יישומים של מיפוי-עתיים, טכניקות ניתוח חלקיקים לכמת Ca תאיים^{2 +} איתות בחיי עיר

היכולת לרכוש כמויות גדולות של נתונים מניסויים בהדמיית סידן השתפרה באופן דרסטי, במיוחד עם ניסויים בהדמיית רקמות. הפרוטוקולים שלנו מתארים טכניקות ניתוח מתאימות לכימות ולתיארו של ערכות נתונים אלה. הפרוטוקולים שלנו מייצרים מגוון של ערכים מרחביים, זמניים ועוצמתיים שהם מהותיים לאיתות סידן ברקמות שלמות וזה יכול ללכת לאיבוד בניתוח בסיסי יותר.

שעה לפני ההדמיה להעביר מעי דק שנקטפו מעכבר עם תאים interstitial של Cajal או ICC המבטאים במיוחד מחוון סידן מקודד גנטית לשלב של מיקרוסקופ קונפוקל דיסק מסתובב. ומבלבלים ללא הרף את הרקמה עם 37 מעלות צלזיוס קרבס-רינגר ביקרבונט או פתרון KRB. באמצעות הגדלה של 60 עד 100 X, אתר את המקלעת המעי הגס בצורת סטלטה ICC או ICC-MY בין שכבות השריר החלקות המעגליות והאורך של המעי הדק.

לאחר מכן אתר את מקלעת השרירים העמוקה בצורת ציר ICC או ICC-DMP במישור אחד בין שכבת השריר החלקה המעגלית לבין מקלעת תת-התערובת ושמור את הסרטים כערימת תמונות TIFF. ליצירת מפות מרחביות או STMs של פעילות הסידן ICC-DMP, פתחו את ערימת התמונות ב- ImageJ ולחצו על תמונה, הקלד ו- 32 סיביות כדי לשנות את איכות התמונה. ליצירת סריקת קו לחצו לחיצה ימנית על כלי בחירת הקו ובחרו קו מקולח.

באמצעות לחיצות בודדות שמאלה לצייר קו לאורך הגישה האמצעית של ICC-DMP בודדים, לחיצה כפולה כאשר התא כולו כבר מיתאר. בחר תמונה, ערימות ו- Reslice. יופיע חלון מוקפץ.

בחר סובב 90 מעלות כדי לכוון את סריקת הקו משמאל לימין כך שניתן יהיה לכייל אותה ולקרוא אותה כנגד הזמן בציר ה- x עם רווח על ציר ה- y ולחץ על אישור. המפה המרחבית תופיע. כדי למדוד במדויק את משרעת אותות הסידן מהמפה, בחר בחירה מלבנית וצייר אזור מעניין באזור STM המציג את האזור האחיד והפחות אינטנסיבי של פלואורסצנטיות. לחץ על נתח והיסטוגרמה כדי לקבל ערך ממוצע של העוצמה בתוך אזור העניין שנבחר ולחץ על ערוך, בחירה, בחר הכל כדי לבחור את STM כולו.

לאחר מכן, לחצו על 'תהליך', 'מתמטיקה' ו'חילוק' והזינו את הערך הממוצע של העוצמה עם אזור STM שנבחר של עניין בתיבה הנפתחת. STM יהפוך שחור. תקן זאת על-ידי לחיצה על תמונה, כוונון, בהירות/ניגודיות ואוטואי אוטומטי בחלון המוקפץ.

סריקת הקו כעת תהיה מכוילת עבור משרעת בעוצמת הפלואורסצנטיות המובעת כנוהורסצנטיות המחולקת על ידי אפס פלואורסצנטיות. STM יציג את מספר המסגרות בערימה TIFF על ציר x ואת מספר הפיקסלים המייצגים את אורך התא על ציר y. כדי לכמת את הנתונים הזמניים והמרחביים מאותות הסידן, לחץ על תמונה ומאפיינים והזן את הערכים המתאימים כדי לכייל באופן מלא את ה- STM למרחב ולזמן בחלון המוקפץ.

כדי לנתח את אירועי הסידן הבודדים לחץ על קו ישר ולחץ וגרור על STM כדי לצייר קו אופקי ישר דרך מרכז אירוע סידן במקביל לציר x. לאחר מכן לחץ על נתח והתווית פרופיל. תופיע קופסה המציגה את פרופיל העלילה של אירוע הסידן.

לניתוח מבוסס חלקיקים של נתוני איתות הסידן ICC-MY, פתח את קובץ הסרט ב- Volumetry ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור מסנן STK, להבדיל. לחץ שוב באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להזין ערך להבחנה. הקש Enter ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי ליזום את ההידול.

כדי ליצור חלקיקים, השתמש בלחצן העכבר האמצעי כדי לגלול בסרט כדי לבחור מקטע מסגרת של 20 עד 40 הכולל תקופת התכה הדרגתית, ואחריו התרחשות של אשכול סידן ארעי ו- 20 עד 40 מסגרות הבאות מיד לאחר האשכול. כאשר כל המסגרות נבחרו לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון הסרט כדי לגשת למידע חלקיקי STK OPS Ramp DS ולחץ כדי להפעיל שגרת ניתוח חלקיקים המדרגה בהדרגה את הסף מהעוצמה המרבית לעוצמה המינימלית. כדי להבטיח ניתוח חלקיקים מוצלח, ודא שאתה משלב כמה שיותר טרום סידן צביר ארעי אי פעילות, וכמה שיותר לאחר סידן צביר ארעי אי פעילות כפי שאתה יכול.

