Name: פרוטוקול אל חלד באיכות גבוהה בידוד RNA של לייזר לכידת תאי Microdissected Purkinje המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למדו פרוטוקול לכידת תאים בלייזר לבידוד תאי פורקינייה ממוח אנושי פוסט-מורטם. השיטה ללא צביעה שומרת על שלמות ה-RNA לסיקור גנומי איכותי במחקר נוירוביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להכיר בנק בניו-יורק המוח, ד ר ז'אן פול Vonsattel, ד ר אטי קורטס, לסיוע שלהם ב חיתוך ושימור דגימות רקמה את המוח האנושי קפוא לניסויים אלה. המחברים רוצה להכיר את האנשים אשר תרם בנדיבות את המוח שלהם למחקר המשך לתוך רעד חיוני. ד ר פאוסט, ד ר Martuscello רוצה להכיר מחלקת פתולוגיה של אוניברסיטת קולומביה, ביולוגיה של התא על תמיכתם המתמשכת הליבה מחקר שטח. המחברים רוצה להכיר NIH R01 NS088257 לואי/פאוסט...) למימון מחקר עבור פרוייקט זה. תמונות LCM בוצעו ב Confocal ולהעניק התמחה מיקרוסקופ לשתף משאבים של הרברט אירווינג מקיף במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת קולומביה, נתמך על ידי NIH #P30 CA013696 (המכון הלאומי לסרטן). המחברים רוצה להכיר תרזה Swayne, לורה מונטאנו לסיוע המשך שלהם עם מיקרוסקופ מיוחד.

<ol><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+for+the+investigative+pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection for the investigative pathologist.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).</li>
<li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+Big+data+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li>
<li>Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).</li>
<li>Bevilacqua, C., Ducos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection%3A+A+powerful+tool+for+genomics+at+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level.</a> Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).</li>
<li>Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+post-mortem+and+physical+degradation+on+RNA+integrity+and+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+staining+methods+preparatory+to+laser+capture+microdissection+significantly+affect+the+integrity+of+the+cellular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA.</a> BMC Genomics. 7, 97(2006).</li>
<li>Mahalingam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahalingam%2C+M+%22Laser+Capture+Microdissection%3A+Methods+and+Protocols%22">Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols</a>. Murray, G. I. , Springer. (2018).</li>
<li>Vandewoestyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+should+an+ultraviolet+or+infrared+laser+be+used%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used.</a> Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).</li>
<li>Graeme, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGraeme%2C+MI+%22Laser+Capture+Microdissection.+Third+edn%22">Laser Capture Microdissection. Third edn</a>. , Humana Press. (2018).</li>
<li>Louis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-thinking+the+biology+of+essential+tremor%3A+From+models+to+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+%26+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology.</a> Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).</li>
<li>Choe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+loss+in+essential+tremor%3A+Random+sampling+quantification+and+nearest+neighbor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis.</a> Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).</li>
<li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+changes+in+essential+tremor%3A+33+cases+compared+with+21+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls.</a> Brain. , Pt 12 3297-3307 (2007).</li>
<li>Louis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathologic+findings+in+essential+tremor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuropathologic findings in essential tremor.</a> Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).</li>
<li>Jensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection.</a> The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).</li>
<li>Waller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+enriched+glial+populations+from+post-mortem+human+CNS+material+by+immuno-laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection.</a> Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection+and+transcriptional+profiling+of+the+dorsomedial+nucleus+of+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).</li>
<li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li>
<li>Sonne, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+staining+protocols+for+laser+microdissection+of+specific+cell+types+from+the+testis+including+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ.</a> PLoS One. 4 (5), 5536(2009).</li>
<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li>
<li>Schuierer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+protocols+for+degraded+and+low-quantity+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples.</a> BMC Genomics. 18 (1), 442(2017).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+changes+in+gene+expression+in+human+brain+and+isolated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).</li>
<li>Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+%5Bcorrected%5D+interval%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PLoS One. 8 (2), 56507(2013).</li>
<li>Walker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RNA+isolated+from+eighteen+different+human+tissues%3A+results+from+a+rapid+human+autopsy+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program.</a> Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).</li>
<li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li>
<li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 6, 25533(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Carl+Zeiss+Microscopy%22">Carl Zeiss Microscopy</a>. , Carl Zeiss. Germany. (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול המובאת כאן במיוחד משתנים להיות בגישה אל חלד ב להמחיש רקמות מורפולוגית נפרדות עבור UV-LCM שיטה זו נועדה להגדיל RNA שלמות עוקבות רצפי RNA ישיר, תוך שמירה על רמת משופרת של רקמות ויזואליזציה. היכולת להבחין בין סוגי תאים שונים עבור לכידה, כדי ליצור את האוכלוסייה הטהור של תאים אפשרי, חיוני להבנת פרופילים שונים מולקולריים ברקמות אנושיות15. בתוך ההקשר של פרוטוקול זה, רקמת הבחירה הוא בעל חשיבות עליונה, כמו השימוש של אנטיגן או לצבוע ריאגנטים ספציפיים שאינם מנוצלים, ולכן אינה מתאימה ללימודי הדורשים ...

