ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר במעבדה NC נתמך על ידי מענק הלאומי מכונים לבריאות (NIH) R01AI24499 מענק קרן בריאות ניו ג'רזי (NJHF), PC40-18.

הערה: פרוטוקול stepwise מפורט וזמינותו היא כמפורט להלן, פרוטוקול סכמטית מוצג באיור1.
1. ג אלביקנס זנים ותנאי גידול
<ol><li>גדלים זנים אלביקנס ג נוזלי בינוני תמצית-Peptone-Dextrose שמרים (YPD) ב- 30 °C ב שייקר אינקובטור בן לילה. הערה: לשמור על זנים של קנדידה מניות קפוא ולגדול על אגר YPD (תמצית שמרים 1%, peptone 2%, דקסטרוז 2% ו- 2% אגר).</li>
</ol>2. הכנת נוגדנים
<ol><li>הכן את המדיום assay כדלקמן:<ol>
<li>עבור הפונקציה מיטוכונדריאלי assay, לפזר אבקת 1640 המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) 1.04 g, 2 גרם גלוקוז (2%) 90 מ ל מים סטרילי, חמים התקשורת 37 מעלות צלזיוס. להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות 5 M NaOH ובצע את עוצמת הקול 100 מ ל מים סטריליים.</li>
		<li>עבור מתח glycolytic assay, להמיס 1.04 גרם אבקת RPMI 1640 לבד במים סטריליים 90 מ ל, לחמם את המדיה 37 ° C ולהתאים את ה-pH ל 7.4. לבצע את עוצמת הקול 100 מ ל מים סטריליים. אבקת RPMI 1640 יש אין ביקרבונט, אשר חיוני לעקוב אחר השינוי pH כאמצעי של גליקוליזה במהלך וזמינותו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הזרקת תרכובות.<ol>
<li>להכין 1 מ' מניות גלוקוז במים סטריליים, חנות ב-20 ° C.</li>
		<li>להכין 100 מ מ oligomycin מניות של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), aliquot בכמויות קטנות ולאחסן ב-20 ° C.</li>
		<li>להכין מניות A antimycin 100 מ מ של דימתיל סולפוקסיד, aliquot בכמויות קטנות ולאחסן ב-20 ° C.</li>
		<li>הכן 100 מ מ שאם המניה (חומצה salicylhydroxamic) אתנול ביום של וזמינותו.</li>
		<li>להכין 1 מ' KCN במים סטריליים ביום וזמינותו.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ציפוי של צלחת assay עם פולי-D-ליזין (PDL)
הערה: לבצע את כל להלן השלבים ברדס למינריות.
<ol><li>להמיס ליזין פולי-D במים כיתה תרביות רקמה כדי להפוך 50 הריכוז הסופי של µg/mL. לערבב את זה טוב, aliquot לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL ולאחסן ב-20 ° C לטווח ארוך. הערה: יש צורך µL 50 לכל טוב, עבור 24 וולס, מ ל 1.2 נדרש. לכן, aliquot לפחות 1.3 mL למחזור microcentrifuge.</li>
	<li>הוסף µL 50 לכל טוב, דגירה בטמפרטורת החדר עם המכסה מכוסה במשך 1-2 h.</li>
	<li>האחות הפתרון ולשטוף פעם אחת עם 500 µL תרביות רקמה סטרילי כיתה מים.</li>
	<li>פותחים את המכסה ולאפשר הבארות מהאוויר היבש. שימוש לצלחת באותו יום או חנות ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר 2-3 ימים.</li>
</ol>4. הידרציה של חיישן מחסנית
הערה: לבצע שלב זה יום אחד לפני הניסוי.
<ol><li>פתח את שטף נוספת Assay ערכת ולהסיר את התוכן. מקם את מחסנית חיישן הפוך ליד הלוחית השירות (איור 2).</li>
	<li>מלא כל טוב של צלחת השירות עם 1 מ ל calibrant, למקם את חיישן מחסנית בחזרה. ודא החיישנים המכילים fluorophores (כדי למדוד את חמצן ו- pH) הם שקועים את calibrant.</li>
	<li>דגירה את המחסנית חיישן בן לילה חממה-CO2 ב 37 º C.</li>
</ol>5. זריעת תאי הלוחות מצופים PDL וגדל
