ביו-energetics החקירה של קנדידה אלביקנס משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח

פרוטוקול זה משמעותי לקביעת התפקוד הגליקוליטי והנשימה המיטוכונדרית בקנדידה אלביקנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה של תפקוד המיטוכונדריאלי ללא צורך לטהר מיטוכונדריה מקנדידה אלביקנים. שיטה זו יכולה להיות אופטימיזציה כדי לחקור את ההשפעות של מניפולציה גנטית או אפנונים כימיים על מסלולים מיטוכונדריאליים גליקוליטיים קנדידה אלביקנים או פתוגנים פטרייתיים אחרים.

טכניקה זו פשוטה יחסית. או בהתאם לאורגניזם, השימוש בהם עשוי לעזור לייעל את מספר התא ואת הריכוז של מעכבי המיטוכונדריה בהסטה שלהם. במכסה המנוע של זרימה למינארית, ממיסים פולי-D-ליסין במים רשת רקמות לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר.

מערבבים היטב את הפתרון ו aliquot אותו לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר הקפדה aliquot לפחות 1.3 מיליליטר לצינור. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תערובת זו לכל באר של צלחת ההתסקרות, מכסים את המכסה ודורגים בטמפרטורת החדר במשך שעה עד שעתיים. אז שאף את הפתרון.

לשטוף את בארות צלחת ההתזה פעם אחת עם 500 microliters של מים כיתה רקמות סטריליות, לפתוח את המכסה ולאפשר בארות אוויר יבש. אם לא משתמשים בצלחת ביום שבו היא מוכנה, מאחסנים אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך יומיים עד שלושה ימים לכל היותר. יום לפני הניסוי, לפתוח את ערכת בדיקה שטף נוסף ולהסיר את התוכן.

מקם את מחסנית החיישן במהופך ליד לוחית השירות. מלא כל באר של צלחת השירות עם מיליליטר אחד של כיול ולאחר מכן למקם את מחסנית החיישן בחזרה. ודאו שהחיישנים המכילים פלואורופורים שקועים בכיול.

דגירה מחסנית החיישן ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שאינו פחמן דו חמצני לילה. יום לפני ההתמדה, לחסן את אלביקנים C מוכן במרק YPD ולגדול לילה ב 30 מעלות צלזיוס בשייקר ב 200 סל"ד. ביום ההתמדה, לדלל מספר מתאים של תאים במדיום המבחן להניב ריכוז סופי של 100, 000 תאים לכל 100 microliters.

הוסף 100 מיקרוליטרים של התאים המדוללים לכל באר של צלחת ההתבנות למעט בארות A1, B4, C3 ו- D6. ל בארות אלה, להוסיף רק 100 microliters של מדיום בדיקה לתיקון רקע. חגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שאינו פחמן דו חמצני במשך 60 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק על פני השטח של הצלחת. הכינו את התרכובות לתפקוד המיטוכונדריאלי בריכוז של פי 10 במדיום ההתמדה המתאים כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

הוסף 50 מיקרוליטרים של SHAM ליציאה A, 50 מיקרוליטרים של אוליגומיצין ליציאה B, 62 מיקרוליטרים של אשלגן ציאניד ליציאה C, ו-68 מיקרוליטרים של אנטימיצין A ליציאה D.Next, הכינו את התרכובות למבחן הלחץ הגליקוליטי בריכוז של פי 10 במדיום המבחן המתאים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. הוסף 50 מיקרוליטרים של גלוקוז ליציאה A, 55 מיקרוליטרים של אוליגומיצין ליציאה B, 62 מיקרוליטרים של 2-DG ליציאה C, ו-68 מיקרוליטרים של אנטימיצין A ליציאה D.Before ההתמדה, פתח את מנתח השטף הנוסף והגדר את תבנית ההתמדה באמצעות לשונית אשף ההתמדה. בצע את ההוראות שלב אחר שלב ומלא את כל המידע המוקפץ במהלך ההתקנה.