לייזר לכידת microdissection (LCM) הוא כלי רב ערך מחקר המאפשרת הפרדת תאים באופן פתולוגי רלוונטי להערכת מולקולרי מונע עוקבות. השימוש של ניתוחים מולקולריים אלו דגימות רקמה הטרוגנית, המתאם עם נתונים פתולוגית וקלינית הוא צעד שנדרש לצורך הערכת המשמעות translational של המחקר הביולוגי1. בעת ניתוח נתוני ביטוי גנים RNA, השימוש של מקטעי רקמת קפוא מומלץ מאוד שכן היא מאפשרת עבור איכות מעולה של RNA וכן מוגדל כמות2. זה הוכח גם כי באיכות גבוהה והן את כמות ה-RNA הם חיוניים עבור נתונים משמעותיים בין רצפי הרנ א3. עם זאת, בעת שימוש RNA מרקמות טריים קפואים פוסט-מורטם עבור הפונקציה LCM, השפלה RNA הוא אתגר גדול, כמו זה מתרחש מיד עם מותו את מימדיו מתווך על ידי גורמים שונים הקשורים עם רקמת אוסף שיטה4,5 . יתר על כן, ה-RNA השפלה היא מתעצמת כאשר טכניקות צביעת נדרשים לזהות פרטים היסטולוגית וזיהוי התא. התמחה מכתים טכניקות, hematoxylin & אאוזין, הכתם Nissl, immunofluorescence ו אימונוהיסטוכימיה מועילים ב המבדילים תאים של משתית שמסביב אבל הוכחו לבזות RNA ולשנות התעתיק ביטוי פרופילים6. לכן, המעבדה שלנו יצרה פרוטוקול נירוסטה שתוכננה במיוחד כדי לשמר RNA המח האנושי פוסט-מורטם למטרות של רצפי RNA לאחר LCM בידוד של נוירונים Purkinje.
עיבוד רקמה קפוא טרי עבור הפונקציה LCM, שיטת קיבוע יכול להשפיע variably RNA וגם רקמות תקינות. קיבוע פורמלין הוא תקן לשימור מורפולוגי, אך גורם cross-linking זה ייתכן קטע RNA ומשבשים RNA הגברה7. קיבוע אתנול הוא חלופה טובה יותר לבידוד RNA, כפי שהוא מקבע coagulative זה לא לגרום cross-linking1. כדי לשפר את החזיית מורפולוגיה רקמות, קסילן היא הבחירה הטובה ביותר, כאשר הוא מסיר שומנים מן הרקמה. עם זאת, שם מוכרים מגבלות כאשר ניצול קסילן ב LCM, כמו הרקמות יכול להתייבש ולהיות שביר-גרימת רקמות פיצול על לייזר לכידת7. קסילן גם רעלן נדיפים, חייבים להיות מטופלים כראוי בשכונה fume. למרות זאת, קסילן הוכח כדי לשפר את רקמת ויזואליזציה תוך גם שמירה על תקינות רנ א8. לכן, פרוטוקול שלנו סובבת, השימוש של 70% אתנול קיבוע והתייבשות אתנול, ואחריו קסילן הדגירה עבור בהירות מורפולוגי.
חשוב לציין סוגים שונים של מערכות microdissection מבוססת לייזר, כפי הם הוכחו נבדלים מהירות, דיוק ואיכות RNA. הלייזר האינפרא-אדום (IR) ללכוד microdissection ומערכות אולטרה סגול (UV) לייזר microbeam microdissection היו שתי פלטפורמות LCM הרומן שצצו כמעט במקביל8. מערכת אינפרא-אדום-LCM מעסיקה "מערכת קשר" באמצעות סרט גומי סינתטי אשר בהתקשותו שקוף וממוקם על סעיף רקמות, תאים עניין באופן סלקטיבי לדבוק הסרט על-ידי פולסים ממוקד של לייזר אינפרא-אדום. לחלופין, מערכת UV-LCM היא "מערכת ללא מגע" לפיה קרן לייזר ממוקדת חותך את התאים או אזורים של עניין בתוך הרקמה; בהתאם לתצורת ב שתי פלטפורמות מסחריות זמין כעת המשתמשות או עיצוב מיקרוסקופ הפוכה או זקוף, רקמות נרכש מכשיר אוסף ע