס, במקרה זה. כדי להגדיר את הניסוי, לחץ על הגדרת כלי בקרה, בחר קינטית ולאחר מכן בחר פלואורסצנטיות. הזן אורך גל של 330 ננומטר ואורך גל פליטה של 390 ננומטר.

בטל את הבחירה בחיתוך האוטומטי ובחר רגישות בינונית/רגילה. בחר זמן ריצה של שעה אחת לצורך ההתמדה ובחר מדידה אחת כל 60 שניות. קבעו חמש שניות של ערבוב לפני המדידה הראשונה, ושלוש שניות לפני כל מדידה.

לבסוף, בחר את בארות הקריאה. הכינו את מאגרי ההתזה המתאימים לפרוטאזות כמתואר בפרוטוקול הטקסט וצננים את המאגרים על הקרח. מניחים צלחת 96 באר שטוחה שחורה מוצקה שאינה מטופלת על קרח עם לוח מתכת דק מתחת לתמיכה בקירור ויציבות.

זה חיוני כדי להשתמש בצלחת שחורה כמו צלחת מים, כדי למנוע דליפה פלואורסצנטי מ בארות סמוכות. לכל פפטיד, הכינו שלושה שכפולים טכניים לכל בדיקה, ונפח כולל של 100 מיקרוליטרים לדגימה. פיפטה את הכמות המתאימה של מאגר ההתראה לתוך כל באר של צלחת ההתראה.

הוסף 0.5 מיקרוליטרים של פרוטאז לכל באר. לשש בארות, להוסיף 0.5 microliters של חיץ במקום פרוטאז בהתאמה. שלושה מהם יהיו בקרות עיוורות ושלושת האחרים יהיו בקרות פפטיד.

הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של הפפטיד לריכוז סופי של 50 מיקרומולרים לכל באר, למעט הפקדים העיוורים. לכל אחת משלוש בארות הבקרה העיוורת, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של חיץ במקום פפטיד. הכנס את הצלחת לקורא לוחות הקמח ולחץ על התחל.

לפני תחילת ניתוח הנתונים, שמור את קובץ הניסוי. לחץ על ייצוא, ולייצא את הקובץ כמו txt. יבא את קובץ ה- txt לגיליון אלקטרוני.

התחל את הניתוח על-ידי יצירת גרף, תוך התוויית יחידות הפלואורסצנט היחסיות בציר ה- y כנגד הזמן בציר ה- x עבור כל שכפול טכני לכל דגימה. בחר את טווח הנתונים שבו הגרף נמצא בטווח ליניארי, והקרוב ביותר לתחילת עליית הפלואורסצנטיות. התווה את הנתונים שנבחרו בגרף שני והוסף קו מגמה ליניארי.

באפשרויות קו המגמה, בחר משוואת תצוגה בתרשים. המשוואה תראה V max, המתאים לשיפוע של קו המגמה. חשב את ה- V max הממוצע עבור כל דגימה משלושת השכפולים הטכניים.

לאחר שחזר על הניסוי פעמיים נוספות, כדי להשיג שלושה שכפולים ביולוגיים, לחשב את סטיית התקן בהתבסס על הנתונים משלושת השכפולים הביולוגיים העצמאיים. בדיקת מחשוף פוריין של נגיף הקורונה MERS האנושי, אתר הפריים EMC/2012 S2, וזן המוטנטים הכפולים שמקורו בגמלים HKU205, יחד עם גרסאות מוטנטים בודדות של EMC/2012 חשפו כי הפפטיד EMC/2012 היה מחשוף ביעילות, בעוד שכמעט שום מחשוף של הפפטיד העיקרי S2 של HKU205 התרחש. המחשוף של EMC/2012 A-S מוטציה S2 פפטיד ראש צומצם מאוד, וכמעט לא היה מחשוף של EMC/ 2012 S כדי מוטציה S2 פפטיד ראש.

מחשוף פרווה נוסף הראה רק מחשוף מינימלי של אתר פריים מרוקו 213 S2 שמקורו בגמלים, בהשוואה לנגיף הקורונה MERS האנושי, EMC/2012 אתר פריים S2. מחשוף פורין נצפתה עבור פפטיד S1/S2 prototypical, FECV I ו 4 S1/S2, אבל לא פפטיד S1/S2 מוטציה, FIPV I שחור S1/S2. באופן דומה, פורין היה מסוגל לחשוף את פפטיד S2 הממשלה prototypical, FECV II 1683 S2 פריים, אבל לא מוטציה S2 פפטידים הממשלה, FECV I ו 4 S2 פריים, FIPV I שחור S2 פריים, ו FIPV II 1146 S2 הממשלה.

בעקבות הליך זה, ניתוח כתם מערבי או בדיקות אמינו-פלואורסצנטיות, באמצעות חלבון באורך מלא של עניין יכול להתבצע כדי לאמת מחשוף חלבון, או במקרה זה, אם המחשוף תוצאות גרסה fusogenic של חלבון היתוך ויראלי.