Name: שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: למדו שיטת חישוף פלואורסצנטית לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים באמצעות זיהוי תבניות מרחביות ב-Staphylococcus aureus. שיטה זו מאפשרת גילוי הטרוגניות באוכלוסיות חיידקיות וזיהוי מטרות חדשות לתרופות אנטיבקטריאליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אלכסנדר Horswill על המתנה של PsarAP1- tdTomato פיוז'ן, וכן קרן קרסוול לעזרה עם ניתוח cytometry זרימה. אנו מודים גם המלך אליסה לקבלת ייעוץ על ניתוח סטטיסטי. עבודה זו הייתה מומן בחלקו על ידי פרס מחקר Exploratory/התפתחותית NIH (גרנט AI123708) וקרנות הפעלה סגל כדי SRB. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, פרשנות או ההחלטה להגיש את העבודה עבור פרסום.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת ג'ורג'טאון.
1. דור של המתח כתב פלורסנט
<ol><li>לעכל את הווקטור pRB4 אינטגרטיבית הגנום ברצף עם אנזימי הגבלה EcoRI, מרק פורטנוי. הפרוטוקול של היצרן, להגדיר לילה עיכול עם מרק פורטנוי בעזרת µg 1 של pRB4 ב- 25 ° C, ולאחר מכן המשך עם העיכול השני עבור h 1 ב 37 ° C על-ידי הוספת EcoRI לתערובת התגובה. בטל האנזימים מאת המקננת ב 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
	<li>PCR להגביר את האזור הרגולציה של עניין מ- DNA גנומי (במקרה זה, זוג בסיסים ~ 350 DNA רסיס המכיל את האזור יזם thermonuclease [nuc]), שילוב 5' EcoRI הגבלת אתר ואתר 3' מרק פורטנוי ההגבלה. הרצף זיהוי מרק פורטנוי חייב להיות במסגרת עם codon translational התחלה. במחקר זה, ה-PCR בוצעה באמצעות פריימר לפנים oRB015 אמינות גבוהה DNA פולימראז בהתאם להמלצות היצרן (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') הפוכה (פריימר oRB016 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). הטמפרטורה מחזק היתה 53 ° C. לטהר את המקטע הנוצרת בעזרת ערכת ניקיון PCR ההוראות של היצרן.</li>
	<li>לעכל ובמוצר PCR עם EcoRI, מרק פורטנוי כפי שבוצע בשלב 1.1, מאתרים ומפסיקים את המקטע דנ א מתעכל לאתרים זהה של pRB4 באמצעות T4 DNA ליגאז המומלצים ע י היצרן לייצר הבונה אינטגרטיבית. להציג את התערובת מצדו לתוך החיידק ואשר לבנות רצף.</li>
	<li>Electroporate הבונה לתוך S. aureus זן RN4220 תיאר כאמור34. בקצרה, להשתמש µg 1 של פלסמיד עם 70 µL של תאים אלקטרו-מוסמך (100 Ω, 25 µF, ו- 2.3 kV) ב- B2 מרק (1% [w/v] קזאין hydrolysate, 2.5% [w/v] תמצית שמרים, 2.5% [w/v] NaCl, 0.1% [w/v] K2PO4, 0.5% [w/v] גלוקוז). בחרו ' ההתנגדות אריתרומיצין (אמר) בטמפרטורה מתירניות (30 ° C) על אגר סויה tryptic (TSA) בתוספת אריתרומיצין (5 µg מ ל-1) ו 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-גל; µg 80 מ ל-1). Transformants וכתוצאה מכך הם כחול בגלל פעילות β-galactosidase פלסמיד מקודד. הערה: העברה של ה-DNA לתוך מבודד קלינית קשה מאוד עקב מכשול הגבלה חזקה-שינוי35 לפיכך, RN4220 S. aureus שימש נמען ביניים של הבונה פיוז'ן כי זה הגבלת לקוי ולא מאוד מודולרי.</li>
	<li>העברה פלסמיד S. aureus זן USA300 עניין באמצעות אלקטרופורציה או התמרה חושית בתיווך phage36 בטמפרטורה מתירניות. בקצרה, להפיץ באופן כללי11 bacteriophage חלקיקים על המתח התורם באמצעות לוחות TSA המכיל 5 מ מ CaCl2 לילה ב 30 ° C ולאחר מכן לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר אצטט תאית. השתמש lysates כדי מגלי S. aureus זן LAC ל Emr. הערה: לאק נמצא בידוד קליניים בשימוש נרחב שנעשה בעבר Em רגיש על ידי מעבר סדרתי במדיום TSB לרפא את המתח של pUSA03 פלסמיד מקורי זה מקנה Emr 37,38.</li>
	<li>שילוב הבונה על ידי שני, אירועים רצופים רקומבינציה הומולוגית כרומוזום כפי שתואר לעיל32. ציטוקינים-חלבונים רקומביננטיים הם עמידים כלורמפניקול (ס מr) על צלחות TSA המכיל μg 5 מ ל-1 כלורמפניקול, אריתרומיצין, רגישים (Erms) וכחול עוד אין. הערה: כאשר הדבר אפשרי, מחדש מציגים הפיוז'ן מסומן לתוך USA300 ויה בתיווך phage התמרה חושית כדי למנוע הצטברות מוטציות המשויך זן מתורבת מעבר39 ואת הטמפרטורה משמרות.</li>
</ol>2. בעלי חיים זיהום: הכנה של Inoculum, זיהום סיסטמי, עיבוד רקמות
<ol><li>
הכנה של חיידקי inoculum
	<ol>
<li>פסים S. aureus זנים של עניין בידוד על אגר דם צלחות של מניה גליצרול קפוא. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 h לאשר פנוטיפים היילוד בהתבסס על היכולת שלהם lyse תאי דם אדומים (RBCs) ונקה טופס אזורים שקופים.</li>
