Name: תפוקה גבוהה Siderophore הקרנה מדגימות סביבתי: צמח רקמות תפזורת קרקעות, Rhizosphere קרקעות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: חקור שיטת סקר מהירה לבחינת פעילות סידרופורים בדגימות קרקע וצמחים. הפרוטוקול מאפשר הערכת זמינות ברזל ובריאות הקרקע באמצעות קהילות מיקרוביאליות שלמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות Muhunthan קאליאני לסיוע תהליכי מעבדה, Opdahl לי על חיטה גנוטיפ קציר, המועצה למחקר עינב מדינת וושינגטון ו המרכז האוניברסיטאי של מדינת וושינגטון לחקלאות הסדירה ו משאבים טבעיים עבור BIOAg להעניק תמיכה עבודה זו. מימון נוסף סופק על ידי משרד החקלאות/NIFA דרך פתח פרוייקט 1014527.

הערה: המיקום של אתר שדה: אוניברסיטת מדינת וושינגטון, צמח פתולוגיה החווה (46 ° 46'38.0 "N 117 ° 04'57.4" W). הזרעים נזרעו באמצעות עציץ מכני על אוקטובר 19, 2017. גנוטיפ חיטה כל ניטע ב- headrows, כ 1 מטר אחד מהשני כדי למנוע חפיפה של מערכת השורשים. צמח וקרקע נאספו ב אוגוסט 9, 2018, כאשר הצמחים היו מוכנים לקציר. הדגימות היו נאספים משכפל שלושה של ארבעה אחרים חיטה: PI561727, PI561725, מדסן, Lewjain.
1. הכנת ששונה M9 בינוני
<ol><li>שימוש נה2PO4∙7H2O (12.8 g/200 מ"ל), ח'2PO4 (0.3 g של 200 מ"ל), NaCl (0.5 ג'י של 200 מ"ל), NH4ריאגנטים קלרנית (1 g של 20 מ"ל) כדי להכין את תמיסת מלח M9.</li>
	<li>השתמש 18 גרם MgSO4∙7H2O ב- 100 מ של מים יונים כפול (ddH2O) כדי להכין 0.75 מ' MgSO4∙7H2O.</li>
	<li>להפוך 1 מ' של ∙2H2CaCl2O על-ידי הוספת 14.7 גרם CaCl2∙2H2O עם 100 מ של ddH2O.</li>
	<li>הכינו את בופר על ידי המסת g 6.048 צינורות לתוך 156 מ של ddH2O עם ערבוב. להתאים את ה-pH ל 6.8 עם 5 M NaOH.</li>
	<li>להכין 20% גלוקוז (דקסטרוז מונוהידראט) על ידי המסת 20 גר' גלוקוז לתוך 100 מ של ddH2O.</li>
	<li>להכין פתרונות בנפרד אוטוקלב כל אך הגלוקוז. מסנן לעקר את תמיסת גלוקוז בנוסף למדיה M9 לאחר autoclaving (0.22 מיקרומטר).</li>
	<li>להכין המדיום M9 ששונה על-ידי ערבוב 156 מ של צינורות בופר, 40 מ של פתרון מלחי M9, μL 20 של פתרון2O ·2H2CaCl 266 μL של MgSO4·7H2O, מ 4 ל 20% גלוקוז פתרונות ביחד אבטחה הקבינט, באמצעות טכניקה סטרילי.</li>
	<li>לשימור M9 ששונה, לסגור את המיכל, מכסים ברדיד אלומיניום כדי להגן מפני UV, מקום ב 4 º C.</li>
</ol>2. הכנת CAS-Fe-אגר בינוני
<ol><li>חומצה לשטוף כל כלי זכוכית במ מ HCl/100 100 מ מ עב ס3 לפחות שעתיים לפני ניצול וזמינותו CAS.</li>