י גל הלחץ לייזר המושרה זה משפד אותו נגד כוח המשיכה או רקמה אסף על-ידי כוח הכבידה, בהתאמה. יתרונות משמעותיים של מערכת UV-LCM כוללים רכישת תא מהר יותר, ללא זיהום אוסף עם גישה ללא מגע, ניתוח מדויק יותר בשל הרבה יותר קטן לייזר קרן בקוטר9. פרוטוקול זה תוכנן במיוחד עבור מערכת UV-LCM, לא נבדק בכל מערכת אינפרא-אדום-LCM. גם עיצוב מערכת UV-LCM, כאשר תאים צבירת לתוך הכיפה איסוף, שימוש coverslip זה משפר את בהירות הסלולר במהלך מיקרוסקופ אינו מתאים, כמו התאים לא יוכל להיכנס לתוך הכיפה אוסף. לכן, כדי לשפר את רקמת ויזואליזציה, בדקנו את השימוש של אוסף אטום caps, אשר נועדו לשמש coverslip להמחשת מיקרוסקופיים מערכות UV-LCM, נגד נוזלי אוסף מלא בקבוקים. אוסף מילוי נוזלי כמוסות עשויה להיות מאתגרת, הנוזל כפוף אידוי, יש להחליפם בתדירות גבוהה תוך כדי עבודה על המיקרוסקופ. הזמן הופך להיות גורם חשוב ליציבות RNA, כפי הרקמה שנתפסו לבישום7.
המעבדה שלנו מחקרים השינויים neuropathologic לאחר המוות הקטן בחולים עם רעד חיוני (ET) והפרעות הקשורות ניווניות של הצרבלום. הראו שינויים מורפולוגיות שבמרכזה תאי Purkinje להבחין בין המקרים ET לעומת פקדים, כולל מספר מופחת של תאי Purkinje, גדל רגרסיה דנדריטים וכן מגוון של שינויים עצב, מוביל אותנו בקביעתו Purkinje הזה ניוון תאים היא תכונה וחיסונים הליבה ET פתוגנזה10,11,12,13. פרופיל תעתיק שימש למחלות רבות נוירולוגיים לחקור את הבסיס המולקולרי שבבסיס של שינויים ניווניים הסלולר. עם זאת, פרופילים תעתיק מדגימות הטרוגנית, כגון אזורים רקמת המוח, ניתן לאשש להסוות את הביטוי של הפרוטוקולים שפע נמוכה ו/או לצמצם את הגילוי של השינויים המולקולריים המתרחשים רק אוכלוסיה קטנה של המושפע תאים, כגון תאי Purkinje בקליפת אסטרוציטומה. למשל, תאי Purkinje במידה רבה יותר על ידי תאים גרגר שופע בקליפת אסטרוציטומה מאת; 1:. כ 3000 לפיכך, למקד בצורה יעילה transcriptome שלהם דורשת בידוד ספציפי של נוירונים אלה. קליפת אסטרוציטומה תחום שכבות נפרדות נבדלים צפיפות התאים, גודל התא. ארכיטקטורה זו הסלולר הוא אידיאלי כדי לדמיין דגימת רקמה קפוא טרי ללא ריאגנטים מכתימים המכילים צבען. בתיאוריה, פרוטוקול זה יכול גם להיות מיושם סוגים אחרים, רקמות כי יש רקמת הייחודי דומה בארגון.
פרוטוקול זה תוכנן לעבוד במיוחד עבור תאי Purkinje הדמיית המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן. פרוטוקולים רבים קיימות עבור הקיבעון, צביעת ויזואליזציה ושימור RNA סוגים רבים של רקמות למטרות של שני IR - ו UV-LCM. כשהוא מהרהר בעל עיצוב ניסיוני עבור UV-LCM, אנשים צריך להתאים נהלים שתתאים בצורה הטובה ביותר את הצרכים ואת הדרישות של להתחלה וסיום חומרים. כאן, אנו משלבים היבטים רבים של פרוטוקולים שונים LCM כדי לספק שיטה משופרת להמחשת תאי Purkinje ושההתפתחות האנושי פוסט-מורטם ללא צורך לצבוע המכיל נוגדנים מכתימים להתכונן RNA באיכות גבוהה transcriptome . רצף.