		<li>ליזום תרבויות לילה על ידי מזריקים מושבות יחיד של כל זן 4 מ ל מרק סויה tryptic (TSB) צינורות זכוכית סטריליים. לסובב את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 h בגלגלת צינור שוכן בגובה כ זווית 70° ו- 70 סיבובים לדקה [RPM].</li>
		<li>להשתמש ספקטרופוטומטרים כדי למדוד את הצפיפות האופטית-600 nm (OD600) של התרבויות מהשלב 2.1.2. להשתמש בבסיס, אמצעי סטרילי הפניה אופטי (ריק). לדלל לתאים אלו יתר600 של 0.05 ב 25 מ של עקר Tryptic סויה מרק (TSB) נפרדים, 125 מ ל DeLong מבחנות (5:1 הבקבוק יחס נפח), דגירה תרבויות באמבט מים (עבור המתאים להעברת חום התרבויות), רועד ב 280 RPM והגדר 37 מעלות צלזיוס. הערה: צמיחה של inoculum יכולה להתבצע בדרכים שונות; אחת השיטות לגידול תאים לשלב מעריכי מוצג. בכל מקרה, חשוב באופן עקבי להשתמש באותה השיטה להכנת תאי חיסון.</li>
		<li>בבית יתר600 ~ 1, מחדש לדלל את התאים לתוך בינוני טריים ההתחלה OD600 של 0.05 כדי להבטיח שהתאים להשיג שלב מעריכי כי גורמים המצטבר במהלך הדגירה לילה שיצומצם לרמות שלב מעריכית.</li>
		<li>לקצור את התאים בשלב מעריכית (OD600 ~0.6–0.8) על ידי צריך שתוציאו ב 3000 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף את החבילות פעמיים בהיקף שווה ערך של עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS; pH 7.4).</li>
		<li>להשעות את התאים 1 x PBS (pH 7.4) כדי ריכוז של המושבה8 עונה 1 פרק 10 ויוצרים יחידות (CFUs) מ ל-1 או לפי הצורך הרצוי הניסוי. הערה: זה חשוב לקבוע את היחס בין OD600 מ"ל CFU-1 עבור כל זן של עניין מאחר שינויים תלויי-מתח של תא גודל וצורה יכולים להשפיע על מאפייני פיזור אור, ובסופו של דבר, מינון זיהום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנה של בעלי חיים, זיהום חיידקי
	<ol>
<li>חבל עכברים במשך 7 ימים בדיאטה מטוהרים לימור-93. הדיאטה מנוסחת לספק תזונה נאותה תוך צמצום רקמות אוטומטי-קרינה פלואורסצנטית הקשורה לצריכת של מרכיבים על בסיס צמחי בשימוש בעכבר רגיל צ'או40. הערה: C57/BL6 הנשי עכברים (בן 6-8 שבועות) משמשים כאן, אבל העכבר זן ומין תלויות המחקר.</li>
		<li>לפני ההדבקה, להתרחב ורידים זנב העכבר עם מים פושרים.</li>
		<li>להדביק בעלי חיים על ידי שהזרקת µL 100 של inoculum חיידקי דרך הזנב-ורידים לייצר זיהום מערכתי. לשמור על aliquot של inoculum הראשונית אם ביצוע cytometry זרימה (ראה סעיף 4).</li>
		<li>יפקח חיות מדי יום ולהעריך את מצב הבריאות שלהם באמצעות מערכת ניטור נבדקו ואושרו על-ידי אחד אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש.</li>
		<li>לאפשר הזיהום על התקדמות עבור משך הזמן הרצוי. . הנה, הניסויים הם הסתיים 3 ימים לאחר הפגיעה. הערה: בתנאים אלה, מורסות מורכבות של קהילה האבצס staphylococcal של חיידקים, המוקפים משקעי פיברין, ומוקף שכבות קונצנטריות של תאים חיסוניים5,41.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קצירת איברים ועיבוד רקמה
	<ol>
<li>המתת חסד החיות על ידי שאיפת2 CO נקע בצוואר הרחם כשיטה משנית ולבצע necropsy.</li>
		<li>הקציר כליות (מימין) ואיברים חיוניים אחרים (לב, כבד, ריאות, טחול), להעביר לתוך צינורות פוליפרופילן 15 מ"ל, המכיל 10% [וי/v] buffered פורמלין. להמשיך עם האיברים האלה לצעוד 2.3.4 להלן.</li>
		<li>להעביר את הכליה השמאלית צינור באימפקט mL 2 סטרילי המכיל ~ 500 µL של חרוזים סיליקה 2 מ מ, PBS עקר 1 x 1 מ"ל (pH 7.4). המשך עם איבר זה לשלב 4.2.</li>
		<li>לאפשר איברים מ שלב 2.3.2 לתקן בחושך בטמפרטורת החדר עם טלטולים עדינים או רוטציה לפחות 24 שעות אך לא יותר מ- 48 שעות.</li>
		<li>להטביע את האיברים ברקמת ברור קפוא בינוני ולאחסן את הרקמות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>באמצעות a cryostat, בסעיף רקמות לפרוסות של עובי 10 מיקרומטר.</li>
		<li>יבש הסעיפים בשקופית זכוכית נקי מראש, טעונה כעשרים דקות בחשכה, להחיל בינוני קשה הרכבה עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) הכתם, ולהחיל coverslip. לרפא את השקופית הממוסגרת בטמפרטורת החדר למשך הלילה, ולהעביר עד 4 ° C לאחסון לטווח ארוך.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית ועיבוד תמונה לייזר
