Polyomavirus מרקל זיהום וזיהוי

הצגנו את מודל תרבות התאים הראשון לזיהום פוליווירוס תא מרקל. הפרוטוקול כולל בידוד של פיברובלסטים עוריים, הכנת זיהום בנגיף MCPyV, כתמים immunofluorescent, ואת הפלואורסצנט בהכלאה situ. פרוטוקול זה מאפשר לחקור את מחזור הזיהום MCPyV ואינטראקציות עם תאים מארחים תוך הימנעות חפצים הקשורים ביטוי יתר של גנים ויראליים.

כדי להתחיל, להשתמש בזוג מספריים כדי לקצץ את השומן ואת הרקמה התת עורית את העורלה יילודים אנושי. חותכים את דגימת העור ב חצאים או רבעים. מניחים את הרקמה ב 5 מיליליטר של 10 מיליגרם למיליליטר dis-based II NPBS, בתוספת אנטיביוטי אנטימיקוטי.

דגירה ב 4 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, השתמש מלקחיים microdissection להפריד בזהירות את האפידרמיס מן השכבות עורי בצלחת 10 ס"מ. העבר את הרקמה העורית וכתוצאה מכך צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של 2 מיליגרם לכל קולגנס מיליליטר סוג IV במדיום ללא FBS בתוספת אנטיביוטי-anitmycotic.

הדגירה את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני עם רעידות תקופתיות במשך ארבע עד שש שעות, עד רק כמה אגרגטים רקמה מקרוסקופית להישאר. לאחר מכן, השתמש פיפיטה 10 מיליליטר כדי pipette פתרון המדגם למעלה ולמטה במרץ 10 פעמים, שחרור תאים בודדים מן הדרמיס. צנטריפוגה ב 180 גרם במשך חמש דקות ולהשליך את העל טבעי.

לוח את התאים המנותקים במדיום DMEM נוסף. בשעות אחר הצהריים המאוחרות או הערב, זרע 6 מיליון תאים 293TT28 לתוך צלחת 10 ס"מ המכיל מדיום DMEM בתוספת. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

למחרת בבוקר, ודא כי התאים הם כ 50%confluent, ולאחר מכן לצלף את התאים עם 66 microliters של ריאגנט transfection, 12 מיקרוגרם של MCPyV מחדש קשירה לבודד R17B DNA, 8.4 מיקרוגרם של PMtB פלסמיד ביטוי ST, ו 9.6 מיקרוגרם של ביטוי LT פלסמיד pADL. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת, כאשר התאים המבוצדים כמעט מתבלבלים, נסה את התאים והעבר אותם לצלחת של 15 ס"מ להמשך התרחבות.

כאשר המנה הופכת כמעט confluent, להעביר את התאים לשלוש מנות חדשות 15 ס"מ. כאשר כלים חדשים אלה הופכים כמעט confluent, לקצור את התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צנטריפוגה ב 180 גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.

לאחר מכן הסר את העל-טבעי והוסף נפח תא אחד של מגנזיום DPBS. הוסף 25 אמוניום גופרתי מיקרומולארי, ואחריו 0.5% טריטון X-100, 0.1%benzonase, ו 0.1% של DNAse תלוי ATP. מערבבים היטב ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה.

למחרת, לקרר את התערובת על קרח במשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף 0.17 נפח של נתרן כלורי. מערבבים ו דגירה על קרח עוד 15 דקות.

צנטריפוגה ב 12,000 גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אם העל-טבעי אינו ברור, הפוך בעדינות את הצינור וחזור על הצנטריפוגה. לאחר מכן, העבר את העל-טבעי לצינור חדש.

תן את גלולה ב 1 נפח של DPBS בתוספת 0.8 שומות של נתרן כלורי. צנטריפוגה ב 12,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אם העל-טבעי אינו ברור, הפוך בעדינות את הצינור וחזור על הצנטריפוגה.

מערבבים שוב את שני העל-טבעיים והצנטריפוגות ב-12,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה להפקיד שיפוע של יודיקסנול לתוך צינורות פוליאלומר דקים קירות חמישה מיליליטר כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. טען 3 מיליליטר של על-טבעי המכיל וירוסים מובהר על גבי שיפוע יודיקסנול מוכן.

צנטריפוגה עם רוטור SW 55 Ti ב 234 אלף גרם וב 16 מעלות צלזיוס במשך 3.5 שעות, הקפדה להגדיר את התאוצה וההאטה להאט. לאחר השלמת האולטרה-צנטריפוגה, אספו 12 שברים בצינורות מסיליקון. לאחר שמירה וניתוק התאים, ב 10 מיליליטר של DMEM בתוספת ו- F12 בינוני לצלחת.

העבר את פתרון התא לצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 180 גרם במשך שתי דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים באמצעי DMEM ו- F12 בתוספת בצפיפות תאים שבין 20,000 ל- 40 אלף תאים למיליליטר.

לאחר מכן, זרע 200 או 400 microliters של ההשעיה התא בתוספת 1 מיליגרם למיליליטר של קולגן מסוג IV לתוך כל באר של צלחת 24 או 96 היטב, בהתאמה. מוציאים את מניית MCPyV viron מהמקפיא של מינוס 80 מעלות וממקמים על הקרח כדי להפשיר. הוסף 1 מיליארד שווה ערך גנום ויראלי של virions MCPyV לכל מיקרוליטר אחד של יודיקסנול עבור כל 2500 כדי 5000 תאים להיות נגועים.

