שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

שיטה זו יכולה לחשוף דפוסים מרחביים של ביטוי גנים חיידקיים ואסטרטגיות להסתגלות פיזיולוגית לארח מיקרו-סביבות רקמות שאבדו כאשר ממוצע על פני האוכלוסייה כולה ברקמות. עם טכניקה זו ניתן לזהות הטרוגניות פוטנציאליות שיש לשקול בעת זיהוי מסלולים וחלבונים חיידקיים חדשים להיות ממוקדים על ידי אנטי ויראליות או תרכובות אנטיבקטריאליות. התחל על ידי פסים S.aureus זנים של עניין על צלחות אגר דם ממלאי גליצרול קפוא דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 24 שעות כדי לאשר פנוטיפים המופוליטיים שלהם מבוסס על היכולת שלהם lyse תאי דם אדומים ו ליצור אזורים שקופים ברורים.

לחסן מושבה אחת מבודדת של כל זן בארבעה מיליליטר של מרק סויה טריפטי, או TSB, בצינורות זכוכית סטריליים ולסובב את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 24 שעות בגלגל צינור בזווית של כ 70 מעלות ו 70 סיבובים לדקה. למחרת בבוקר למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר, או OD 600, של התרבויות על ספקטרופוטומטר ולדלל את התאים OD 600 של 0.05 ב 25 מיליליטר של TSB סטרילי בבקבוקון אחד יחס נפח ב 125 מיליליטר דלונג פתיתים. הדגירה את התרבויות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ב 280 סיבובים לדקה לקצור את התאים במהלך השלב המעריכי.

גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את התאים פעמיים בנפח שווה של PBS סטרילי. ואז להשתמש שוב את התאים PBS טריים לתוך פעם אחת 10 למושבה השמינית להרכיב יחידות לריכוז מיליליטר עבור הזריקה הבאה שלהם לתוך בעל חיים נמען. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, לקצור את הכליה, הלב, הכבד, הריאות והטחול לתוך 15 צינורות פוליפרופילן מיליליטר המכילים פורמלין 10% חציצה עבור דגירה 24 עד 48 שעות בחושך בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין או סיבוב.

בסוף קיבעון, להטמיע את האיברים ברקמות ברורות הקפאת בינוני לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש cryostat לרכוש 10 מקטעי רקמה עבה מיקרומטר ולייבש את החלקים על שקופיות זכוכית טעון מראש בודדים במשך 20 דקות בחושך לפני החלת מדיום הרכבה קשה בתוספת DAPI. לאחר מכן להחיל תלושי כיסוי לרפא את השקופיות בטמפרטורת החדר לילה לפני העברת הדגימות לאחסון לטווח ארוך בארבע מעלות צלזיוס.

כדי לזהות נגעים בתוך הדגימות, מקם שקופית על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר ולהשתמש במטרה מתאימה להדמיית תאים בודדים כדי לרכוש תמונות של נגעים. כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בתוך התמונות הקונפוקליות, פתח תמונה ב- ImageJ והתאם את הבהירות והניגודיות כדי לדמיין כראוי את אות הפלואורסצנטיות של הנגע. הגדר את אזור העניין באמצעות הכלי בחירות מצולע והוסף את ה- ROI למנהל ההשקעות תחת הכרטיסיה עריכה ב- ImageJ.

בחר ערוך ולאחר מכן בחר באפשרות בחירה ולבסוף הוסף למנהל. לאחר מכן, שנה את שם ה-ROI ותייג את התמונה המתאימה. כדי להגדיר את ה- centroid, פתח את הכרטיסיה נתח ובחר אזור, ערך אפור ממוצע, Centroid ו הגבל לסף.

יש לחלץ את ערך עוצמת הפלואורסצנטיות של המרכז או למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת בנגע נתון ליחידת שטח. ניתן להשיג זאת באמצעות פונקציית הסף כדי להגדיר את גבולות הפלואורסצנטיות התחתונה והעליונה לפי הצורך. יצא את הנתונים לקובץ Excel והכן עמודה המציינת את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לכל אזור יחידה עבור הפריפריה והליבה.

כדי לחשב את התעצמות הפלואורסצנטיות הממוצעת לכל אזור יחידה בפריפריה וליבה, הגדר ידנית את הגבולות העליונים והתחתונים של סף. סטפילוקוקוס aureus thermonuclease פלואורסצנטיות היתוך GFP הוא בממוצע כמעט פי תשעה גבוה יותר בתאים הנושאים את גן ההיתוך מאשר בתאים שאינם נושאים את היתוך הכתב. באופן דומה, פלואורסצנטיות היתוך עגבניות טנדם דימרי גבוה בערך פי שישה משליטת הכתב האפס.

הדפוס של פעילויות הכתב יכול להיות מאושר על ידי ציטומטריה זרימה עם הומוגניטים רקמה. למרות ההבדלים לקפל פלואורסצנטיות הם בדרך כלל נמוכים יותר. וריאציות במדידות הפלואורסצנטיות יכולות להיות נובעות מביטוי הטרוגני של הכתבים.

לדוגמה, בדגימות מייצגות אלה נצפתה כי כמה נגעים הביעו אחד או שני הכתבים בתוך כ 100 מיקרומטרים של מרחק באותה דגימת רקמה. בחינת פעילות הכתב לרזולוציית תא יחיד בקהילות abcess staphylococcal מגלה ויסות מרחבי של סטפילוקוקוס aureus thermonuclease ביטוי במורסות מוגבל עם כתמי DAPI חזקים, ככל הנראה הקשורים היווצרות ושחרור של מלכודות נויטרופילים חוץ תאיים. לדוגמה, סטפילוקוקוס aureus thermonuclease GFP פלואורסצנטיות היתוך נצפתה בליבה הפנימית של הקהילה abcess staphylococcal בהשוואה מקומית לפריפריה.

באותה abcess, הדפוס של פלואורסצנטיות היתוך עגבניות עמומות טנדם נראה הפוך. עם זאת, הדפוס בניסוי זה לא היה מובהק סטטיסטית. השגת ניתוחים מוטבעים קריו שלמים חיונית לניתוח התמונה הפלואורסצנטית ויש לעשות זאת בזהירות.

מיון תאי החיידקים ללכידת תת-אוכלוסיות המבטאת את ההיתוך בהיקפים משתנים, יחד עם ניתוח RNA-Seq, יכול להאיר שינויים רחבים בגנום בתעתיק. יש לדאוג בעת עבודה עם פורמלין כפי שהוא מסרטן עלול לגרום לגירוי בעור, תגובות אלרגיות, או נזק לעיניים על חשיפה ישירה. יצירת נגזרות מוטנטיות של זנים הנושאים כתבים פלואורסצנטיים מעניינים יכולה לעזור לחשוף את הבסיס הגנטי לדפוסי הרגולציה המרחבית שנצפו.