	<li>הכן של אלומיניום אפיה מלא בחול כיתה מעבדה, לכסות אותו ברדיד אלומיניום. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, להניח בצד.</li>
	<li>הכנת HDTMA (hexadecyltrimethylammonium ברומיד) על-ידי הוספת 0.0365 g 20 מ"ל ddH2O ולמקם את הפתרון ב 37 ° C כדי לקדם את solubilization.</li>
	<li>הכינו 10 מ מ HCl וצור 1 מ"מ FeCl3·6H2O באמצעות 10 מ מ HCl כמו הממס. להוסיף g 0.0302 של רשויות אישורים מ 25 ל- ddH2O תוך כדי לערבב בעדינות עם בר מערבבים מגנטי סטרילי. לאחר מכן הוסף 5 מ של 1 מ מ FeCl3·6H2O (ב- 10 מ מ HCl) 25 מ של רשויות אישורים פתרון תוך מערבבים בעדינות (את פתרון הופך כהה שצבעו שחור).</li>
	<li>לאט לאט להוסיף mL 20 של HDTMA פתרון תוך ערבוב בעדינות, לתוך הפתרון Fe-CAS (זה התשואות פתרון כחול כהה).</li>
	<li>הכינו את בופר על ידי המסת 15.12 גרם של צינורות לתוך 375 מ של ddH2O, עם ערבוב עדין. להתאים את ה-pH ל 6.8 עם 5 M NaOH. מוסיפים מים כדי להביא את אמצעי האחסון 450 מ. להוסיף 5 גר' agarose הפתרון. אוטוקלב הצינורות מאגר פתרון והפתרון CAS-Fe ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>להוסיף בזהירות מכלול של הפתרון CAS-Fe למכלול של המאגר צינורות ב אבטחה הקבינט, אחרי כל אחד מהם הוא בלוק.</li>
	<li>המקום הפתרון מעורב באמבט מים בטמפרטורה 50 º c הערה: להכין טרי כל ריאגנטים במדיום CAS-Fe-אגר לפני כל assay, כמו אחסון לטווח ארוך תוצאות 50 ° C בכמות המשקעים של CAS-Fe מורכבים ולאחר קירור התוצאות במדיום הקרושה.</li>
	<li>למקם את סירה ריאגנט עקר החול סטרילי אבטחה ארון חום עד 50 מעלות צלזיוס. להעביר את CAS-Fe-אגר את הסירה, אז µL 100 aliquot במהירות אל כל טוב ב microplate 96-ובכן ברור, שטוח התחתונה, סטרילי.</li>
</ol>3. Pyoverdine/EDTA הכנה רגיל
<ol><li>הכנה Pyoverdine<ol>
<li>להכין תקן pyoverdine μM 800 (תערובת של חומצה סוקסינית, 2 הידרוקסי glutaramide, וצורות succinaminde של pyoverdine – ראה טבלה של חומרים), בעבר מוכן בינוני M9 ששונה.</li>
		<li>לדלל את הפתרון הזה לתוך 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, ופתרונות μM 6.25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת תקן EDTA<ol>
<li>להוסיף 0.594 גר' ניתרן ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA: C10H14N2נה2O8.2H2O), עד 500 מ"ל של מדיום M9 ששונה בעבר מוכן להכין 3200 μM EDTA סטנדרטי.</li>
		<li>זה הפתרון מדולל לתוך 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 ופתרונות μM 6.25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דור עיקול רגיל<ol>
