יישומים של מיפוי-עתיים, טכניקות ניתוח חלקיקים לכמת Ca תאיים2 + איתות בחיי עיר
January 7th, 2019
Ca מקודדים גנטית2 + מחוונים (GECIs) השתנו באופן קיצוני איך באתרו Ca2 + הדמיה מבוצעת. כדי למקסם את שחזור נתונים מהקלטות אלו, נדרש ניתוח הולם של Ca2 + אותות. הפרוטוקולים נייר זה להקל על כימות של Ca2 + מאותת הקליט באתרו באמצעות מיפוי ייתכן וניתוח מבוסס חלקיק.
היכולת לרכוש כמויות גדולות של נתונים מניסויים בהדמיית סידן השתפרה באופן דרסטי, במיוחד עם ניסויים בהדמיית רקמות. הפרוטוקולים שלנו מתארים טכניקות ניתוח מתאימות לכימות ולתיארו של ערכות נתונים אלה. הפרוטוקולים שלנו מייצרים מגוון של ערכים מרחביים, זמניים ועוצמתיים שהם מהותיים לאיתות סידן ברקמות שלמות וזה יכול ללכת לאיבוד בניתוח בסיסי יותר.
שעה לפני ההדמיה להעביר מעי דק שנקטפו מעכבר עם תאים interstitial של Cajal או ICC המבטאים במיוחד מחוון סידן מקודד גנטית לשלב של מיקרוסקופ קונפוקל דיסק מסתובב. ומבלבלים ללא הרף את הרקמה עם 37 מעלות צלזיוס קרבס-רינגר ביקרבונט או פתרון KRB. באמצעות הגדלה של 60 עד 100 X, אתר את המקלעת המעי הגס בצורת סטלטה ICC או ICC-MY בין שכבות השריר החלקות המעגליות והאורך של המעי הדק.
לאחר מכן אתר את מקלעת השרירים העמוקה בצורת ציר ICC או ICC-DMP במישור אחד בין שכבת השריר החלקה המעגלית לבין מקלעת תת-התערובת ושמור את הסרטים כערימת תמונות TIFF. ליצירת מפות מרחביות או STMs של פעילות הסידן ICC-DMP, פתחו את ערימת התמונות ב- ImageJ ולחצו על תמונה, הקלד ו- 32 סיביות כדי לשנות את איכות התמונה. ליצירת סריקת קו לחצו לחיצה ימנית על כלי בחירת הקו ובחרו קו מקולח.
באמצעות לחיצות בודדות שמאלה לצייר קו לאורך הגישה האמצעית של ICC-DMP בודדים, לחיצה כפולה כאשר התא כולו כבר מיתאר. בחר תמונה, ערימות ו- Reslice. יופיע חלון מוקפץ.
בחר סובב 90 מעלות כדי לכוון את סריקת הקו משמאל לימין כך שניתן יהיה לכייל אותה ולקרוא אותה כנגד הזמן בציר ה- x עם רווח על ציר ה- y ולחץ על אישור. המפה המרחבית תופיע. כדי למדוד במדויק את משרעת אותות הסידן מהמפה, בחר בחירה מלבנית וצייר אזור מעניין באזור STM המציג את האזור האחיד והפחות אינטנסיבי של פלואורסצנטיות. לחץ על נתח והיסטוגרמה כדי לקבל ערך ממוצע של העוצמה בתוך אזור העניין שנבחר ולחץ על ערוך, בחירה, בחר הכל כדי לבחור את STM כולו.
לאחר מכן, לחצו על 'תהליך', 'מתמטיקה' ו'חילוק' והזינו את הערך הממוצע של העוצמה עם אזור STM שנבחר של עניין בתיבה הנפתחת. STM יהפוך שחור. תקן זאת על-ידי לחיצה על תמונה, כוונון, בהירות/ניגודיות ואוטואי אוטומטי בחלון המוקפץ.