<ol><li>לחסן אלביקנס ג במרק YPD ולגדול בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס ב שייקר ב 200 סל ד. הערה: מבוסס על העיצוב assay, הריבית, אלביקנס ג ניתן גם לגדל YPG או בינונית מזערי.</li>
	<li>ביום של assay, לדלל את המספר המתאים של תאים המדיום assay להניב ריכוז סופי של 100,000 תאים לכל 100 µL.</li>
	<li>להוסיף 100 µL של התאים מדולל לבאר כל צלחת assay חוץ בארות A1, B4, C3 ו- D6, שבו הוסף רק 100 µL של המדיום assay לתיקון רקע (איור 3).</li>
	<li>להעביר את הצלחת חממה-CO2 ב 37 מעלות צלזיוס, תקופת דגירה של 60 דקות, אשר יאפשר את התאים לדבוק פני השטח צלחת.</li>
</ol>6. assay פרוטוקול
הערה: פרוטוקול שמפורטות כאן הוא עבור תבנית 24-טוב של המכשיר. אמצעי אחסון יהיה עליך לכוונן אם נעשה שימוש בתבנית אחרת.
<ol><li>וזמינותו של פונקציה מיטוכונדריאלי<ol>
<li>הכנת תרכובות<ol>
<li>הכנת תרכובות-ריכוז 10 x עבור הפונקציה מיטוכונדריאלי assay: להכין 20 מ מ. המזויפים, 100 מיקרומטר Oligomycin, 100 מ מ KCN, ו- 20 מיקרומטר Antimycin A במדיום assay המתאימים.</li>
			<li>להוסיף 50 µL דמה לתוך ה-port A, 55 µL Oligomycin ליציאת B, µL 62 KCN ליציאת C ו- A Antimycin µL 68 ליציאת D (איור 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>מתח glycolytic assay<ol>
<li>הכנת תרכובות<ol>
<li>הכנת תרכובות-ריכוז 10 x עבור מתח glycolytic assay. להכין 100 מ מ גלוקוז, 100 מיקרומטר Oligomycin, 500 מ מ 2-Deoxy גלוקוז (2 די. ג'י), 20 מיקרומטר Antimycin A במדיום assay המתאימים.</li>
			<li>להוסיף 50 µL גלוקוז לתוך ליציאה A, 55 µL Oligomycin ליציאת ב', 2 µL 62-DG ליציאת C ו- A Antimycin µL 68 ליציאת ד</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>מעסיקים מנתח השטף נוספת, אשר מודד את קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב חוץ-תאית acidification (ECAR) של תאים חיים בתבנית 24-ובכן צלחת. להגדיר את פרוטוקול assay מראש.</li>
	<li>פתח במנתח השטף נוספת, להגדיר את תבנית assay באמצעות הכרטיסיה אשף assay ובצע הדרכה צעד אחר צעד כדי למלא את כל המידע שעובר החוצה במהלך התקנת. ליצור את הפריסה קבוצה כמו דומה המוצג באיור5. להגדיר את הפרוטוקול כפי שמוצג בטבלה 1. להגדיר פריסות אלה מוביל לפני assay ולשמור במחשב. בזמנו של assay, לשחזר את פרוטוקול שנשמרו על-ידי פתיחת הקבצים המתאימים באפשרות ' פתח קובץ ' בכרטיסיה אשף assay (איור 5).</li>
	<li>לטעון 10 x תרכובות של היציאות המתאימות של מיכל הדיו חיישן רטוב המכיל את calibrant וטען במגש המוביל של מנתח השטף נוספת. התחל את הכיול על ידי לחיצה על לחצן התחל במסך.</li>
	<li>להוסיף 350 µL של המדיום assay בעדינות לצלחת תא לאורך צדי הבארות כדי למזער את ההפרעה תא כדי להביא את עוצמת הקול הסופי 450 µL.</li>
	<li>להחליף את הצלחת השירות המכיל את calibrant עם לוחית assay ולהמשיך.</li>
	<li>להסיר את מחסנית חיישן את הצלחת עם סיום וזמינותו. שמור את הקובץ הנמצא בתיקיית היעד המתאים.</li>
</ol>7. ניתוח נתונים
<ol><li>להשתמש באזור תחת עקומת - השונות (חאן אל-ANOVA) ניתוח לשונית בתוכנה כדי לחשב את ההבדל המשמעותי בין הקבוצות על-ידי בחירת הפרמטרים המתאימים (OCR או ECAR), כפי שמוצג באיור 6.</li>
	<li>בחר בקבוצות צריך להשוות.</li>