<table><tbody><tr><td>MembraneSlide NF 1.0 PEN</td><td>Zeiss</td><td>415190-9081-000</td><td>שקופיות ממברנה לרקמות. אנו לא ממליצים להשתמש במגלשות זכוכית.</td></tr><tr><td>AdhesiveCap 500 Opaque</td><td>Zeiss</td><td>415190-9201-000</td><td>כובעים אטומים משמשים לשיפור ההדמיה בהיקפים הפוכים רק</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td>מוצרי טיהור RNase אחרים מתאימים גם הם. השתמשו לניקוי כל המשטחים לפני העבודה.&nbsp;</td></tr><tr><td>200 הוכחה אתנול</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>אם משתמשים באתנול חלופי, יש להבטיח איכות גבוהה. חיוני לקיבוע רקמות.&nbsp;</td></tr><tr><td>קסילנים (מאושר על-ידי ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td>אם אתם משתמשים בקסילן חלופי, יש להבטיח איכות גבוהה. חיוני להדמיית רקמות.&nbsp;</td></tr><tr><td>מים מזוקקים UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>מים אחרים ללא RNA/DNA/נוקלאז מתאימים גם הם. משמש לדילול אתנול בלבד.&nbsp;</td></tr><tr><td>צנצנות שקופיות Slide-Fix</td><td>ירוק עד</td><td>240-5440-G8K</td><td>כל מחזיק שקופיות/צנצנת מתאים גם הוא. יש לנקות לפני השימוש. משמש לקיבוע לאחר החתך.&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת נגד גלגול, Assy. 70 מ"מ 100 &mu; m</td><td>Leica Biosystems</td><td>14041933980</td><td>סוג צלחת נגד גלגול נקבע לפי סוג הקריוסטט ומיקום החיבור על הבמה. לכל הקריוסטטים יש דרישות שונות.&nbsp;</td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D5758-50 מ"ל</td><td>DEPC מכל ספק יעשה. עקוב אחר ההוראות לטיפול במים.&nbsp;</td></tr><tr><td>ניתן להזמין את Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Kimwipes מכל ספק ולהשתמש בו בכל גודל. יש להשתמש ב-Kimwipes לניקוי מיקרוסקופ וקריוסטט.</td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td>כל מותג של OCT מקובל. שום רקמה לא תוטמע ב-OCT, קשה להצמיד רקמה ל'צ'אק'.&nbsp;</td></tr><tr><td>להבי מיקרוטום Edge-Rite בעלי פרופיל נמוך</td> סוג הלהב <td>Thermo Scientific</td><td>4280L</td><td>נקבע לפי סוג הקריוסטט. לכל הקריוסטטים יש דרישות שונות.&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica Microsystems 3P&nbsp; צ'אקים קריוסטטים 25 + 30 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC0558768</td><td>סוג צ'אק נקבע לפי סוג הקריוסטט. לכל הקריוסטטים יש דרישות שונות. כל גודל מתאים.&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת מיקרו RNeasy (50)</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>נדרשת לחילוץ RNA לאחר LCM. RLT מאגר ליזה חיוני לאיסוף תאים שנלכדו מכובע אטום.&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת מיני RNeasy (50)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>נדרשת למיצוי RNA של הכנת חתכים, המבוצעים לפני LCM כדי לבדוק את תקינות ה-RNA של רקמות ההתחלה.</td></tr><tr><td>ערכת DNase נטולת RNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Dnase תסיר כל DNA כדי לאפשר אוכלוסיית RNA טהורה. ודא ש-Dnase נעשה טרי.&nbsp;</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M6250-100ML</td><td>נפח נרכש לפי שיקול דעתו של המשתמש. הכרחי לתוספת למאגר RLT לליזה של תאים. מונע פעילות RNase.&nbsp;</td></tr><tr><td>גלוב סיינטיפיק&nbsp; לוט צינור מיקרוצנטריפוגה מדורג מוסמך (2 מ"ל)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-010-092</td><td>כל צינור של 2 מ"ל נטול RNase, ללא DNase, ללא DNA אנושי וללא פירוגן יעשה.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