סריקת הקו כעת תהיה מכוילת עבור משרעת בעוצמת הפלואורסצנטיות המובעת כנוהורסצנטיות המחולקת על ידי אפס פלואורסצנטיות. STM יציג את מספר המסגרות בערימה TIFF על ציר x ואת מספר הפיקסלים המייצגים את אורך התא על ציר y. כדי לכמת את הנתונים הזמניים והמרחביים מאותות הסידן, לחץ על תמונה ומאפיינים והזן את הערכים המתאימים כדי לכייל באופן מלא את ה- STM למרחב ולזמן בחלון המוקפץ.
כדי לנתח את אירועי הסידן הבודדים לחץ על קו ישר ולחץ וגרור על STM כדי לצייר קו אופקי ישר דרך מרכז אירוע סידן במקביל לציר x. לאחר מכן לחץ על נתח והתווית פרופיל. תופיע קופסה המציגה את פרופיל העלילה של אירוע הסידן.
לניתוח מבוסס חלקיקים של נתוני איתות הסידן ICC-MY, פתח את קובץ הסרט ב- Volumetry ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור מסנן STK, להבדיל. לחץ שוב באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להזין ערך להבחנה. הקש Enter ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי ליזום את ההידול.
כדי ליצור חלקיקים, השתמש בלחצן העכבר האמצעי כדי לגלול בסרט כדי לבחור מקטע מסגרת של 20 עד 40 הכולל תקופת התכה הדרגתית, ואחריו התרחשות של אשכול סידן ארעי ו- 20 עד 40 מסגרות הבאות מיד לאחר האשכול. כאשר כל המסגרות נבחרו לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון הסרט כדי לגשת למידע חלקיקי STK OPS Ramp DS ולחץ כדי להפעיל שגרת ניתוח חלקיקים המדרגה בהדרגה את הסף מהעוצמה המרבית לעוצמה המינימלית. כדי להבטיח ניתוח חלקיקים מוצלח, ודא שאתה משלב כמה שיותר טרום סידן צביר ארעי אי פעילות, וכמה שיותר לאחר סידן צביר ארעי אי פעילות כפי שאתה יכול.
זה יעזור להגביר את יחס האות לרעש. הניתוח יוצג בצורה גרפית בחלון העלילה כמזימה של רעש ובחלון העקבות כשלושה עקבות צבע עם העקבות הירוקים המייצגים את מספר החלקיקים, העקבות האדומים המייצגים את גודל החלקיקים הממוצע, ואת העקבות הכחולים המייצגים את סף העוצמה המוחלטת. כדי לאזן את העלילה של רעש חלקיקים הקש H על המקלדת.
לאחר מכן הקש על מקש הסוגר הימני כדי לעבור בין ערכות צבעים עד שהרקע יהיה לבן עם עקבות הצבע למעלה. הקש F על המקלדת פעם אחת כדי להעלות כלי מדידה. לאחר מכן הקש F פעם נוספת כדי לסמן קו אנכי יחיד בפס הגלילה של חלון העקבות בהתוויה בצומת שבה החלקות הצבעוניות מתחילות לעבור לצד ימין.
בתוך חלון המעקבים השתמש בלחצן העכבר האמצעי כדי לגלול מנקודת הפריסה של המעקב האדום לקו האנכי הלבן המסומן. לאחר שרשמת את ממוצע ה- Y המוצג, לחץ שוב על לחצן העכבר האמצעי בתוך חלון המעקבים כדי לבטל את הבחירה בעקבות הכחולים. בחלון הסרט, לחץ על C כדי להעלות גלגל צבעים, ועל D כדי להתאים את הסף.