	<li>להוסיף קבוצות ניתוח עבור ANOVA ולחץ על אישור. הערה: ניתוח חאן אל ANOVA זה יוסיף גיליון חדש קובץ המכיל חאן אל היא מחושבת עבור כל קבוצה להשוות ביניהם על-ידי ANOVA. זה ייתן טבלה של ערכים p כדי להציג את המשמעות.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li>
<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals%3A+analysis+of+24%2C179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
<li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants%3A+an+international+consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li>
<li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infection+rates+in+US+children%27s+hospitals%27+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li>
<li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Value+in+Health%22%5BJournal%5D)">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li>
<li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+candidemia%3A+risk+factors+and+attributable+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li>
<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals%3A+epidemiology%2C+clinical+features+and+susceptibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li>
<li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+death+pathways+in+yeast+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).</li>
<li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+fungal+pathogenesis%3A+drug+tolerance%2C+virulence%2C+and+potential+for+antifungal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li>
<li>Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li>
<li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li>
<li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li>
<li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li>
<li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocytes+govern+the+transcriptional+response%2C+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li>
<li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li>
<li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li>
<li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li>
<li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+SRR1%2C+a+putative+two-component+response+regulator+gene%2C+is+required+for+stress+adaptation%2C+morphogenesis%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li>
<li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li>
<li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555(2017).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans%3A+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness%2C+cell+wall+integrity%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li>
<li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrandt%2C+ME+%22Candida+and+Candidiasis%22">Candida and Candidiasis</a>. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).</li>
<li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li>
<li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף

ביואנרגיה השטף נוספת assay משמש כלי מצוין כדי לקרוא את הפונקציה מיטוכונדריאלי על ידי מדידת זרחון חמצוני (OXPHOS)-צריכת חמצן התלויים בזמן אמת. בנוסף, פונקציה glycolytic, אשר נמדד כמו שיעור חוץ-תאית acidification (שינוי ב- pH חוץ-תאית) יכול ייחקרו גם במקביל בניתוח בזמן אמת.
ציפוי מוצלחת של אלביקנס ג בצלחת assay הוא אחד השלבים הקריטיים וזמינותו בגלל הדגירה של התאים לוחית PDL מצופה לאפשר את התאים לדבוק הצלחת וזמינותו. ויזואליזציה של הקפדה אלביקנס ג תאים מושגת על ידי מיקרוסקופ אור...

זיהומים פטרייתיים פולשנית להרוג מעל 1.5 מיליון אנשים בשנה ברחבי העולם. המספר הזה הוא בעלייה בשל עלייה במספר האנשים החיים עם חסינות פרוץ, לרבות תינוקות קשישים, מוקדמת, השתלת הנמענים, חולי סרטן1. ג אלביקנס הוא הזדמנותית פטריות פתוגניות זה חלק microflora האדם. הוא שוכן גם ומשטחים הרירית של מערכת העיכול כאורגניזם commensal. אלביקנס ג מייצרת מחלה מערכתית קשה אצל אנשים שיש להם ליקויים החיסונית, אשר עברו ניתוח, או מי שטופלו עם קורסים ארוכים של אנטיביוטיקה. הדרגה מינים קנדידה בין הגורמים המובילים שלושה או ארבעה nosocomial מחלות זיהומיות (ניד) ב בני אדם2,3,4,5,6,7. מספר זיהומים קנדידה למחזור הדם העולמי השנתי מוערך ~ 400,000 מקרים, עם בהירושימה המשויך של 46-75%1. התמותה השנתי עקב קנדידה הוא בערך 10,000 בארצות הברית לבדה. היקף ניד הנגרמת על ידי פטריות משתקפת גם הוצאות אסטרונומיות החולה5. בארצות הברית, על הטיפול של זיהומים פטרייתיים פולשנית הוצאות שנתי עולה 2 מיליארד דולר, הוספת זן ענק כבר עומס מערכת הבריאות. כיום, טיפולים נגד פטריות סטנדרטיים זמינים מוגבלות בשל רעילות, תרופתיים נפוץ יותר ויותר, סמים-תרופתיות. לכן, יש צורך דחוף לזיהוי מטרות תרופה נגד פטריות חדש זה יביא באפשרויות טיפול טוב יותר לחולים בסיכון גבוה. עם זאת, הגילוי של תכשירים חדשים על מטרות פטרייתי הוא מסובך כי פטריות פרוקריוטים. זה מאוד מגביל את מספר מטרות ספציפיות פטרייתי סמים.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המיטוכונדריה הם תורם קריטי לאלימות ולגרימת פטרייתי עמידות לתרופות נגד פטריות מאז המיטוכונדריה חשובים נשימה תאית, מטבוליזם חמצוני, אותות של אפופטוזיס8 ,9,10,11. מטבוליזם glycolytic והן הלא-glycolytic חיוניים להישרדותה של אלביקנס ג המארח בתרבית של12,13,14,15,16. יתר על כן, מספר מוטציות אלביקנס ג חסר חלבונים מיטוכונדריאלי, כגון Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 וכו ' הוכחו להיות פגום בתוך filamentation, גורם חשוב התקפה אלימה של אלביקנס ג17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. בנוסף, המוטנטים האלה הוצגו גם כדי להיות הקלוש של התקפה אלימה במודל של עכברים של המופץ קנדידה17,18,19,20,21 ,22. לפיכך, המיטוכונדריה פטרייתי מייצגים ליעד אטרקטיבי עבור גילוי תרופות. עם זאת, המחקר של פונקציית מיטוכונדריאלי אלביקנס ג הוא מאתגר כי אלביקנס ג פטיט שלילי23, מה שאומר כי זה לא יכול לשרוד בלי גנום מיטוכונדריאלי.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את פונקציית מיטוכונדריאלי, glycolytic אלביקנס ג ללא צורך לטהר את המיטוכונדריה. ניתן למטב בשיטה זו גם כדי לחקור את ההשפעה של מניפולציה גנטית או מאפננים כימי על מסלולים מיטוכונדריאלי ו glycolytic ב ג אלביקנס.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>MT50020PB</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mito ערכת מתח</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>אוליגומיצין</td><td>Calbiochem</td><td>495455</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>Accumet</td><td>AR20</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>סיגמא</td><td>P5530</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D ליזין</td><td>סיגמא</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>רוטנונה</td><td>סנטה קרוז</td><td>203242</td><td></td></tr><tr><td>סוסון ים XF24 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>SHAM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>אמרסקו&nbsp;</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסי כדורי</td><td>J.T Baker</td><td>3722</td><td></td></tr> מים <tr><td>בדרגת תרבית רקמות</td><td>Gibco</td><td>1523-0147</td><td></td></tr><tr><td>XF תמיסת קליברנט לבדיקת</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים פפטון דקסטרוז</td><td>פישר מדעי,</td> <td>BP2469</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים פפטון דקסטרוז אגר</td><td>סיגמא</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים פפטון גליצרול</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr></tbody></table>