<ol><li>בדוק השקופית הממוסגרת לאיתור נגעים באמצעות לייזרים המתאים עבור הכתבת פלורסנט בשימוש. התיק הזה, ירוק (GFP), אדום (tdTomato), וכן כחול קרינה פלואורסצנטית (דאפי) משמשים אותות.</li>
	<li>לרכוש את התמונה באמצעות המטרה המתאימה ליצירת אפקטים של תאים בודדים (למשל, בדרך כלל 20 x או 40 מטרות x משמשות).</li>
	<li>
למדוד עוצמות קרינה פלואורסצנטית של תמונות קונפוקלי.
	<ol>
<li>פתחו את התמונה קונאפוקלית ב J התמונה ולהתאים בהירות/ניגודיות כראוי להמחיש את האות זריחה של הנגע.</li>
		<li>להגדיר את האזור של עניין, ועל -ידי שימוש באפשרות קביעת סף , מציבה את הגבולות פלורסצנטיות העליון והתחתון לפי הצורך.</li>
		<li>להגדיר את centroid על-ידי בחירה אזור ← הערך הממוצע אפור ← Centroid ← להגביל לסף תחת הכרטיסיה ניתוח תמונה ג'</li>
		<li>תמצית בערך העוצמה זריחה centroid או למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע ב פגיעה נתון ליחידת שטח (עוצמת קרינה פלואורסצנטית מרושע, MFI) עבור ה-GFP ו- tdTomato. . הנה, שימשו תחומי מיקרומטר אחד2 . הערה: ניתוח השני עיוור ממזער הטיה כאשר זהותו של המדגם ידוע.</li>
		<li>התווית הנתונים ולבצע את הבדיקות הסטטיסטיות המתאימות עבור כל השוואה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. לזרום Cytometry ניתוח
<ol><li>
(אופציונלי) לקבוע ודוקטורנט של inoculum ביום של הזיהום (מתוך בסעיף 2.2.3)
	<ol>
<li>כדי µL 899 של 1 x PBS סטרילי (pH 7.4) להוסיף 100 µL של כל inoculum, 1 µL של חומצות גרעין permeant ממברנה כתם (ראה טבלה של חומרים). כפקד, הקפד לכלול דוגמה חסר הכתם חומצת גרעין.</li>
		<li>מבצע cytometry זרימה כל הדגימות. הערה: עבור הניסוי הראשון, זה שימושי לכלול פקד וקטור היחידה עבור הפיוז'ן עניין כדי לקבוע את המתח ראוי לשימוש. הפרדה ברורה בין דגימות חיוביות ושליליות הוא חיוני עבור ניתוח נתונים, המציינת את הכתב הוא מעל האות רקע.</li>
		<li>כדי לזהות את אוכלוסיית חיידקים, מגרש אירועים באמצעות חומצות גרעין כתם (ציר y) והעבירו פיזור (ציר x).</li>
		<li>לצייר דרך שער הכללה סביב אירועים שתי חומצות גרעין כתם חיובית ואת הגודל הנכון של החיידק בהתבסס על הפיזור קדמי (בין 0.5 ל 2.0 מיקרומטר עבור S. aureus). הערה: להיות קפדני בעת זיהוי אוכלוסייה זו כפי שהוא קריטי כדי לכלול אירועים בבירור בתוך הפרמטרים האלה. ודא ששער זה אינו כולל כל האירועים עבור הפקדים שלילי בתנאים אחרים. במחקר זה, בערך 70% האוכלוסייה תא פגש את דרישות אלה בניתוח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ניתוח של דגימות רקמה לאחר ההקרבה:
	<ol>
<li>המתת חסד החיות לקצור את הכליות השמאלי (ראה שלב 2.3), העברת לתוך חרוז-מכות צינורות המכיל 1 מ ל 1 x PBS סטרילי (pH 7.4), 250 µL של 2 מ מ בורוסיליקט חרוזים.</li>
		<li>לשבש את רקמות לשחרר תאים חיידקיים. כליות, להשתמש מהמגן כדי לשבש את התאים. כאן, שלוש 30 s לפרצי ב 6800 סל ד עם 1 דקות קירור תקופות על קרח רטוב בין מחזורי שימשו כדי למזער את דגימות חימום.</li>
		<li>צניפה ההריסות רקמות גדולות יותר על-ידי צריך שתוציאו ב x 250 g למשך 3 דקות ב- microcentrifuge שולחן מקורר עד 4 ° C. הערה: בדרך כלל, יש גלולה תא בתחתית הצינורית ושכבה של פסולת צפים למעלה. השכבה האמצעית מימית מכיל תאים חיידקיים.</li>
		<li>העברת 10 µL מהשכבה מימית לתוך צינור microcentrifuge mL 1.5 נקי המכיל 1 µL של חומצות גרעין כתם בשנת 989 µL ל- PBS (נפח כולל 1 מ"ל).</li>
		<li>לבצע cytometry זרימה באמצעות רכישת נתונים אותם פרמטרים של gating באשר inocula הראשוני. הערה: ספירת חיידקים תהיה נמוכה כי המדגם בעיקר מכילה פסולת רקמות. ניתן להשתמש באפשרות "שער חיים" גם אם התאים נמצאים הכתם חומצת גרעין חיובי, ממותגת גודל כאשר הנתונים נטענים לתוך היישום. זה יעזור גם כדי לנתח יותר של האירועים במטרה להקטין את גודל הקובץ. כמעט מיליון אירועים עבור דגימה נספרים, אך נחשב אירוע נוסף עשוי להיות נחוץ בהתאם לחומרת הזיהום ולגודל של רקמות מנותח.</li>
		<li>ניתוח נתונים: לקבוע מתכוון פלורסנט בעוצמה (MFI) על כל fluorophore במדגם נתון באמצעות השערים הכללה נקבע בסעיף 4.1.4. לנרמל את דגימות זרימה בתוכנת ניתוח אירוע ספירות. 10,000 ספירות הן בדרך כלל מספקות הניתוח. הערה: . זה לא נדיר למצוא דוגמאות המכילים פחות ממספר אירועים מאחר וזה תלוי סיכון היווצרות ולדלקת מורסה. שימוש בגישה זו, 500-40,000 אירועים נמצאים בדרך כלל בתוך הרקמה הנגועה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