<li>להוסיף 100 μL של כל ריכוז של pyoverdine ו- EDTA להפרדת בארות microplate 96-ובכן המכיל 100 μL CAS-Fe אגר בינוני. להפוך כפולים שכפולי טכני של ריכוז כל. כמו כן, להוסיף בארות ריק עם רק M9 (אין EDTA או pyoverdine).</li>
		<li>שימוש בקורא microplate, למדוד את ספיגת (ב 420 ננומטר ולאחר 665 ננומטר) לאחר דגירה 1, 6 ו- 24 h-22 ° C, ומדידות שימוש ספיגת כדי ליצור עקומות סטנדרטי. הערה: עבור מדידות 420 ננומטר, לחסר ספיגת החסר מ ספיגת pyoverdine או בארות המכילה EDTA. עבור 665 ננומטר, לחסר ספיגת pyoverdine או EDTA המכיל בארות של ספיגת החסר. לאחר מכן, יומן10(מיקרומטר pyoverdine או EDTA) הוא הטיפש-נגד המדידות ספיגת. על מנת להקל על פענוח תוצאות המדגם, שתשמש את ספיגת ה-x, להיכנס10(מיקרומטר pyoverdine או EDTA) כמו ציר ה-y.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. איסוף דגימות סביבתי: רקמות אדמה
<ol><li>לשטוף את ציוד דגימה (אתים, מספריים) עם 0.22 מיקרומטר מסונן ddH2O ואחריו 70% אתנול, לנגב עם מגבות נייר לפני דגימה בין דגימות לשמור על סטרילי טכניקה ולהפחית את זיהום צולב.</li>
	<li>לסלק את רקמות הצמח (גרגרים ויורה) מצמחים בשדה, ומניחים אותם בתוך שקית אחסון מפלסטיק עם תוויות, להשאיר זיפים לירות מספיק על מנת להקל על עקירת דגימות אדמה ושורש הרצוי.</li>
	<li>חפירת של שורש קטן הכדור כ 15 ס מ עמוקה ו 23 ס מ ומניחים אותו בתוך שקית פלסטיק נפרדות, עם תוויות עבור הכנת הדוגמא בסביבת מעבדה. שלב זה דומה בשיטות של מקפירסון ואח27.</li>
	<li>במקום כל דוגמאות (גרגרים, יורה, האדמה בתפזורת ו שורש כדורי בשקיות נפרדות) ישירות על הקרח ולשמור ב 4 ° C עד דגימות יעובדו עבור וזמינותו ייצור siderophore.</li>
	<li>שורש נפרדים הקשורים דגימות. אדמה לתוך בצובר באופן רופף מכורך rhizosphere אדמה, אדמה בחוזקה מאוגד-rhizosphere.<ol>
<li>לקחת את הכדורים הבסיס מתוך התיקים. בעדינות לנער מהאדמה הכדור השורש. ניערתי מעליי באדמה, יחד עם האדמה שמאלה לתוך השקית כוללת את האדמה "בתפזורת".</li>
		<li>השתמש פטיש גומי כדי נוסף הסרת אדמה הכדור השורש. זוהי הקרקע באופן רופף מאוגד-rhizosphere.</li>
		<li>צור rhizosphere בחוזקה מכורך קרקע על-ידי לקיחת שורשים עם הדגימה בחוזקה מכורך מכניס אותם שפופרת צנטרפוגה. להוסיף 30 מ של ddH2O ו מערבולת זה ל 2-3 דקות. הסר את השורשים להשיג דילול slurry אדמת rhizosphere בחוזקה מאוגד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. הכנת siderophore העשרה תרבויות, CAS-Fe siderophore ייצור assay
הערה: כל כלי זכוכית צריך להיות חומצה נשטף לפני תחילת מבחני.
