Assay תקשורת צומת-המערכת יודיד-צהוב הניאון חלבון-Gap

צמתים של גאפ הוצעו כיערות סמים. יודיד-YFP-GJIC הראיה תואמת עם סינון תפוקה גבוהה כדי לגלות אפנוני צומת פער. זה שימשו כדי לבדוק את ההשפעות של מספר רב של תרכובות על פעילות צומת פער בתקופה קצרה יחסית.

יודיד-YFP-GJIC הראיה היא פשוטה, חזקה, חוזרת וזול. ההתמדה הזו דורשת רק תאים מקבלים ותורמים ושני פתרונות מלח מאוזנים. אין צורך בריגנטים נוספים כגון לוציפר צהוב וקלסין AM.

כמו כן הוא מודד את סך כל פעילויות צומת הפער של התאים באר אחת שתוותה שונות נמוכה בין בארות. כדי להתחיל בהליך זה, הגדל תאי LN215 ל- 80%confluency ב- DMEM נוסף כמפורט בפרוטוקול הטקסט. יום אחד לפני ההעתקה לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS.

מוסיפים שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לתאים ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. באמצעות פיפסה סרולוגית 10 מיליליטר להשתמש מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של בינוני תרבות ולהתאים את צפיפות התא ל 50, 000 תאים למיליליטר. הוסף 400 מיקרוליטרים של מדיה המכילים 20,000 תאים לכל באר של צלחת תרבות של 24 בארות.

דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. למחרת להחליף שתי בארות על ידי החלפת מדיום התרבות עם 400 microliters של תערובת של אחד לאחד של lentivirus ותרבות טרייה בינוני בתוספת פוליברן בריכוז סופי של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר. עבור פקדי הנגיף לא להחליף את מדיום התרבות עם בינוני תרבות טרי בתוספת פוליברן בריכוז סופי של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר.

דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 שעות. לאחר מכן שאף את המדיום המכיל lentiviruses, ואת מדיום תרבות טרי. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות נוספות.

לאחר מכן, לשטוף את התאים בכל באר פעמיים עם 0.5 מיליליטר של PBS. מוסיפים 300 מיקרוליטרים של 0.25% טריפסין EDTA לתאים, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. תן את התאים בשני מיליליטר של מדיום תרבותי, ולאחר מכן צלחת אותם צלחות תרבות שש באר עם שני מיקרוגרם למיליליטר של puromycin.

תרבות התאים עד שכל התאים בארות הבקרה מתים, אשר בדרך כלל לוקח בערך שבוע. ראשית, בנפרד תרבות LN215-YFP ותאי LN215-יודיד ב 100 מילימטר צלחות בתרבות בינונית כדי להגיע לאוכלוסיות הנדרשות עבור המבחן. יום אחד לפני ההתנגדות, לשטוף כל צלחת עם 10 מיליליטר של PBS.

לטפל בכל צלחת עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין פתרון EDTA, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. תעבירו את התאים לארבעה מיליליטר של מדיום תרבותי ותעבירו אותם לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 1, 000 גרם במשך שלוש דקות כדי גלולה התאים.

השליכו את העל-טבעי והתינו מחדש כל גלולת תא בחמישה מיליליטר של מדיום תרבותי. פיפטה למעלה ולמטה בערך 20 פעמים כדי לשבור את כל גושי התאים. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים.

ואז לדלל את התאים במדיום תרבות כדי להפוך את השעיית התא בצפיפות המוצגת כאן. לאחר מכן, מערבבים שבעה מיליליטר של כל מתלה תא יחד במאגר. השתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף 100 microliters של תערובת זו לכל באר של צלחת תרבות 96-well.

דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. ראשית, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הגדלה של פי 20 ומסנן GFP כדי לבדוק את הצלחות של 96 בארות כדי להיות בטוח שאין גושים של תאים, ושתרבויות הן confluent מלא מופץ היטב. לפחות 30 דקות לפני שההתנגדות מפעילה קורא מיקרופלסטיק ומגדירה אותו ל-37 מעלות צלזיוס.