ביו-energetics החקירה של קנדידה אלביקנס משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

המיטוכונדריה הם organelles חיוני כדי להפוך את חילוף החומרים הסלולר הישרדות. מגוון רחב של אירועי מפתח יתקיים המיטוכונדריה, כגון נשימה תאית, מטבוליזם חמצוני, אותות אפופטוזיס. כתוצאה מכך, תפקוד מיטוכונדריאלי הוא דיווח יש תפקיד חשוב סבילות נגד פטריות, התקפה אלימה של פטריות פתוגניים. נתונים עדכניים הובילו גם ההכרה על החשיבות של המיטוכונדריה כמו תורם חשוב בפתוגנזה פטרייתי. למרות החשיבות של המיטוכונדריה בביולוגיה פטרייתי, שיטות מתוקננים כדי להבין את הפונקציה שלה הן מפותחות. כאן, אנו מציגים את הליך ללמוד שיעור צריכת החמצן הבזליים (OCR), מידת הנשימה מיטוכונדריאלי, ו המחירים חוץ-תאית acidification (ECAR), מדד של פונקציית glycolytic אלביקנס ג זנים. השיטה המתוארת במסמך זה ניתן ליישם כל זני Candidaspp. ללא צורך לטהר את המיטוכונדריה מתאי פטרייתי ללא פגע. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם אישית עבור מעכבי של פונקציית מיטוכונדריאלי זנים אלביקנס ג מסך.

המוקד של פרוטוקול זה היא לקבוע את הפונקציות bioenergetic של ג אלביקנס מוערך על ידי מנתח השטף נוספת. מוטציה אלביקנס ג חסר חלבון מיטוכונדריאלי Mam33 נכלל גם יחד עם זן המשלים שלו, mam33Δ/Δ::MAM33 לחקור את ההשפעות של המחיקה של חלבון מיטוכונדריאלי OCR, ECAR. MAM33 מקודד על חלבון בשם מטריקס חומצי מיטוכונדריאלי, תפקידה ב קנדידה לא ידוע.
מספרי הטלפון הנייד עבור assay השטף נוספת</stron...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול stepwise לחקור את הנשימה מיטוכונדריאלי והתפקוד glycolytic ב קנדידה אלביקנס באמצעות עם מנתח נוסף השטף.