חלקיקים תקפים יוצגו כעת באדום, ואלה הרוויים יהיו לבנים. השתמש בלחצן העכבר השמאלי כדי לגלול עד הסרת האזורים הלבנים ולהשתמש בלחצן העכבר האמצעי כדי להתאים את הערך המספרי הצהוב בגלגל הצבעים לערך הממוצע Y כדי להקצות הכל באדום כחלקיק ארעי סידן פעיל בנקודת הסף שנקבעה. לשמירת הנתונים כקובץ חלקיקים מבוסס קואורדינטות לחצו לחיצה ימנית כדי לגשת ל-STK 3D, שמרו אפס חלקיקים ולחצו שמאלה לשמירת הקובץ.
כדי ליצור מפות חום של פעילות חלקיקים, פתח את קובץ החלקיקים שנשמר ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון הסרט כדי לגשת לחלקיקים STKops, דגל StatMap והזן הקצאות דגל לניתוח. לחץ כדי להחיל את הניתוח ומפת חום המציגה את כל החלקיקים לכל אורך ההקלטה עם צבעים שונים המייצגים את מופע האחוזים לאורך ההקלטה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לשמור את מפת החום כקובץ TIFF.
לאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון הסרט כדי לגשת למדידת חלקיקים, סטטיסטיקת החלקיקים STK שווה והזן הקצאת דגל עבור הניתוח. סידרה של עקבות תיווצר בחלון המעקב. ניתוח STM מספק את היכולת לנטר ולתרשם את המאפיינים המרחביים של איתות סידן, כגון התפשטות מרחבית ומהירות התפשטות.
מידע זה יכול להיות צבר כדי לספק תצוגה מלאה למדי של התנהגויות איתות סידן בתוך תאים בסביבות המקומיות שלהם. באמצעות ניתוח חלקיקים, מידע כמותי על איתות סידן יכול להיות מחושב על ידי מדידת אזור החלקיק ואת ספירת החלקיק, אשר יחד ניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את הטווחים המרחביים של הפעלת אות סידן בתוך שדה תצוגה מסוים. ניתוח חלקיקים מאפשר גם כימות מעמיק של איתות סידן תת-תאי באמצעות בדיקת המיקום והסתברויות הירי של אתרי ירי סידן.
על ידי קצתית החלקיקים לדגלים שונים בהתבסס על המאפיינים הזמניים שלהם, ניתן למפות במדויק את החלקיקים היוזם. ושפע של נתונים קשים שנרכשו על מספר אתרי החניכה, גודל האתר בפיקסלים ומיקרומטרים, ההסתברות שכל אתר חניכה יורה פעם או מספר פעמים במהלך כל אשכול סידן ארעי, ואחוז אתרי הירי שיורים במהלך כל מחזור אשכול ארעי סידן ניתן להשיג. עקביות היא המפתח להצלחה בפרוטוקול זה.
כל ערכות הנתונים וכל הסרטים חייבים להיות מטופלים בדיוק אותו הדבר כדי להבטיח תוצאות אמינות הניתנות לחזרה. הדבר נכון במיוחד כאשר עוסקים בקבצי חלקיקים. הפרוטוקולים שלנו מאפשרים אפיון עמוק של איתות סידן באתרו, ומגוון שיטות סטטיסטיות, כאשר נעשה בהן שימוש הולם, יכולות להעריך הבדלים בין מגוון פרמטרים מרחביים ותז זמניים.