פרוטוקול אל חלד באיכות גבוהה בידוד rna של לייזר לכידת תאי microdissected purkinje המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

לייזר לכידת microdissection (LCM) הוא כלי יתרון זה מאפשר עבור האוסף של תאים cytologically או phenotypically רלוונטי או אזורים של רקמות heterogenous. המוצר שנתפסו ניתן להשתמש במגוון של שיטות מולקולריות חלבון, בידוד ה-DNA או RNA. אולם, שימור של RNA מרקמות המוח האנושי לאחר המוות הוא מאתגר במיוחד. טכניקות להדמיה סטנדרטי עבור הפונקציה LCM דורשים היסטולוגית או שגרות מכתימים immunohistochemical אשר יכול לקדם לבזות RNA. לכן, תיכננו פרוטוקול נירוסטה עבור הפריט החזותי LCM עם הייעוד של שמירה על תקינות RNA ברקמת המוח האנושי פוסט-מורטם. התא Purkinje של המוח הקטן הוא מועמד טוב ויזואליזציה אל חלד, עקב בגודל ובמיקום אופיינית. קליפת אסטרוציטומה יש שכבות נפרדות נבדלים צפיפות התאים, הפיכתם של ארכיטיפ טוב לזיהוי תחת בהגדלה מיקרוסקופית. תאי Purkinje הם נוירונים גדול ממוקם בין השכבה תא גרגר, שהינה רשת סלולרית בצפיפות של נוירונים קטן, השכבה המולקולרית, אשר הוא דליל בגוף התא. בגלל זה אדריכלות, השימוש של ויזואליזציה נירוסטה הוא ריאלי. מערכות אחרות איברים או תא המחקים פנוטיפ זה יהיה גם מתאים. פרוטוקול נירוסטה נועד לתקן רקמת קפוא טרי עם אתנול ולהסיר שומנים עם קסילן להמחשת מורפולוגי משופרת תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה. פרוטוקול זה אינו חשבון בשביל שיטות קיבוע אחרות, היא תוכננה במיוחד עבור דגימות רקמה מוקפאות שנלכדה באמצעות של אולטרה סגול (UV)-מערכת LCM. כאן, אנו מציגים עבור חלוקתה ותיקון רקמות אנושיות אסטרוציטומה טריים קפואים פוסט-מורטם וטיהור של RNA מתאי Purkinje מבודדת על ידי UV-LCM, תוך שמירה על איכות ה-RNA עבור ה-RNA עוקבות-רצף פרוטוקול מלא. בידיים שלנו, פרוטוקול זה מייצר רמות יוצאות דופן של ויזואליזציה הסלולר ללא צורך מכתים ריאגנטים ותשואות RNA במספרים גבוהים RNA תקינות (≥8) לפי הצורך לניסויים פרופיל תעתיק.

פרוטוקול זה מפרט את השלבים להכנת רקמת המוח האנושי טריים קפואים פוסט-מורטם UV-LCM. מפרט יסודית וביאורים ניתנים לחיתוך cryostat, כפי שהוא יכול להיות קשה לחתוך את רקמת המוח קפוא טרי עם רמה גבוהה של דיוק. הנקודה החשובה ביותר שיש לקחת בחשבון הוא כי רקמת קפוא טרי הוא קר מאוד ודורש כמות משמעותית של זמן להתאקלם הטמפרטורה החמים של cryostat. . אי אפשר לזרז את שלב זה, אי-אפשר להגזים איך מרכזי השלב זה ההצלחה או הכישלון של פרוטוקול זה. אם הרקמה אינו מוכן כהלכה-cryostat, כל הניסיונות הבאים על זיהוי תאי...

פרוטוקול זה משתמש בגישה העיניינים להמחיש, בידוד תאי Purkinje ברקמת קפוא טרי מן המח האנושי פוסט-מורטם באמצעות לייזר ללכוד microdissection. המטרה של פרוטוקול זה היא לייצר כמויות מספיקות של RNA באיכות גבוהה עבור רצפי RNA.