זה יעזור להגביר את יחס האות לרעש. הניתוח יוצג בצורה גרפית בחלון העלילה כמזימה של רעש ובחלון העקבות כשלושה עקבות צבע עם העקבות הירוקים המייצגים את מספר החלקיקים, העקבות האדומים המייצגים את גודל החלקיקים הממוצע, ואת העקבות הכחולים המייצגים את סף העוצמה המוחלטת. כדי לאזן את העלילה של רעש חלקיקים הקש H על המקלדת.

לאחר מכן הקש על מקש הסוגר הימני כדי לעבור בין ערכות צבעים עד שהרקע יהיה לבן עם עקבות הצבע למעלה. הקש F על המקלדת פעם אחת כדי להעלות כלי מדידה. לאחר מכן הקש F פעם נוספת כדי לסמן קו אנכי יחיד בפס הגלילה של חלון העקבות בהתוויה בצומת שבה החלקות הצבעוניות מתחילות לעבור לצד ימין.

בתוך חלון המעקבים השתמש בלחצן העכבר האמצעי כדי לגלול מנקודת הפריסה של המעקב האדום לקו האנכי הלבן המסומן. לאחר שרשמת את ממוצע ה- Y המוצג, לחץ שוב על לחצן העכבר האמצעי בתוך חלון המעקבים כדי לבטל את הבחירה בעקבות הכחולים. בחלון הסרט, לחץ על C כדי להעלות גלגל צבעים, ועל D כדי להתאים את הסף.

חלקיקים תקפים יוצגו כעת באדום, ואלה הרוויים יהיו לבנים. השתמש בלחצן העכבר השמאלי כדי לגלול עד הסרת האזורים הלבנים ולהשתמש בלחצן העכבר האמצעי כדי להתאים את הערך המספרי הצהוב בגלגל הצבעים לערך הממוצע Y כדי להקצות הכל באדום כחלקיק ארעי סידן פעיל בנקודת הסף שנקבעה. לשמירת הנתונים כקובץ חלקיקים מבוסס קואורדינטות לחצו לחיצה ימנית כדי לגשת ל-STK 3D, שמרו אפס חלקיקים ולחצו שמאלה לשמירת הקובץ.

כדי ליצור מפות חום של פעילות חלקיקים, פתח את קובץ החלקיקים שנשמר ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון הסרט כדי לגשת לחלקיקים STKops, דגל StatMap והזן הקצאות דגל לניתוח. לחץ כדי להחיל את הניתוח ומפת חום המציגה את כל החלקיקים לכל אורך ההקלטה עם צבעים שונים המייצגים את מופע האחוזים לאורך ההקלטה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לשמור את מפת החום כקובץ TIFF.

לאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון הסרט כדי לגשת למדידת חלקיקים, סטטיסטיקת החלקיקים STK שווה והזן הקצאת דגל עבור הניתוח. סידרה של עקבות תיווצר בחלון המעקב. ניתוח STM מספק את היכולת לנטר ולתרשם את המאפיינים המרחביים של איתות סידן, כגון התפשטות מרחבית ומהירות התפשטות.

מידע זה יכול להיות צבר כדי לספק תצוגה מלאה למדי של התנהגויות איתות סידן בתוך תאים בסביבות המקומיות שלהם. באמצעות ניתוח חלקיקים, מידע כמותי על איתות סידן יכול להיות מחושב על ידי מדידת אזור החלקיק ואת ספירת החלקיק, אשר יחד ניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את הטווחים המרחביים של הפעלת אות סידן בתוך שדה תצוגה מסוים. ניתוח חלקיקים מאפשר גם כימות מעמיק של איתות סידן תת-תאי באמצעות בדיקת המיקום והסתברויות הירי של אתרי ירי סידן.

על ידי קצתית החלקיקים לדגלים שונים בהתבסס על המאפיינים הזמניים שלהם, ניתן למפות במדויק את החלקיקים היוזם. ושפע של נתונים קשים שנרכשו על מספר אתרי החניכה, גודל האתר בפיקסלים ומיקרומטרים, ההסתברות שכל אתר חניכה יורה פעם או מספר פעמים במהלך כל אשכול סידן ארעי, ואחוז אתרי הירי שיורים במהלך כל מחזור אשכול ארעי סידן ניתן להשיג. עקביות היא המפתח להצלחה בפרוטוקול זה.

כל ערכות הנתונים וכל הסרטים חייבים להיות מטופלים בדיוק אותו הדבר כדי להבטיח תוצאות אמינות הניתנות לחזרה. הדבר נכון במיוחד כאשר עוסקים בקבצי חלקיקים. הפרוטוקולים שלנו מאפשרים אפיון עמוק של איתות סידן באתרו, ומגוון שיטות סטטיסטיות, כאשר נעשה בהן שימוש הולם, יכולות להעריך הבדלים בין מגוון פרמטרים מרחביים ותז זמניים.

טכניקות ניתוח אלה בפרוטוקול שלנו אפשרו לחוקרים לשאול ולענות על שאלות שלא ניתן היה לענות עליהן בעבר הנוגעות לקצב המעיים, והפנמה במעיים, כמו גם לשליטה העצבית בדרכי השתן התחתונות.