<ol><li>הכנת הדוגמא אדמה (עבור כל אחד מסוגי דגימת קרקע שלוש)<ol>
<li>Homogenize כל מדגם קרקע בתוך השקית לדוגמה, על-ידי ערבוב והפעלת הקרקע ככל האפשר מבלי לפתוח את השקית. הערה: זה מסייע להפחית את ההשתנות המרחבית קרקע טבעי, מתיישר עם אדמה רגילה דגימה הליכים. שיטות אחרות עשויים להיות מנוצל כדי homogenize דגימות איכות הסביבה, לפי הצורך, בהתאם לעיצוב הניסיונית.</li>
		<li>לאחר כל מדגם היה מעורב באופן יסודי, aliquot להשעות 2.0 g כל אדמה ב 20 מיליליטר ששונה M9 בינוני, ואז לדלל 10-3 כדי הנפח הכולל של 20 מ בשפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ עם פקק קצף סטרילי כדי לאפשר אוורור.</li>
		<li>לדוגמאות בחוזקה מכורך rhizosphere, להוסיף 2 מיליליטר slurry אדמת rhizosphere 20 מ של מדיום M9 ששונו ולאחר מכן לדלל 10-3 כדי הנפח הכולל של 20 מ בשפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ עם פקק קצף סטרילי כדי לאפשר אוורור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת הדוגמא (שורש, לירות, תבואה) רקמה<ol>
<li>משטח לעקר את הדגימה עם 70% אתנול. Macerate 2.0 גרם של רקמת טריים ב- 20 מ של מדיום M9 ששונתה באמצעות בלנדר-גבוהה למשך 30 שניות. להעביר את הדגימה שפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ ל, ואז לדלל 10-3 כדי הנפח הכולל של 20 מ בשפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ עם פקק קצף סטרילי כדי לאפשר אוורור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>העשרה של Siderophore ייצור באמצעות הגבלה Fe<ol>
<li>דגירה 50 מ ל צינורות צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ומנערים ב 160 סיבובים לדקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. CAS-Fe מבחני אגר לצורך זיהוי של siderophore ייצור בדגימות איכות הסביבה
<ol><li>בגיל 24, 48, 72 שעות לאחר התרבות העשרה, להסיר 1 מ"ל subsamples מן הצינורות העשרה באמצעות סטרילי טכניקה צנטריפוגה ב 10,000 x g דקות 1 2 mL צינורות צנטריפוגה כדי pelletize את התאים.</li>
	<li>לאסוף את תגובת שיקוע מופרדים. שימוש סטרילי טכניקה, להוסיף 100 μL של תגובת שיקוע 100 פתרון μL של רשויות אישורים-Fe-אגר כפילויות או שהפקידים ב microplate. גם להוסיף 100 µL של אמצעי M9 סטרילי (ריקים). ואז דגירה את הצלחת ב 28 º C.</li>
	<li>להשעות את תגובת שיקוע הנותרים ואת גלולה עבור כל דגימה (לא הוסיף לצלחת microtiter) לתוך צינור צנטריפוגה משלו, mL 2 סטרילי. הוסף μL 400 של גליצרול סטרילי לתוך כל שפופרת מדגם-תגובת שיקוע, resuspend בגדר כדי ליצור גליצרול מניות. להקפיא את המניה ב- 80 ° C עבור בהמשך מנתח. הערה: שלב זה יכול להיות שונה כדי ליצור גליצרול מניות לפי בכל פרוטוקול שבאתר המועדפת.</li>
	<li>למדוד ספיגת ב 6, 24, 48, 72 h, 420 באורך גל של nm.</li>
	<li>השתמש רגיל עקומות שנוצרו pyoverdine או EDTA לפרש מדגם מדידות ספיגת מבחינת pyoverdine מקבילות. הערה: Pyoverdine היה נחוש בדעתו להיות תקן מעולה בהשוואה עם EDTA (וידאו אינפרא), אז לא נעשה שימוש EDTA לפרש תוצאות במחקר הנוכחי.</li>
</ol>

<ol><li>Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore+cheating+and+cheating+resistance+shape+competition+for+iron+in+soil+and+freshwater+Pseudomonas+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Ghirardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Traits+Shared+by+Rhizosphere-Competent+Strains+of+Fluorescent+Pseudomonads%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads.</a> Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).</li>
<li>Hider, R. C., Kong, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of siderophores.</a> Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).</li>
<li>Saha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+siderophores+and+their+potential+applications%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">Microbial siderophores and their potential applications: a review.</a> Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).</li>
<li>Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+growth-promoting+rhizobacteria+%28PGPR%29%3A+emergence+in+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology%2C+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture.</a> World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).</li>
<li>Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetics%2C+Siderophore+Production%2C+and+Iron+Scavenging+Potential+of+Root+Zone+Soil+Bacteria+Isolated+from+%27Concord%27+Grape+Vineyards%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards.</a> Microbial Ecology. , Accepted (2018).</li>
<li>Li, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opportunistic+human+fungal+pathogen+Candida+albicans+promotes+the+growth+and+proliferation+of+commensal+Escherichia+coli+through+an+iron-responsive+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway.</a> Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).</li>
<li>Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity%2C+Abundance%2C+and+Localization+of+Quorum+Sensing+Receptors+in+Vibrio+harveyi%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li>
<li>O'Brien, S., Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+multispecies+social+interactions+in+shaping+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenicity+in+the+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Fems+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung.</a> Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).</li>