פרוטוקול אל חלד באיכות גבוהה בידוד RNA של לייזר לכידת תאי Microdissected Purkinje המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי, כי הוא משתמש בשיטת הדמיה ללא כתמים במקום הדמיה מבוססת צבע על רקמת המוח האנושית שלאחר המוות, אשר מסייע לשמור על שלמות RNA. שימור RNA הוא יתרון גדול בפרוטוקול זה, כפי שהוא שימושי, לא רק ברקמת המוח האנושית שלאחר המוות, אלא גם סוגים אחרים של רקמות, עם פעילות RNase גבוהה. כדי להתחיל, להסיר את הרקמה מהמקפיא ולהחיל אותו על קרח יבש להובלה ל cryostat.מניחים את המברשות הנקיות, הצ'אק והרקמות בהקפאה למשך 20 דקות לפחות, כדי לאפשר להם להגיע לטמפרטורה האופטימלית. עבור קריוסטאטים עם תאים כפולים וטמפרטורות מחזיקות דגימה, הגדר את טמפרטורת האובייקט למינוס 16 מעלות צלזיוס ואת טמפרטורת התא למינוס 18 מעלות צלזיוס. הגדר את עובי החלק של ההקפאה ל-14 מיקרומטר ואת עובי הקיצוץ ל-30 מיקרומטר.לאחר מכן, לנקות את הבמה עם תערובת של אחד לאחד של Decontaminator RNase ו 70% אתנול, כדי למנוע הקפאה. להשיג להב קריוסטט חדש, חד פעמי ולנקות אותו עם decontaminator RNase. מניחים את הלהב הנקי במחזיק הלהב על הבמה.לאחר מכן, לנקות את צלחת נגד רול עם Decontaminator RNase. חבר את הצלחת ניקה לבמה ולחכות לפחות 20 דקות עבור הלהב ואת צלחת נגד רול לרדת לטמפרטורה של קריוסטט. ראשית, לחתוך חתיכה קטנה של רקמה עבור חתך, לוודא כי החלק הוא כ 95% קליפת המוח הקטן.מחזירים את הרקמה הנותרת לקרח יבש, או למקפיא, במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, התחילו לאט להוסיף OCT על גבי הצ'אק בהילוך איטי ועגול. לבנות שכבות של OTC עד שיש הר כשלושה מילימטרים גבוה מכסה את צ'אק.כאשר OCT קפוא חלקית, אבל עדיין יש קצת נוזל במרכז, מניחים את הרקמות על גבי ההר. תן לרקמה לשבת על גבי OCT במשך 1 עד 2 דקות עד שהוא קפוא לחלוטין. לאחר מכן, להעביר את צ'אק עם OCT קפוא ורקמות לזרוע חיתוך קריוסטט.התאימו את הרקמה כך שהיא תישטף עם להב החיתוך ותנו לרקמה לשבת בזרוע החיתוך במשך 20 דקות כדי להסתגל לטמפרטורה החדשה. הצעד הקריטי ביותר הוא לאפשר לרקמה להתאקלם בזרוע חיתוך ההקפאה כל עוד יש צורך. אם רקמות לגזרים, הדמיה של תא purkinje יהיה קשה מאוד.אני ממליץ להשתמש בפיסות רקמה קטנות ודקה יותר, כדי לאפשר לרקמה להתאקלם מהר יותר. לאחר מכן, לאט לאט להזיז את הרקמה קרוב יותר ללהב. ברגע שהרקמות הגיעו ללהב, התחילו בתהליך הקיצוץ.חותכים את הרקמה פעמיים עד שלוש פעמים, עד ששכבות קליפת המוח נראות לעין. לאחר מכן, מניחים ומיישרים את צלחת האנטי-רול ממש מעל להב ההקפאה. חותכים ארבעה עד שישה חלקים בעובי 14 מיקרומטר, ומצים כי חלקים חתוכים כראוי יהיו שטוחים מתחת לצלחת האנטי רול.יישר את המקטעים החתוכים אופקית לאורך שלב ההקפאה. זווית שקופית להרים את כל חתיכות הרקמה בו זמנית. מיד לאחר חתך הרקמה, מניחים את השקופית במחזיק השקופית עם 70% אתנול על הקרח במשך שתי דקות.העבר את השקופית למחזיק שקופית עם 95%אתנול על קרח למשך 45 שניות. לאחר מכן, מקם את השקופית במחזיק השקופית עם 100% אתנול בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. טובלים את השקופית שלוש פעמים במחזיק השקופית המכיל קסילן מספר אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, מקם את השקופית במחזיק השקופית עם קסילן 2 בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לעמוד את השקופיות למעלה ברדס אדים נקי ולתת להם אוויר יבש לפחות 30 דקות. אם מאחסנים את השקופיות, מניחים כל אחד לתוך צינור נפרד 50 מיליליטר ומ מניחים את הצינורות לתוך מקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שבעה ימים.