מחלות זיהומיות חיידקים הם בעיה בריאות גדל והולך ברחבי העולם עקב הרכישה של עמידות לאנטיביוטיקה גורמים46. בגלל הסתגלות לסביבות מארח חיונית לצמיחה ההישרדות במהלך זיהום, אסטרטגיות מיקוד תוכניות ביטוי גנים המגבירים את הפתוגן כושר יוכיח שימושי רפואית. אחת מהתכניות היא ערכה של גנים נשלט על ידי מערכת דו קומפוננט SaeR/S (TCS), שהוצג בעבר כדי לשחק תפקיד חיוני התחמקות המערכת החיסונית47. SaeR/S הנגרמת על ידי מגוון של גורמים, בעיקר אלה הקשורים נויטרופילים8,<...

חיידקים להגיב לשינויים בתנאים פיזיולוגיים והשינויים במצב התזונתי של סביבתם בהבעת באופן שונה גנים הדרושים עבור הסתגלות והישרדות. למשל, פתוגנים אופורטוניסטים ליישב גוף משטחים-יחסית נמוך צפיפות, הם לעתים קרובות לא מזיק. עם זאת, ברגע החיידק חודר חסמים הכימי והפיסי, זה חייב להתמודד עם המארח תא החיסון הגנות נגד וזמינות מזון מוגבלת1. לדוגמה, Staphylococcus aureus והצנרות בערך שליש מאוכלוסיית asymptomatically אבל הוא גם הגורם של העור הרסנית, רקמות רכות זיהומים, דלקת עצם מוגלתית, דלקת פנים הלב, בקטרמיה2. ההצלחה של S. aureus כמו. חיידק מיוחס לעתים קרובות את הגמישות מטבולית שלה, כמו גם ארסנל של גורמים הקשורים השטח, המופרש התקפה אלימה המאפשרים החיידק להימלט למחזור הדם. וישכפלו ברקמות היקפיים 3,4,5. כי המארח למוות בשל מחלת staphylococcal היא אבולוציונית מבוי סתום ו לתחום השידור מארחים החדש6, המחויבות התקפה אלימה גורם הייצור חייב להיות נשלט היטב.
רשת רגולטוריות מורכבות של חלבונים ללא קידוד RNAs מגיב מגוון רחב של גירויים סביבתיים, לרבות תא צפיפות, שלב הצמיחה, גורמים הקשורים נויטרופילים וזמינות חומר מזין, כדי להבטיח כי התקפה אלימה גנים מבוטאים זמן מדויק ובמיקום מארח רקמות7,8,9,10,11,12,13. למשל, מערכת דו קומפוננט SaeR/S (TCS) מסדיר ביטוי של מספר גורמים התקפה אלימה באמצעות את חיישן קינאז (SaeS), הרגולטור (SaeR) בתגובה14. SaeS הוא autophosphorylated על משקע היסטידין שנשמרת בתגובה מארח אותות (למשל, האנושי נויטרופילים פפטידים [HNPs], calprotectin)8,15,16. קבוצת phosphoryl הוא הועבר לאחר מכן שאריות אספרטט על SaeR, הפיכתו כמו חלבון ה-DNA מחייב (SaeR ~ P)17. TCS SaeR/S מסדיר מעל 20 גנים לתרום בפתוגנזה כולל fibronectin מחייב חלבונים (FnBPs), leukocidins ו coagulase14,18,19,20. ניתן לסווג מטרות יעדים ג'ין גבוה-זיקה ואהדה נמוכה, אשר צפויים המושרה ככל שרמת SaeR ~ P עולה כאשר הם נחשפים רמזים שלה21. הפעילות SaeR/S נשלטת על ידי הרגולטורים אחרים של ביטוי גנים כגון מערכת חישה quorum Agr, מדכא. שבולם רעלים חלבון (רוט), את פקטור סיגמה חלופה ב' (SigB)22,23,24.
nuc ג'ין התקפה אלימה Sae תלוית ב Staphylococcus aureus ו מקודד thermonuclease (Nuc), אשר חיוני עבור בריחה מן neutrophilic extracellular tראפ (רשתות), הפצת במהלך קורס של זיהום25,26. הביטוי של nuc גם בחום עקיף מודחקים מאת CodY בנוכחות חומצות אמינו מסועפות שרשרת ו GTP27, מודחקים ישירות על ידי החלבון staphylococcal הרגולטור אביזר שרה28,29 , שפעילותם היא מושפעת חמצן (מצב חמצון-חיזור) ו- pH30. בהתחשב בכך sae ו- nuc המוטציות הן הקלוש במודלים של העכבר של זיהום, יש עניין בפיתוח התערבויות כימי המעכבות שלהם26,המקביל פעילויות31. למרות זאת, אין מידע שלהם מנשר במהלך זיהום.
כתבים פלורסנט שימשו כדי לפקח ולכמת ביטוי גנים ברמה תא בודד. במסמך זה, אנו מציגים שיטה לכימות S. aureus ביטוי גנים במהלך זיהום זה, כאשר יחד עם transcriptome הפרייה analysis, טכניקות הדמיה חזקה כמו הדמיית תהודה מגנטית (MRI) וספקטרוסקופיה תהודה מגנטית (MRS), יכול לחשוף כמה חיידקים פיזיולוגיה מוסדר vivo, את abundances היחסית של חומרים מזינים בתוך נישות מסוימות. השיטה ניתן ליישם כל פתוגן חיידקי עם מערכת גנטית צייתן.
סקירה של הווקטור אינטגרטיבית הגנום.
PRB4 וקטור אינטגרטיבית הגנום מכיל 500 בסיסים כל אחד מהאזורים ויוצאת של פסאודוגן S. aureus USA300 SAUSA300_0087 כדי להקל על רקומבינציה הומולוגית. pRB4 נגזרת עמוד השדרה וקטור הרגיש pMAD המכילות את קלטת ההתנגדות אריתרומיצין (ermC) ואת הגן ביתא thermostable-galactosidase bgaB להקרנה כחול/לבן של ציטוקינים-חלבונים רקומביננטיים32. הבונה כתב מהונדס מכיל גם סמן ההתנגדות כלורמפניקול (חתול) לבחירה לאחר הגנום אינטגרציה פלסמיד חיסול, כמו גם אתרי EcoRI ולא מרק פורטנוי שתתיך האזור רגולטוריות לעניין superfolder ירוק חלבון פלואורסצנטי (sGFP) (איור 1). ידוע כי הבחירה של אתר קישור הריבוזום (RBS) משפיע על הפעילות של הכתב, לעיתים קרובות דורש אופטימיזציה אמפירי33. לפיכך, ה-RBS לא מסופק. כאן, באתר איגוד של ריבוזום יליד משמש כדי לספק עבור תבנית יותר טבעי של ביטוי גנים, אך באתרים אחרים עשוי לשמש.