צור פריסת קבוצה והגדר את הפרוטוקול כמפורט בפרוטוקול הטקסט. שמור פריסות אלה לפני ההתנגדות. בזמן ההתרקשה, שחזר את הפרוטוקול שנשמר על-ידי פתיחת הקובץ המתאים באפשרות הקובץ הפתוח בכרטיסיה אשף ההתנסויות.

לאחר מכן לטעון את תרכובות 10X לתוך היציאות המתאימות של מחסנית חיישן hydrated המכיל את הכיול. טען את מחסנית החיישן למגש המוביל של מנתח השטף הנוסף. הפעל את הכיול על-ידי לחיצה על לחצן 'התחל' על המסך.

לאחר מכן, מוסיפים בעדינות 350 מיקרוליטרים של מדיום המבחן לצלחת התא לאורך צד הקירות כדי למזער את ההפרעה לתאים ולהביא את הנפח הסופי ל-450 מיקרוליטרים. החלף את לוחית השירות המכילה את הכיול בצלחת ההתנסויות והמשך בהסטה. לאחר השלמת הבדיקה, הסר את מחסנית החיישן ואת הצלחת.

שמור את הקובץ בתיקיית היעד המתאימה. במחקר זה, הפונקציות הביו-אנרגטיות של האלביקנים C מוערכים על ידי מנתח שטף נוסף. מוטציה חסרה חלבון מיטוכונדריאלי mam33 נכלל גם יחד עם הזן המשלים שלה כדי לחקור את ההשפעות של מחיקת חלבון מיטוכונדריאלי על קצב צריכת החמצן ואת שיעורי חומציות חוץ תאית.

סוג הבר C albicans מראה שיעור צריכת חמצן של 145 picomoles לדקה אשר נמצא גם בטווח האופטימלי עבור כל מראי שטף חוץ תאי. קצב צריכת החמצן הבסיסי של סוג הבר, מוטציה mam33 ו mam33 זנים משלימים להראות שום הבדלים. באופן דומה, לא נראים הבדלים משמעותיים בשיעורי החומציות החוץ-תאית הבסיסית בין הזנים.

עם זאת, על ידי עיכוב קומפלקס-IV עם אשלגן ציאניד, סוג הבר מוטציה mam33, mam33 זנים משלימים להראות שינוי משמעותי לכיוון גליקוליזה. עם זאת, זן המוטנטים mam33 לא הצליח להראות שינוי גליקוליטי מפצה המצביע על כך שהתרכובת-IV תלויה במסלול לקוי בזן זה. במבחן הלחץ הגליקוליטי, התאים מורעבים מגלוקוז למשך שעה אחת וקצב צריכת החמצן הבסיסי וקצב החומציות החוץ-תאית נמדדים.

לאחר רעב, זן המוטנטים mam33 מראה צריכת חמצן נמוכה משמעותית ו שיעורי חומציות חוץ תאית בהשוואה זנים אחרים. זה מרמז על ניצול לקוי של גלוקוז הן לנשימה והן לגליקוליזה כאשר תאים נאלצים למצב רעב. לאחר הזרקת גלוקוז, כל הזנים מראים גירוי של קצב צריכת החמצן שלהם ואת שיעור חומציות חוץ תאית.

ציפוי צלחת ההתזה מאפשר לתאי קנדידה אלביקנים לדבוק בצלחת. דבקות לא נכונה של תאי קנדידה אלביקנים תשפיע על תוצאת ההתקנה. לאחר התפתחות טכניקה זו, היא הועסקה במגוון רחב של סוגי תאים ומחלות המתייחסות לאופן שבו המיטוכונדריה מתפקדת בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

לדוגמה, העסקת תאים שמקורם במטופל ובקרה בהסטה זו, ניתן לענות על השאלות הספציפיות של אופן השינוי בתפקוד המיטוכונדריאלי. יש לדאוג בעת הכנת מעכבי המיטוכונדריה כגון אשלגן ציאניד ו antimycin A כי תרכובות אלה הם רעילים מאוד.