לשטוף את הצינורות של מזרק אוטומטי עם שלושה מיליליטר של 70% אתנול, שלושה מיליליטר של מים מזוקקים, ושלושה מיליליטר של I-פתרון. לאחר מכן, לחמם את פתרונות C ו- I ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. או להפוך את מדיום הצמיחה או להפוך את הצלחת כדי לרוקן אותו.

הקש על כל מדיום שיורית. לאחר מכן הוסיפו את פתרון C למאגר באמצעות פיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 200 מיקרוליטרים של C-solution לכל באר של הצלחת. או לחושף את הפתרון או להפוך את הצלחת כדי לרוקן אותו, מה שהופך את הקש החוצה כל פתרון שיורית.

הוסף 50 מיקרוליטרים של C-פתרון לכל באר. לאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של מלאי כימי של 2.5 מילימולרים או DMSO כרכב, והוסיפו עוד 50 מיקרוליטרים של C-solution לכל באר. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס באוויר במשך כ 10 דקות.

במהלך הדגירה, התחל להגדיר את הפרמטרים בתוכנית קורא המיקרופלסטיק על-ידי לחיצה על לחצן נהל פרוטוקולים. לחץ על לחצן חדש. בחרו בעוצמת הפלואורסצנטיות באזור 'שיטת מדידה' וב'מצב באר' באזור 'מצב קריאה'.

לאחר מכן, לחץ על לחצן אישור. כרטיסיה חדשה תופיע. בתפריט פרמטרים בסיסיים הגדר את אורך הגל של העירור ל- 485 ננומטר, ואת הפליטה ל- 520 ננומטר.

בחר את אופטיקה התחתונה כדי לקרוא פלואורסצנטיות מלמטה. לאחר מכן הגדר את זמן התחלת המדידה כאפס שניות, את מספר המרווחים ל- 25, את מספר ההבזקים ל הבאר ואת מרווח הזמן ל- 20 ואת זמן המרווח ל- 0.4 שניות. בתפריט 'פריסה' צייר אזור של הלוח לקריאה.

בתפריט ריכוזים/כרכים/צריף הגדר את קורא המיקרופלסטיק להזריק 100 מיקרוליטרים של I-solution לכל באר במהירות הזרקה של 135 מיקרוליטרים לשנייה. בתפריט זמן הזרקה הגדר את זמן ההתחלה של ההזרקה לשנייה אחת. לאחר מכן לחצו על הלחצן 'התחל מדידה'.

לאחר השלמת הדגירה, העבר את לוחות 96 הבאר לקורא המיקרופלסטיק והתחל את המדידה על-ידי לחיצה נוספת על לחצן התחל מדידה. במחקר זה, יוד צהוב פלואורסצנטי חלבון-פער צומת-intercellular תקשורת מבחן משמש עם LN215-YFP ו LN215-יוד תאים כדי מסך 2, 320 כימיקלים כדי לזהות צומת פער חדש אפנן תקשורת תאית. Homosalate נראה לעכב 50% של צומת פער תקשורת תאית.

בעוד טרביניפין מעכב אותו לחלוטין. זה מאשר טרביניפין כמעכב צומת פער. הערכה זו מודדת את GJIC בין תאים תורמים ומקבלים שכנים, ולכן יש לנתק לחלוטין את התאים התורמים והמקבלים לפני ציפוי.

והמינוי של התרבות המעורבת צריך להיות 100% כדי למקסם היווצרות של צמתים פער בין תאים. נתוני קורס זמן, יחסי תגובה במינון, והערכת ההפיכה של אפנוני צומת פער ניתן להשיג עם יודיד-YFP-GJIC הערכה. כמו כן, Iodide-YFP ספציפי connexin GJIC בדיקות ניתן ליצור על ידי גרימת הביטוי של connexin של עניין לתוך התאים נטול צמתים פער פונקציונלי.

זה מאפשר לקבוע ערך IC50 של כימיקל מסוג מסוים של connexin. יודיד-YFP-GJIC ניתן להשתמש עבור הקרנת תפוקה גבוהה, כי זה חזק, חוזר, וזול. בדיקות אלה מסייעות למצוא צומת פערים המווסת כימיקלים לגילוי תרופות והערכה טוקסיקולוגית.