הקש על הצד של הצלחת בעדינות, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. ראשית, לתקן את התאים על תלושי כיסוי עם 4% PFA ב PBS במשך 10 דקות, לאחר מכן לשטוף את הכיסוי מחליק פעמיים עם PBS ולטפל בהם עם 70% אתנול בארבע מעלות צלזיוס לילה כדי לחלחל לתאים. למחרת, להחליף את האתנול עם חיץ הידרציה בדיקה דגירה בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות כדי מראש הכלאה הדגימות.

30 דקות לפני סוף הדגירה טרום ההכלאה, לדלל את הבדיקות בתת פתרון הכלאה בדיקה ב 1:500 דילול דגירה ב 45 מעלות צלזיוס. כאשר הדגירה הושלמה, פיפטה כ 10 מיקרוליטרים של תערובת בדיקה מדוללת על שקופית מיקרוסקופ עבור כל להחליק כיסוי. מניחים כל צד תא להחליק כיסוי למטה על טיפה בהתאמה של תערובת הכלאה.

באמצעות כמות ליברלית של מלט גומי, לאטום את הקצוות ואת הגב של כל כיסוי להחליק לשקופית שלה. הגדר את השקופית בצד השטוח של בלוק חום וחום אותם ל 94 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לאחר מכן, מעבירים את המגלשה לתא לח ודגירה אותם ב 45 מעלות צלזיוס לילה.

למחרת, השתמש במקלפים כדי לקלף בזהירות את מלט הגומי. מניחים את הכיסוי מחליק את צד התא לתוך הבאר של צלחת 24 היטב ולשטוף אותם עם חיץ לשטוף בדיקה שלוש פעמים בטמפרטורת החדר. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חיץ הגברה לכל באר המכילה תלוש כיסוי ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות.

בינתיים, anneal כל אחד משני סיכות ראש oligonucleotide שכותרתו זיהוי הבדיקות בצינורות PCR נפרדים על ידי חימום אותם 94 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות, ולאחר מכן קירור אותם לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מערבבים את סיכות הראש יחד במאגר הגברה בדילול של 1:50. לאחר מכן, למתוח סרט פרפין על הפנים הפתוחות של מכסה צלחת 12 היטב כדי להפוך משטח לתגובת הגברה.

פיפטה 50-100 טיפות מיקרוליטר של תערובת סיכות ראש על סרט הפרפין עבור כל תלוש כיסוי. בעזרת מדפים, הסירו בזהירות כל החלקת כיסוי מתספורת ההגברה מראש וגעו בקצה לנגב חד פעמי נקבובי לייבוש. מניחים כל צד תא להחליק כיסוי מיובש למטה על טיפת הגברה.

מעבירים את מכסה הצלחת לתא לח ודגירה לילה בטמפרטורת החדר ובחושך. למחרת, להחזיר את החלקות הכיסוי ל הבאר של צלחת 24 היטב. הוסף 5X SSCT המכיל DAPI בריכוז של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר לכל באר ודגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.

לאחר מכן, לשטוף את הדגימות פעמיים עם SSCT 5X בטמפרטורת החדר. הר את הכיסוי השטוף מחליק על שקופיות מיקרוסקופ, ולהשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לנתח את התאים ולדמיין את הדגימות. במחקר זה, אוכלוסייה כמעט הומוגנית של פיברובלסטים עוריים אנושיים מבודדת.

כתמים Immunofluorescent מגלה כי כמעט 100% של תאים עוריים אנושיים מבודדים מוכתמים באופן חיובי עבור סמנים פיברובלסט עורי, vimentin, קולגן, אבל שלילי עבור סמן קרטינוציטים העורלה האנושי K14. MCPyV virions נוצרים לאחר מכן ולאחר הדמיה של הלהקה של virions MCPyV מרוכז בליבת ההדרגה, 500 שברי מיקרוליטר נאספים MCPyV qPCR מבוצעת כדי לזהות את שברי השיא. תמונות מוכתמות Immunofluorescent של HDFs נגוע MCPyV מוצגים כאן, שבו תאים כי הם LT חיובי, VP1 חיובי, או גם LT ו VP1 חיובי נחשבים חיוביים עבור זיהום MCPyV.

מעל 30% מהתאים הם LT חיוביים, ויותר מ- 10%הם VP1 חיוביים. הגנומים MCPyV משוכפלים בתאים הנגועים מזוהים באמצעות דגים HCR-DNA ודגים Immunofluorescent-HCR-DNA. בעוד הדג HCR-DNA חושף את לוקליזציה של דנ"א MCPyV נוכח במפעל השכפול, שיטות Immunofluorescent-HCR-DNA FISH מאפשרות זיהוי בו זמני של דנ"א MCPyV ו- LT חלבון התאמה אישית במרכזי השכפול.

כדי להשיג את היעילות הטובה ביותר של זיהום וירוס, חשוב מאוד כי MCPyV מרוכז לפחות 2 x 10 כדי 8 הגנום וירוס למיקרוליטר מאז יודוקסנול רעיל לתאים. בעקבות זיהום MCPyV של fibroblasts עורי, ניתוחים ביולוגיים מולקולריים רבים יכולים להתבצע, כולל immunofluorescence, חסימת מערכת חיסונית, immunopositivication, ו qPCR מבוססי בדיקה. מערכת הזיהום שתיארנו מאפשרת לחוקרים לחקור שלבים של זיהום MCPyV כמו סחר גרעיני ואריזה ויראלית.

MCPyV הוא וירוס BSL-2, אבל מעט ידוע על הפוטנציאל שלה פתולוגיה בכמויות שהושגו בסביבה מעבדה. לכן, החוקרים צריכים לנקוט אמצעי זהירות כדי למנוע חשיפה לנגיף.