ראשית, השתמשו במפרק RNase לניקוי שלב המיקרוסקופ וזרוע איסוף הכובעים. עם ידיים כפפות, מניחים את המגלשה על המיקרוסקופ וכובע אטום 500 מיקרוליטר בזרוע האיסוף. בהגדלה נמוכה, ליישר את הכובע אטום על הרקמה המוחית, לסמוך על כך הכובע מכסה את האזור כולו כי הוא דמיינו את פיסת העין.השתמש במטרה חמש פעמים עד 10 פעמים כדי לדמיין את השכבות המוח הקטן. מקם את הסמן מעל המקטע שבו שכבה מולקולרית ושכבת תא גרנית מצטלבים. עבור להגדלה של פי 40 והדמי את תאי הפורקיניה.לאחר מכן, להתחיל ללכוד אותם. כדי להתחיל באיסוף RNA לאחר המיקרו-דיסקטמנט, הוסף 50 מיקרוליטרים של מאגר תותבת התא למכסה אטום כשהכובע פונה כלפי מעלה. סגור בזהירות את הצינור מעל המכסה והמשך עם האוסף כמפורט בפרוטוקול הטקסט.בפרוטוקול זה, טרי, קפוא, לאחר המוות, רקמת המוח האנושית מוכנה למיקרו-דיסקטקט לכידת לייזר UV. לאחר הניתוק של cryostat בזמן הציור המוקצב, השכבות התאיות של המוח הקטן נראות בקלות עם חמש פעמים ו 10 פעמים עדשות אובייקטיביות. כפי שניתן לראות כאן, דגירה קסילן נכונה גורמת לרקמה להיות כהה יותר ומתואם טוב יותר שכבות הסלולר מאשר אתנול לבד.בעת חיתוך במיקרוסקופ לכידת לייזר, העדשה אובייקטיבית 40 פעמים נדרש כדי להבטיח לכידת רק תאים purkinje ולא הרקמה שמסביב. כפי שניתן לראות כאן, הדגירה הנכונה בקסילן מייצרת תמונה איכותית ללא פגע מורפולוגית בהשוואה ל קיבוע אתנול בלבד. יכולת החלקת הכיסוי של כובע אטום נבדקת לאחר מכן בעוד פרוטוקולים אחרים משתמשים בכובע מלא בנוזלים, כובעים אלה יכולים להפחית את הדמיית הרקמות ולגרום לתמונה המתקבלת להיות גרגירית וססגונית מתחת למיקרוסקופ.עם זאת, הדמיה באמצעות כובע אטום גורמת למראה הרקמה החלקה כי הוא רך וחד יותר בצורה. תמונות מייצגות של תאי purkinje excised בהפקת כוח נמוך ובעוצמה גבוהה להראות הסרה מדויקת של רק את גוף התא purkinje. לאחר מכן, Rnase באיכות גבוהה מתקבל עבור רצף RNA הבאים.שש דגימות מייצגות עברו מיצוי RNA ונוסו מחדש ב-14 מיקרוליטרים של מים נטולי Rnase וכל שש הדגימות ייצרו רנ"א באיכות גבוהה עם מספרי תקינות RNA השווים או גדולים משמונה. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא כי איכות הרקמות היא הכל. אפילו חיתוך ומיקום שקופית יעשו או ישברו פרוטוקול זה.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע כל שיטה החוקרת RNA או DNA, במיוחד אנו בודקים את ה- RNA שלנו לביטוי גנים דיפרנציאלי, אך שאלות אחרות לגבי ויסות גנים יכולות להיחקר גם כן. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל סוג רקמה שיש לו מורפולוגיה ספציפית קווית שאינה דורשת שימוש באנטיגן או בריאגנטים ספציפיים לצבוע לזיהוי תאים מעניינים. אנו מקווים כי טכניקה זו תעזור לנו להבין את הגנטיקה של רעד חיוני ומחלות אחרות שיש להם פנוטיפ רעד.הכימיקל המסוכן ביותר המשמש בפרוטוקול זה הוא קסילן. זה צריך להיות מטופל כראוי ברדס אדים, להיפטר כראוי, שקופיות צריך להיות מותר להתייבש כראוי עד לשימוש בשטח פתוח. בנוסף, בעת עבודה עם דגימות אנושיות, ניהול פסולת biohazardous, ובטיחות יש לנצל.