<table><tbody><tr><td>5% דם כבשים</td><td>Hardy Diagnostics (סנטה מריה, קליפורניה)</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td><td>ThermoScientific</td><td>R0402</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 עכברים</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C-0378</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>cryostat microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Culture, Cap</td><td>VWR International</td><td>2005-02512</td><td></td></tr><tr><td>D+2:25NA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies (קורלוויל, איווה)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ligase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>אריתרומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E5389</td><td></td></tr><tr><td>מנתח זרימה</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית</td><td>סיגמא</td><td>Z273627</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep, פלסמיד</td><td>Promega</td><td>A1220</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים רועד מסלולי</td><td>ניו ברונסוויק Innova</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>טיהור PCR</td><td>QIagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלח (PBS)</td><td>Cellgrow</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>Tecan</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 הומוגנייזר</td><td>מעבדות ברטין</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>pUC57-Kan</td><td>GenScript (פיסקאטאווי, ניו ג'רזי)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Taq DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס (איפסוויץ', MA)</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>אנזימי הגבלה חדשים</td><td> אנגליה ביולאבס (איפסוויץ', מסצ'וסטס</td>)<td>R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).</td><td></td></tr><tr><td>טרנסקריפטאז הפוך</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>E6300L</td><td></td></tr><tr><td>Sanger Sequericing</td><td>Genewiz (Germantown, MD)</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sub Xero מדיום הקפאת רקמות שקופות</td><td>מרצדס מדיקל</td><td>MER5000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>סופרלופ</td><td>GE Lifesciences</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>מזרק, מסנן</td><td>VWR International</td><td>28145-481</td><td></td></tr><tr><td>Syto 40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11351</td><td>כתם חומצת גרעין ממברנה</td></tr><tr><td>טטרציקלין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>מרק סויה טריפטי</td><td>VWR</td><td>90000-376</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר גלוי UV</td><td>בקמן קולטר-DU350</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה Vectashield Antifade עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