<li>Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cheating+on+Cheaters+Stabilizes+Cooperation+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Current Biology. 28 (13), (2018).</li>
<li>Popat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+modification+via+a+quorum+sensing+molecule+influences+the+social+landscape+of+siderophore+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).</li>
<li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li>
<li>Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore+production+of+African+dust+microorganisms+over+Trinidad+and+Tobago%5BTitle%5D)+AND+%22Aerobiologia%22%5BJournal%5D)">Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago.</a> Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).</li>
<li>Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+siderophore+aerobactin+by+a+halophilic+Pseudomonad%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad.</a> Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).</li>
<li>Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-CAS%2C+a+fast+and+universal+method+for+siderophore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).</li>
<li>Nakouti, I., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+studying+ion+uptake+by+actinomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A new approach to studying ion uptake by actinomycetes.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).</li>
<li>Wang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diisonitrile+Natural+Product+SF2768+Functions+As+a+Chalkophore+That+Mediates+Copper+Acquisition+in+Streptomyces+thioluteus%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus.</a> Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).</li>
<li>Retamal-Morales, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+arsenic-binding+siderophores+in+arsenic-tolerating+Actinobacteria+by+a+modified+CAS+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).</li>
<li>Desai, A., Archana, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDesai%2C+A+%22Role+of+Siderophores+in+Crop+Improvement%22">Role of Siderophores in Crop Improvement</a>. , (2011).</li>
<li>Dertz, E. A., Raymond, K. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDertz%2C+EA+%22Comprehensive+coordination+chemistry+II%22">Comprehensive coordination chemistry II</a>. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).</li>
<li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7, 9(2017).</li>
<li>Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+plant+and+rhizospheric+microbiota+as+stable+interactomes%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes.</a> Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).</li>
<li>Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+transcriptome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+exposed+to+beneficial+Bacillus+subtilis+FB17+rhizobacteria+revealed+genes+for+bacterial+recruitment+and+plant+defense+independent+of+malate+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux.</a> Planta. 238 (4), 657-668 (2013).</li>
<li>Sasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wheat+gene+encoding+an+aluminum-activated+malate+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.</a> The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).</li>
<li>Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+Structure%2C+Species+Variation%2C+and+Potential+Functions+of+Rhizosphere-Associated+Bacteria+of+Different+Winter+Wheat+%28Triticum+aestivum%29+Cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).</li>
<li>Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+analysis+of+sticky+chromosomes+in+aluminum+tolerant+and+susceptible+wheat+lines+grown+in+soils+of+differing+aluminum+saturation%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation.</a> Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).</li>
<li>McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Analysis+of+Microbial+Communities+in+Soil%2C+Rhizosphere%2C+and+Roots+in+Perennial+Grass+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), 57932(2018).</li>
<li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li>
<li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+siderophores%3A+from+biogenesis+to+biosignificance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li>
<li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

התוצאה העיקרית של עבודה זו הוא הייצור של מתודולוגיה חדשה זה יכול לשמש כדי להעשיר במהירות siderophore בהפקת חיידקים בעוד באופן כמותי מדידת siderophore ייצור/פעילות במדגם סביבתיים. המתודולוגיה היא מהירה, פשוטה וחסכונית, התוצאות מציגות כיצד זה יכול לשמש כדי לזהות פעילות siderophore של סוגי מדגם מורכבים ולא הרומן (למשל., אדמה וצמח רקמות). הפרוטוקול גם גורמת לייצור גליצרול מניות של התרבויות העשרה, אשר יכול בקלות לקחת בזמן כדי להכיל את המחקרים של שינויי מבנה הקהילה מיקרוביאלית ותפקוד במהלך Fe מחסור דרך ה-DNA או RNA המ...