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

פרוטוקול זה משמעותי לקביעת התפקוד הגליקוליטי והנשימה המיטוכונדרית בקנדידה אלביקנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה של תפקוד המיטוכונדריאלי ללא צורך לטהר מיטוכונדריה מקנדידה אלביקנים. שיטה זו יכולה להיות אופטימיזציה כדי לחקור את ההשפעות של מניפולציה גנטית או אפנונים כימיים על מסלולים מיטוכונדריאליים גליקוליטיים קנדידה אלביקנים או פתוגנים פטרייתיים אחרים.טכניקה זו פשוטה יחסית. או בהתאם לאורגניזם, השימוש בהם עשוי לעזור לייעל את מספר התא ואת הריכוז של מעכבי המיטוכונדריה בהסטה שלהם. במכסה המנוע של זרימה למינארית, ממיסים פולי-D-ליסין במים רשת רקמות לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר.מערבבים היטב את הפתרון ו aliquot אותו לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר הקפדה aliquot לפחות 1.3 מיליליטר לצינור. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תערובת זו לכל באר של צלחת ההתסקרות, מכסים את המכסה ודורגים בטמפרטורת החדר במשך שעה עד שעתיים. אז שאף את הפתרון.לשטוף את בארות צלחת ההתזה פעם אחת עם 500 microliters של מים כיתה רקמות סטריליות, לפתוח את המכסה ולאפשר בארות אוויר יבש. אם לא משתמשים בצלחת ביום שבו היא מוכנה, מאחסנים אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך יומיים עד שלושה ימים לכל היותר. יום לפני הניסוי, לפתוח את ערכת בדיקה שטף נוסף ולהסיר את התוכן.מקם את מחסנית החיישן במהופך ליד לוחית השירות. מלא כל באר של צלחת השירות עם מיליליטר אחד של כיול ולאחר מכן למקם את מחסנית החיישן בחזרה. ודאו שהחיישנים המכילים פלואורופורים שקועים בכיול.דגירה מחסנית החיישן ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שאינו פחמן דו חמצני לילה. יום לפני ההתמדה, לחסן את אלביקנים C מוכן במרק YPD ולגדול לילה ב 30 מעלות צלזיוס בשייקר ב 200 סל"ד. ביום ההתמדה, לדלל מספר מתאים של תאים במדיום המבחן להניב ריכוז סופי של 100, 000 תאים לכל 100 microliters.הוסף 100 מיקרוליטרים של התאים המדוללים לכל באר של צלחת ההתבנות למעט בארות A1, B4, C3 ו- D6. ל בארות אלה, להוסיף רק 100 microliters של מדיום בדיקה לתיקון רקע. חגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שאינו פחמן דו חמצני במשך 60 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק על פני השטח של הצלחת. הכינו את התרכובות לתפקוד המיטוכונדריאלי בריכוז של פי 10 במדיום ההתמדה המתאים כמפורט בפרוטוקול הטקסט.הוסף 50 מיקרוליטרים של SHAM ליציאה A, 50 מיקרוליטרים של אוליגומיצין ליציאה B, 62 מיקרוליטרים של אשלגן ציאניד ליציאה C, ו-68 מיקרוליטרים של אנטימיצין A ליציאה D.Next, הכינו את התרכובות למבחן הלחץ הגליקוליטי בריכוז של פי 10 במדיום המבחן המתאים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. הוסף 50 מיקרוליטרים של גלוקוז ליציאה A, 55 מיקרוליטרים של אוליגומיצין ליציאה B, 62 מיקרוליטרים של 2-DG ליציאה C, ו-68 מיקרוליטרים של אנטימיצין A ליציאה D.Before ההתמדה, פתח את מנתח השטף הנוסף והגדר את תבנית ההתמדה באמצעות לשונית אשף ההתמדה. בצע את ההוראות שלב אחר שלב ומלא את כל המידע המוקפץ במהלך ההתקנה.