התקפה אלימה חיידקי גנים מוסדרים לעתים קרובות באותה רמת תעתיק על ידי גורמים רבים מגיבים לאותות סביבתיים שונים. כמה גורמים פועלים ישירות על גנים התקפה אלימה; שאחרים שולטים פתוגנזה על-ידי התאמת הביטוי של הרגולטורים במורד הזרם או ההצטברות של הסימנים שמשפיעים מווסת פעילות. אמנם תקנה נחקרה בהרחבה במהלך צמיחה במבחנה , יחסית מעט מאוד ידוע על מה גנים מותאמת במהלך זיהום. מידע זה חשוב כאשר מוצר גן מסוים הוא מועמד התערבות טיפולית. תעתיק גישות כמו RT-PCR כמותי, בזמן אמת, RNA-Seq דרכים רב עוצמה כדי לבדוק ביטוי של גנים ברמה עולמית אבל סובלים אתגרים טכניים רבים כולל שפע נמוכה של RNA חיידקי לעומת מארח ה-RNA, לדוגמה השפלה על-ידי RNases. הערכת תקנה באמצעות עיתונאים פלורסנט הוא קל יחסית, יכול להיות מרובב עם חלבונים פלורסנט עם תכונות ספקטרליות ייחודי. השיטה מאפשרת ניתוח מתא בודד, ייתכן גנים ברקמות כי התערוכה מורכבת תלת מימדי physiochemical ואדריכלות מעברי צבע המשפיעות על רשתות בקרה רגולטריות חיידקי. מידע אובד כאשר הנתונים הם בממוצע באוכלוסייה בצובר. במסמך זה, אנו מתארים שיטה לכימות ביטוי גנים ב פתוגנים חיידקיים בתוך באתרו. השיטה מבוססת על עיבוד רקמות פשוטה וצפייה ישירה פלורסצנטיות מן הכתב חלבונים. נדגים את התועלת של מערכת זו על ידי בחינת הביטוי של Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), אשר המוצר ג'ין הוא הדרושים לשם התחמקות המערכת החיסונית שיתואר ex-vivo ו ויוו. אנחנו מראים את nuc-gfp מתבטא בחריפות מורסות כליות לחשוף ביטוי גנים הטרוגניות עקב בחלקו לכאורה תקנה מרחבי הפעילות יזם nuc אבצס מעורבת לגמרי עם התגובה החיסונית. השיטה ניתן ליישם כל חיידק עם מערכת גנטית manipulatable, כל דגם זיהום, מתן מידע יקר ערך עבור מחקרים פרה פיתוח תרופות.