Siderophores הם בעיקר מעורב ברזל-קלאציה הזמינות הביולוגית, אבל עם מגוון רחב של מטרות נוספות של מערכות אקולוגיות יבשתי ו הימית, החל quorum מיקרוביאלי חישה, איתות צמח חיידקים-המארחים, חשוב מולקולות קידום התפתחות הצמח, שיתוף פעולה ותחרות בתוך קהילות מיקרוביאלי מורכבים1,2. Siderophores יכולים להיות בהרחבה מסווגים לפי אתרים פעילים שלהם תכונות מבניות, יצירת מארבעה סוגים: carboxylate, hydroxamate, catecholate, מעורבבים סוגים3,4. מיקרואורגניזמים רבים מסוגלים מפריש יותר מסוג אחד של siderophore5 , בקהילות מורכבים, הרוב המכריע של אורגניזמים biosynthesize קולטני ממברנה כדי לאפשר את קליטת מגוון רחב אף יותר של siderophores1, 6. עבודה מצביע על כך siderophores הן חשוב במיוחד ברמה הקהילתית, אפילו התקשורת הבין-הממלכה, העברות biogeochemical7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol sulphonate (CA) שימש במשך למעלה מ-30 שנה בתור חומר מכלט לקשור על ברזל (Fe) בצורה כזאת, כי תוספת של ליגנדים (קרי: siderophores) יכול לגרום דיסוציאציה במתחם קסטיאל-Fe, יצירת שינוי צבע קלות לזיהוי במדיום 12. כאשר רשויות אישורים מאוגד עם Fe לצבוע מופיע בצבע כחול אדמדם, כפי dissociates המתחם CAS-Fe, המדיום משנה את צבעו בהתאם לסוג של ליגנד להתרגל לנקות את Fe13. המדיום הראשונית, בנוזל נוסדה על ידי Schwyn, Neilands בשנת 1987, שונתה בדרכים רבות כדי להכיל שינוי מטרות מיקרוביאלי14, גדילה הרגלי מגבלות15, וכן מגוון של מתכות חוץ Fe, כולל אלומיניום, מנגן, קובלט, ניקל קדמיום, ליתיום, אבץ16, נחושת17ו אפילו ארסן18.
פתוגנים אנושיים רבים, כמו גם כמו צמח צמיחה קידום מיקרואורגניזמים (PGPM) זוהו אורגניזמים לייצר siderophore3,19,20, ו rhizosphere חשוב PGPM endophytic לעיתים קרובות מבחן חיובית עבור ייצור siderophore4. מבוסס-Fe נוזלי השיטה המסורתית כבר מותאם microtiter בדיקה של מבודד בטיפוח הפקה siderophore21. עם זאת, שיטות אלה אינם מזהים את החשיבות של הקהילה מיקרוביאלי בכללותה (microbiome), בשיתוף ורגולציה פוטנציאל הייצור siderophore קרקעות, צמח מערכות22. לכן, פיתחנו הערכה הקהילה ברמת תפוקה גבוהה של siderophore הפקה של סביבה נתונה, המבוססת על וזמינותו CAS מסורתי, אבל עם שכפול, קלות מדידה, אמינות של הדיר ב- microplate וזמינותו.