a-stainless-protocol-for-high-quality-rna-isolation-from-laser

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים תהליך באמצעות לייזר ללכוד microdissection לבודד תמצית RNA מתוך אוכלוסייה הומוגנית תא, עצב פירמידליים, בשכבה III של gyrus הזמני מעולה במוח האנושי שלאחר המוות. לאחר מכן אנו להגביר באופן ליניארי (T7 מבוססי) mRNA, ועל להכליא את המדגם כדי האנושית Affymetrix X3P microarray.

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

פרופיל ביטוי של RNA מאזורים מובחנים במוח של עכבר דורש אסטרטגיה מדויקת וחזרתית לאיסוף רקמות. כאן מתואר פרוטוקול המשתמש הן בחיתוך קורונלי של המוח והן במיקרודיסקציה בעזרת מחלל רקמות (tissue corer). התנובה והאיכות של ה-RNA הכולל שהתקבל מהדגימות שהופקו מאשרות את יעילותו של המהלך המתואר.

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

סרטון זה מדגים כיצד לבודד תאי פורקינג'ה מרקמת מוח מוחי אנושית לאחר המוות באמצעות מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר.

לכידת מיקרו-דיסקציה בלייזר לבידוד תאי פורקינג'ה מרקמת מוח מוח אנושית לאחר המוות

RNA כולל באיכות גבוהה הוכן מגופי תאים של נוירונים מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר microdissection לאחר הכתמת מקטעי חוט השדרה עם תכלת B ב 70% אתנול. מספיק RNA (~ 40-60 ng) הוא התאושש מ 3,000-4,000 נוירונים מוטוריים כדי לאפשר ניתוח RNA במורד הזרם על ידי RNA-seq ו qRT-PCR.

ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית מבודד מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). פרוטוקול זה כולל הכנת קפואה דגימות של רקמות אנושיות מעיים, cryosectioning, ethanolic מכתים, התייבשות, הפונקציה LCM, והפקת RNA.

אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד במהירות את הגרעינים באיכות גבוהה מן הרקמה טרי או קפוא עבור רצפי RNA בנפט מקבילים במורד הזרם. אנו כוללים רקמת חומרי ניקוי-מכניים, היפוטוניק-מכניים הפרעה ותא פירוק אפשרויות, אשר שניהם יכול לשמש עבור בידוד של גרעין האטום.

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

פרוטוקול לכידת מיקרודיסקציה (LCM) לכידה פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים בתאים של כל רקמה קשה.

לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא

אזורים מוחיים שונים כבר מעורבים לשחק תפקיד תפוקות התנהגותיות ברורות, עדיין המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין לא ידוע. עבודה זו מתארת שיטה להתרבות במהירות ולנתח קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור, האזורים הקדמיים והאחוריים של ורמיס, ואת גרעיני המוח הקטן העמוקים על מנת לחקור הבדלים מולקולריים על ידי בידוד RNA ובדיקת הבדלים בביטוי הגנים.

ניתוח אזורי של Cerebellar לניתוח מולקולרי

המחקר מתאר פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים איכותיים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף RNA של גרעינים בודדים במורד הזרם.

פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים בודדים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף גרעין יחיד

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד RNA מאזורים היסטולוגיים מוגדרים של רקמת כבד עכבר, המוטמעת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית בטמפרטורת חיתוך אופטימלית באמצעות מיקרודיסקציה ללכידת לייזר, המאפשרת ניתוח ביטוי גנים ממוקד במורד הזרם.

מיקרודיסקציה בלייזר של רקמת כבד עכבר מקובעת בפרפורמלדהיד לניתוח RNA

למדו פרוטוקול לכידת תאים בלייזר לבידוד תאי פורקינייה ממוח אנושי פוסט-מורטם. השיטה ללא צביעה שומרת על שלמות ה-RNA לסיקור גנומי איכותי במחקר נוירוביולוגי.

פרוטוקול אל חלד באיכות גבוהה בידוד RNA של לייזר לכידת תאי Microdissected Purkinje המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן

גלה סרטונים נוספים