פיתחנו על פלסמיד נגזר pMAD32 שיכולים לספק שום כתב פיוז'ן לבנות לתוך הכרומוזום מאת רקומבינציה הומולוגית מוצלב כפול (איור 1). מבנה זה מאפשר ניתוח כמותי בכל אזור רגולטורית שתומכת הייצור של חלבון ה-GFP ושידור פלורסנט מעל הרקע. פלסמיד מקנה עמידות אמפיצילין (Apr) עבור תחזוקה והתפשטות ב e. coli ו מקנה עמידות אריתרומיצין (אמר) ב- S. aureus. הבונה גם מקנה כלורמפניקול ההתנגדות (ס מr), אשר מאפשר ...

המתוארים כאן היא שיטה לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים ברמה התאית. שיטה זו מספקת משאב ללמוד את הגיוון פנוטיפי המתרחשים בתוך אוכלוסיה חיידקי בתגובה הסביבה רקמות במהלך זיהום.

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

שיטה זו יכולה לחשוף דפוסים מרחביים של ביטוי גנים חיידקיים ואסטרטגיות להסתגלות פיזיולוגית לארח מיקרו-סביבות רקמות שאבדו כאשר ממוצע על פני האוכלוסייה כולה ברקמות. עם טכניקה זו ניתן לזהות הטרוגניות פוטנציאליות שיש לשקול בעת זיהוי מסלולים וחלבונים חיידקיים חדשים להיות ממוקדים על ידי אנטי ויראליות או תרכובות אנטיבקטריאליות. התחל על ידי פסים S.aureus זנים של עניין על צלחות אגר דם ממלאי גליצרול קפוא דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 24 שעות כדי לאשר פנוטיפים המופוליטיים שלהם מבוסס על היכולת שלהם lyse תאי דם אדומים ו ליצור אזורים שקופים ברורים.לחסן מושבה אחת מבודדת של כל זן בארבעה מיליליטר של מרק סויה טריפטי, או TSB, בצינורות זכוכית סטריליים ולסובב את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 24 שעות בגלגל צינור בזווית של כ 70 מעלות ו 70 סיבובים לדקה. למחרת בבוקר למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר, או OD 600, של התרבויות על ספקטרופוטומטר ולדלל את התאים OD 600 של 0.05 ב 25 מיליליטר של TSB סטרילי בבקבוקון אחד יחס נפח ב 125 מיליליטר דלונג פתיתים. הדגירה את התרבויות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ב 280 סיבובים לדקה לקצור את התאים במהלך השלב המעריכי.גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את התאים פעמיים בנפח שווה של PBS סטרילי. ואז להשתמש שוב את התאים PBS טריים לתוך פעם אחת 10 למושבה השמינית להרכיב יחידות לריכוז מיליליטר עבור הזריקה הבאה שלהם לתוך בעל חיים נמען. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, לקצור את הכליה, הלב, הכבד, הריאות והטחול לתוך 15 צינורות פוליפרופילן מיליליטר המכילים פורמלין 10% חציצה עבור דגירה 24 עד 48 שעות בחושך בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין או סיבוב.בסוף קיבעון, להטמיע את האיברים ברקמות ברורות הקפאת בינוני לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש cryostat לרכוש 10 מקטעי רקמה עבה מיקרומטר ולייבש את החלקים על שקופיות זכוכית טעון מראש בודדים במשך 20 דקות בחושך לפני החלת מדיום הרכבה קשה בתוספת DAPI. לאחר מכן להחיל תלושי כיסוי לרפא את השקופיות בטמפרטורת החדר לילה לפני העברת הדגימות לאחסון לטווח ארוך בארבע מעלות צלזיוס.כדי לזהות נגעים בתוך הדגימות, מקם שקופית על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר ולהשתמש במטרה מתאימה להדמיית תאים בודדים כדי לרכוש תמונות של נגעים. כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בתוך התמונות הקונפוקליות, פתח תמונה ב- ImageJ והתאם את הבהירות והניגודיות כדי לדמיין כראוי את אות הפלואורסצנטיות של הנגע. הגדר את אזור העניין באמצעות הכלי בחירות מצולע והוסף את ה- ROI למנהל ההשקעות תחת הכרטיסיה עריכה ב- ImageJ.בחר ערוך ולאחר מכן בחר באפשרות בחירה ולבסוף הוסף למנהל. לאחר מכן, שנה את שם ה-ROI ותייג את התמונה המתאימה. כדי להגדיר את ה- centroid, פתח את הכרטיסיה נתח ובחר אזור, ערך אפור ממוצע, Centroid ו הגבל לסף.יש לחלץ את ערך עוצמת הפלואורסצנטיות של המרכז או למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת בנגע נתון ליחידת שטח. ניתן להשיג זאת באמצעות פונקציית הסף כדי להגדיר את גבולות הפלואורסצנטיות התחתונה והעליונה לפי הצורך. יצא את הנתונים לקובץ Excel והכן עמודה המציינת את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לכל אזור יחידה עבור הפריפריה והליבה.כדי לחשב את התעצמות הפלואורסצנטיות הממוצעת לכל אזור יחידה בפריפריה וליבה, הגדר ידנית את הגבולות העליונים והתחתונים של סף. סטפילוקוקוס aureus thermonuclease פלואורסצנטיות היתוך GFP הוא בממוצע כמעט פי תשעה גבוה יותר בתאים הנושאים את גן ההיתוך מאשר בתאים שאינם נושאים את היתוך הכתב. באופן דומה, פלואורסצנטיות היתוך עגבניות טנדם דימרי גבוה בערך פי שישה משליטת הכתב האפס.הדפוס של פעילויות הכתב יכול להיות מאושר על ידי ציטומטריה זרימה עם הומוגניטים רקמה. למרות ההבדלים לקפל פלואורסצנטיות הם בדרך כלל נמוכים יותר. וריאציות במדידות הפלואורסצנטיות יכולות להיות נובעות מביטוי הטרוגני של הכתבים.לדוגמה, בדגימות מייצגות אלה נצפתה כי כמה נגעים הביעו אחד או שני הכתבים בתוך כ 100 מיקרומטרים של מרחק באותה דגימת רקמה. בחינת פעילות הכתב לרזולוציית תא יחיד בקהילות abcess staphylococcal מגלה ויסות מרחבי של סטפילוקוקוס aureus thermonuclease ביטוי במורסות מוגבל עם כתמי DAPI חזקים, ככל הנראה הקשורים היווצרות ושחרור של מלכודות נויטרופילים חוץ תאיים. לדוגמה, סטפילוקוקוס aureus thermonuclease GFP פלואורסצנטיות היתוך נצפתה בליבה הפנימית של הקהילה abcess staphylococcal בהשוואה מקומית לפריפריה.באותה abcess, הדפוס של פלואורסצנטיות היתוך עגבניות עמומות טנדם נראה הפוך. עם זאת, הדפוס בניסוי זה לא היה מובהק סטטיסטית. השגת ניתוחים מוטבעים קריו שלמים חיונית לניתוח התמונה הפלואורסצנטית ויש לעשות זאת בזהירות.מיון תאי החיידקים ללכידת תת-אוכלוסיות המבטאת את ההיתוך בהיקפים משתנים, יחד עם ניתוח RNA-Seq, יכול להאיר שינויים רחבים בגנום בתעתיק. יש לדאוג בעת עבודה עם פורמלין כפי שהוא מסרטן עלול לגרום לגירוי בעור, תגובות אלרגיות, או נזק לעיניים על חשיפה ישירה. יצירת נגזרות מוטנטיות של זנים הנושאים כתבים פלואורסצנטיים מעניינים יכולה לעזור לחשוף את הבסיס הגנטי לדפוסי הרגולציה המרחבית שנצפו.