צור פריסת קבוצה והגדר את הפרוטוקול כמפורט בפרוטוקול הטקסט. שמור פריסות אלה לפני ההתנגדות. בזמן ההתרקשה, שחזר את הפרוטוקול שנשמר על-ידי פתיחת הקובץ המתאים באפשרות הקובץ הפתוח בכרטיסיה אשף ההתנסויות.לאחר מכן לטעון את תרכובות 10X לתוך היציאות המתאימות של מחסנית חיישן hydrated המכיל את הכיול. טען את מחסנית החיישן למגש המוביל של מנתח השטף הנוסף. הפעל את הכיול על-ידי לחיצה על לחצן 'התחל' על המסך.לאחר מכן, מוסיפים בעדינות 350 מיקרוליטרים של מדיום המבחן לצלחת התא לאורך צד הקירות כדי למזער את ההפרעה לתאים ולהביא את הנפח הסופי ל-450 מיקרוליטרים. החלף את לוחית השירות המכילה את הכיול בצלחת ההתנסויות והמשך בהסטה. לאחר השלמת הבדיקה, הסר את מחסנית החיישן ואת הצלחת.שמור את הקובץ בתיקיית היעד המתאימה. במחקר זה, הפונקציות הביו-אנרגטיות של האלביקנים C מוערכים על ידי מנתח שטף נוסף. מוטציה חסרה חלבון מיטוכונדריאלי mam33 נכלל גם יחד עם הזן המשלים שלה כדי לחקור את ההשפעות של מחיקת חלבון מיטוכונדריאלי על קצב צריכת החמצן ואת שיעורי חומציות חוץ תאית.סוג הבר C albicans מראה שיעור צריכת חמצן של 145 picomoles לדקה אשר נמצא גם בטווח האופטימלי עבור כל מראי שטף חוץ תאי. קצב צריכת החמצן הבסיסי של סוג הבר, מוטציה mam33 ו mam33 זנים משלימים להראות שום הבדלים. באופן דומה, לא נראים הבדלים משמעותיים בשיעורי החומציות החוץ-תאית הבסיסית בין הזנים.עם זאת, על ידי עיכוב קומפלקס-IV עם אשלגן ציאניד, סוג הבר מוטציה mam33, mam33 זנים משלימים להראות שינוי משמעותי לכיוון גליקוליזה. עם זאת, זן המוטנטים mam33 לא הצליח להראות שינוי גליקוליטי מפצה המצביע על כך שהתרכובת-IV תלויה במסלול לקוי בזן זה. במבחן הלחץ הגליקוליטי, התאים מורעבים מגלוקוז למשך שעה אחת וקצב צריכת החמצן הבסיסי וקצב החומציות החוץ-תאית נמדדים.לאחר רעב, זן המוטנטים mam33 מראה צריכת חמצן נמוכה משמעותית ו שיעורי חומציות חוץ תאית בהשוואה זנים אחרים. זה מרמז על ניצול לקוי של גלוקוז הן לנשימה והן לגליקוליזה כאשר תאים נאלצים למצב רעב. לאחר הזרקת גלוקוז, כל הזנים מראים גירוי של קצב צריכת החמצן שלהם ואת שיעור חומציות חוץ תאית.ציפוי צלחת ההתזה מאפשר לתאי קנדידה אלביקנים לדבוק בצלחת. דבקות לא נכונה של תאי קנדידה אלביקנים תשפיע על תוצאת ההתקנה. לאחר התפתחות טכניקה זו, היא הועסקה במגוון רחב של סוגי תאים ומחלות המתייחסות לאופן שבו המיטוכונדריה מתפקדת בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.לדוגמה, העסקת תאים שמקורם במטופל ובקרה בהסטה זו, ניתן לענות על השאלות הספציפיות של אופן השינוי בתפקוד המיטוכונדריאלי. יש לדאוג בעת הכנת מעכבי המיטוכונדריה כגון אשלגן ציאניד ו antimycin A כי תרכובות אלה הם רעילים מאוד.