טכניקות ניתוח אלה בפרוטוקול שלנו אפשרו לחוקרים לשאול ולענות על שאלות שלא ניתן היה לענות עליהן בעבר הנוגעות לקצב המעיים, והפנמה במעיים, כמו גם לשליטה העצבית בדרכי השתן התחתונות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מחקר זה מתמקד בשיפור הניתוח של נתוני הדמיית סידן בניסויי רקמה, במיוחד באמצעות מחווני סידן מוקודדים גנטית (GECIs). הוא מספק פרוטוקולים מפורטים המאפשרים את כימות אותות הסידן באמצעות טכניקות אנליטיות מתקדמות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום מחקר
- הדמיית סידן
- כימות אותות
- ניתוח רקמה
רקע
- שיפור רכישת נתונים מניסויי הדמיית סידן
- חשיבות של טכניקות ניתוח מדויקות בלכידת איתות סידן
- שימוש במחוונים מוקודדים גנטית לצורך הדמיה in situ
שיטות ששימשו
- מיפוי מרחבי-זמני
- ניתוח מבוסס חלקיקים
- טכניקות מיקרוסקופיה (מיקרוסקופ קונפוקלי)
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקולים מניבים נתונים מרחביים, זמניים ועצימותיים החיוניים להבנת איתות סידן
- דיוק משופר במדידת אירועי סידן ותכונותיהם
- הקמת מסגרת לניתוח אשכולות מעבר סידן בדגימות רקמה
מסקנות
- המחקר מדגים שיטות מתקדמות לכימות אותות סידן ברקמות
- מדגיש את החשיבות של גישות אנליטיות משופרות לתובנות ביולוגיות משופרות באיתות סידן
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of intracellular Ca2+ signaling in native tissue environments is critical for de-risking target validation in gastrointestinal and neuromuscular drug discovery. Spatio-temporal mapping and particle-based analysis enable extraction of spatial, temporal, and intensity parameters from high-resolution Ca2+ imaging data, reducing reliance on simplistic ROI measurements that overlook signaling complexity. This approach supports mechanistic insight into pacemaker activity and neuronal control pathways, informing predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying Ca2+ signaling patterns such as frequency, duration, propagation velocity, and amplitude in intact tissues.
- Operational Value: Supports biological de-risking through detailed characterization of interstitial cells of Cajal (ICC) activity, a key regulator of gastrointestinal motility.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking Ca2+ signaling dynamics to intestinal pacemaking and neuronal control of the lower urinary tract.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating quantitative outputs from Ca2+ transient clusters in situ.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through calibrated spatiotemporal maps (STMs) and particle-based analysis with defined thresholding and flag assignment protocols.
- Scalability: Enables screening readiness via coordinate-based particle files and heat maps that allow high-volume data processing and cross-experiment comparison.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase Ca2+ signaling analysis in intestinal ICC to preclinical validation of motility disorders and urinary tract dysfunction.
- Mechanistic De-risking: Allows in-depth quantification of subcellular Ca2+ signaling through examination of initiation site location, firing probability, and cluster dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing hard data on the number of initiation sites, site size in pixels/micrometers, and percentage of firing sites active per transient cluster cycle.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing quantitative Ca2+ signaling data that informs target validation and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing spatial spread and propagation velocity of Ca2+ signals via STM analysis.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible quantification of particle area and count, enabling spatial range determination of Ca2+ signal activation in a defined field of view.
- Analytics: Generates statistical outputs on temporal characteristics of particles, allowing allocation into flags to map initiating particles and assess firing probabilities.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of Ca2+ signaling patterns linked to intestinal pacemaking and neuronal control pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for analyzing Ca2+ signaling across model systems through standardized protocols for STM calibration, particle analysis, and heat map generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in Ca2+ signaling dynamics.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via calibrated STMs, particle-based analysis with threshold adjustment, and coordinate-based data output.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early detection of inconsistent or non-reproducible signaling patterns.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions supported by quantitative data on initiation site density, size, and firing reliability.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy, ImageJ, and Volumetry for STM generation and particle analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include spinning disk confocal microscope, TIFF image stack handling, and software for line scan reslice, histogram balancing, and threshold adjustment.
- Cross-team standardization requirements involve consistent treatment of all data sets and movies to ensure reliable, repeatable results, particularly for particle file generation and flag-based analysis.
- Adaptation considerations across model systems include adjusting line scan orientation, frame selection for quiescent and active periods, and threshold calibration based on fluorescence intensity profiles.
- Practical limitations include the need for careful selection of 20–40 frame sections encompassing quiescent periods, Ca2+ transient clusters, and post-cluster activity to ensure successful particle analysis and optimal signal-to-noise ratio.