a-fluorescence-based-method-to-study-bacterial-gene-regulation

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

שיטות הדמיה של פליטת אור זיהומים חיידקיים בבעלי חיים החיים המתוארים. פתוגנים הם שונה להביע בלוציפראז הדמיה אופטית המאפשרת לגוף שלם של זיהומים בבעלי חיים. במודלים של בעלי חיים יכול להיות נגוע פתוגנים להביע בלוציפראז ואת כמובן כתוצאה של המחלה דמיינו בזמן אמת על ידי הדמיה פליטת אור.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

מאמר זה מתאר את הממשל...

הדמיה בקטריאלי bioluminescent<em&gt; In Vivo</em

מקור: בהרה, ר. ק. ואחרים. שיטה מבוססת פלואורסצנציה לחקר ויסות גנים של חיידקים ברקמות נגועות. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים שיטה להכנת רקמת כליה נגועה בעכברים, צביעת DNA וזיהוי ביטוי גנים של חיידקים באמצעות דיווחים פלואורסצנטיים כפולים. אדום מסמן את כל החיידקים, והירוק מדגיש תאים המגיבים לזיהום.

הדמיית פלואורסצנציה של קולוניזציה חיידקית ברקמת כליה בעכברים

סרטון זה מדגים את ההדמיה הפלואורסצנטית של אנזים הכתב (REF) לזיהוי in vivo של זיהום Mycobacterium tuberculosis. העכברים הנגועים מוזרקים תוך צפקית עם מצע להדמיית REF. עם הידרוליזה על ידי אנזים חיידקי β-לקטמאז, המצע פולט פלואורסצנטיות, אשר זיהויה מסייע להערכת זיהום.

כתב הדמיית אנזים פלואורסצנטי למעקב In Vivo אחר זיהום חיידקי

מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח.

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

תפקידו של מבחר (הפרדה מרחבית) בתרחישים האבולוציונית ניתן לבדוק באמצעות מערכות חיידקים פשוטה במעבדה המאפשרים נשלט התאמת הפריסה המרחבית. על ידי שינוי צפיפות התאים המייסדים, רמות מבחר שונות ניתן מדמיינות באמצעות זני חיידקים שכותרתו fluorescently ב biofilms המושבה של Bacillus subtilis.

ניטור מרחבי הפרדה Surface מיישבים אוכלוסיות מיקרוביאליות

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור את הדינמיקה לוקליזציה של חלבון subcellular ולנטר שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה ב subtilis מקרתגו ו סטיילוולוקוקוס.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

פלואור שתייגת אנטיביוטיקה הם כלים רבי-עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד היבטים מרובים של עמידות מיקרוביאלית. מאמר זה מתאר את הכנת אנטיביוטיקה מתויג fluorescently היישום שלהם כדי ללמוד עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. רגשים יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים של עמידות חיידקים (למשל, אפלוקס) על ידי ספקטרופוטומטר, זרימה cy try, ו מיקרוסקופ.

ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

פרוטוקול הדמיה זה של תאים חיידקיים חיים מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים מרובים ברמת תא יחיד לאורך זמן. הדמיה של זמן-לשגות מאפשרת להתבוננות של כל מין חיידקי במונוקולטורה או coculture לחקור אינטראקציות בין מינים בקהילות חיידקים מרובי מינים, כולל תנוענות תאים בודדים וכדאיות.

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

במאמר זה אנו מתארים הליך המאפשר זיהוי כלל איברי של חיידקים פתוגניים במהלך ההדבקה וכימות של פעילות המדווח הפלואורסצנטי.

טומוגרפיה תלת-ממדית תלת-ממדית של איברים שלמים ברזולוציה גבוהה של זיהומים מיקרוביאליים

למדו שיטת חישוף פלואורסצנטית לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים באמצעות זיהוי תבניות מרחביות ב-Staphylococcus aureus. שיטה זו מאפשרת גילוי הטרוגניות באוכלוסיות חיידקיות וזיהוי מטרות חדשות לתרופות אנטיבקטריאליות.

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

גלה סרטונים נוספים