bio-energetics-investigation-candida-albicans-using-real-time

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקול זה מספק גישה ביוכימית למדידת קצב החמצה חוץ-תאי (ECAR) וקצב צריכת חמצן (OCR) של תאים לוקמיים ראשוניים עם בדיקת שטף חוץ-תאי. הערכת הפרופיל המטבולי של תאים אלה מסייעת לאפיין את דרישותיהם, מה שמוביל לטיפול מותאם אישית.

בדיקת שטף חוץ-תאי: שיטה למדידת פרופיל מטבולי של תאים

סרטון זה מדגים את השיטה לניתוח מטבוליזם אנרגיה בתאי NK אנושיים פעילים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי. מעכבים שונים של מכלולי שרשרת הובלת האלקטרונים משפיעים על סינתזת ATP, הנמדדת באמצעות קצב צריכת החמצן או OCR, ומספקים תובנות לגבי חילוף החומרים התאי והביו-אנרגטיקה.

ניטור בזמן אמת של מטבוליזם אנרגיה בתאי NK אנושיים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי

טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

השיטה המוצגת כאן מסכמת פרוטוקולים ממוטבים להערכת ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים שאינם דבקים ובתאי אב פרימיטיביים (HSPCs) תוך שימוש במנתח השטף החוץ-תאי כדי למדוד את קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) ואת קצב צריכת החמצן (OCR) של HSPCs בזמן אמת.

הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי

בדיקת שטף מטבולי של תאים בזמן אמת מודדת את קצב צריכת החמצן ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית, המתאים לייצור אדנוזין טריפוספט מיטוכונדריאלי וגליקוליטי, באמצעות חיישני pH וחמצן. כתב היד מסביר שיטה להבנת מצב האנרגיה של אוסטאובלסטים ואפיון ופרשנות של המצב הביו-אנרגטי התאי.

שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

פרוטוקולים אלה יסייעו למשתמשים לחקור את חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים שמקורם בתאי סרטן תלת-ממדיים באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי של סוסון ים.

חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי

אנו מתארים פרוטוקולים הדרגתיים המודדים את הנשימה המיטוכונדריאלית של נויטרופילים עכבריים ואנושיים ותאי HL60 באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי.

מדידה בזמן אמת של הפרופיל הביו-אנרגטי המיטוכונדריאלי של נויטרופילים

שימוש לרעה באלכוהול פוגע בחסינות המקרופאגים בנאדיות (AM) עקב דיכוי הנשימה המיטוכונדריאלית והביו-אנרגטיקה. לאחרונה הדגמנו כי חשיפה לאתנול (EtOH) מגבירה את התלות בגלוטמין לנשימה מיטוכונדריאלית ב-AMs. להלן שיטות לקביעת השימוש בגלוטמין לנשימה מיטוכונדריאלית ב-AMs שטופלו ב-EtOH באמצעות ביואנלייזר שטף חוץ-תאי.

הערכת גלוטמין כמקור דלק למקרופאגים בנאדיות שנחשפו לאתנול כרוני באמצעות ביואנלייזר שטף חוץ-תאי

כאן, אנו מתארים בפירוט שיטות לחילוץ מקרופאגים ממח העצם, הטחול והלב האוטם, ולאחר מכן הערכת שטף מטבולי בתאים חיים.

ניתוח שטף מטבולי ex vivo במקרופאגים של הטחול והלב, ומונוציטים של מח העצם

פרוטוקול זה משתמש במדווח ביולומינסנט המאפשר מדידות של פעילות השעתוק ב-Saccharomyces eubayanus כדי לנטר את המעבר מגלוקוז למלטוז, מה שמאפשר ניתוח בזמן אמת של התאמות מטבוליות ותומך באופטימיזציה של זנים לתסיסה תעשייתית בתנאים מגוונים.

ב Vivo ניטור פעילות שעתוק במהלך מעבר מטבולי באמצעות מדווח ביולומינסנט בשמרים

פרוטוקול זה מתאר דרך חסכונית לביצוע בדיקת מאמץ גליקוליזית לכימות תכנות מחדש מטבולי במיקרוגליה ראשונית של העכברים. לאחר בידוד וגירוי דלקתי, נמדד קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR) באמצעות מגיבים טריים ומותאמים ל-pH, ולאחר מכן נרמול חלבונים כדי לאפשר הערכה מדויקת וניתנת לשחזור של היסטים גליקוליטיים.

חקר גליקוליזה במיקרוגליה ראשונית באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאית

חקור את הביואנרגטיקה של Candida albicans באמצעות ניתוח זרימה חוץ-תאית בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת מדידת נשימת מיטוכונדריה ותפקוד גליקוליטי ללא צורך בניקוי מיטוכונדריה, ומסייעת בחקר מניפולציות גנטיות ומודולטורים כימיים בפתוגנים פטרייתיים.

ביו-energetics החקירה של קנדידה אלביקנס משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח

גלה סרטונים נוספים