במחקר זה, מוצג assay CAS-Fe חסכונית, תפוקה גבוהה לגילוי siderophore הייצור כדי להעריך את העשרת siderophore הייצור מדגימות מורכבים (קרי, אדמת וצמח רקמת homogenates). Rhizosphere בתפזורת, באופן רופף מכורך ו בחוזקה מאוגד-אדמת (מבחינת איך האדמה קשורה השורש) התקבלו יחד עם התבואה, לירות, שורש רקמות ארבעה אחרים ברורים חיטה (חיטת הלחם ל'): Lewjain, מדסן, PI561725, ו PI561727. זה היה שיערו כי יסוד הבדלים אחרים חיטה יכול לגרום הבדלים גיוס ומיון של siderophore בהפקת קהילות. עניין מיוחד הוא ההבדל בין קהילות חיידקים הקשורים עם קו isogenic PI561725, אשר אלומיניום עמיד בפני תקלות כי הוא בעל ALMT1 (מופעל אלומיניום בנויים המשלח 1), בהשוואה עם האלומיניום רגיש PI561727 isogenic קו, אשר ברשותה אלומיניום שאינם מגיבים צורה של הגן, almt123,24,25,26. המטרה הראשית של המחקר הייתה לפתח שיטה פשוטה, מהירה באופן כמותי להעריך הייצור siderophore בתרבויות העשרה siderophore של סוגי מדגם מורכבים תוך שמירה על התרבויות לעבודה עתידית.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Apex</td><td>LF451320014</td><td></td></tr><tr>תבנית <td></td><td></td><td></td><td>אפייה אלומיניום</td></tr><tr><td>רדיד</td><td></td><td></td><td></td>אלומיניום</tr><tr><td>אמוניום כלוריד, גרגירי</td><td>Fiesher Scientific</td><td>152315A</td><td></td></tr><tr><td>חיטוי וסטריליזטור</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיינטיפיק סידן כלוריד דיהידראט</td><td>Fiesher Scientific</td><td>171428</td><td></td></tr><tr><td>CAS (Chrome Azurol S)</td><td>Chem-Impex Int'l Inc)</td><td>000331-27168</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז מונוהידראט (גלוקוז), אבקה גבישית</td><td>Fiesher Scientific</td><td>1521754</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, מלח דיסודיום, דיהידרט, קריסטל</td><td>J.T.Baker</td><td>JI2476</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול, בייקר נטול מים</td><td>אנלקט</td><td>C22634</td><td></td></tr><tr><td>HDTMA (Cetyltrimethylammomonium ברומיד</td><td>ריאגנט עולם</td><td>FZ0941</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלוריד</td><td>ACROS אורגני</td><td>B0756767</td><td></td></tr><tr><td>אינסופי M200 PRO קורא צלחות</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ברזל (III) כלוריד הקסהידרט, 99%</td> <td>ACROS</td> אורגני <td>A0342179</td><td></td></tr><tr><td>מעבדה אדים אדים</td><td>תרמו מעבדה</td><td></td><td></td></tr> מדעית <tr><td>חממה</td><td>VWR מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>Fiesher Scientific</td><td>27855</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ניריקית, (69-70)%</td> <td>J.T.Baker</td><td>72287</td><td></td></tr><tr><td>PIPES buffer, 98.5%</td> <td>ACROS אורגני</td><td>A0338723</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, dibaisc, אבקה</td><td>J.T.Baker</td><td>J48594</td><td></td></tr><tr><td>Pyoverdine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>078M4094V</td><td></td></tr><tr><td>חול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SI-600R Shaker</td><td>Lab Companion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי, גרגירי</td><td>Fiesher Scientific</td><td>136539</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד, כדוריות</td><td>J.T.Baker</td><td>G48K53</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט, הפטהידרט דו-בסיסי, 99%</td> <td>ACROS אורגני</td><td>A0371705</td><td></td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה siderophore הקרנה מדגימות סביבתי: צמח רקמות תפזורת קרקעות, rhizosphere קרקעות

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (משקל נמוך-מולקולרי מתכת chelating תרכובות) חשובים שונים לתופעה אקולוגית החל ברזל (Fe) biogeochemical על אופניים בקרקעות, תחרות הפתוגן, צמח צמיחה קידום של צלב-ממלכת איתות. יתר על כן, siderophores גם הם עניין מסחרי ב- bioleaching ו- bioweathering של מינרלים, עפרות מתכת-מיסב. אמצעי מהיר, חסכוני וחזק באופן כמותי הערכת ייצור siderophore בדגימות מורכבות היא המפתח לזיהוי היבטים חשובים של ההשלכות האקולוגי של פעילות siderophore, כולל, הרומן siderophore בהפקת חיידקים. השיטה המוצגת כאן פותחה כדי להעריך את הפעילות siderophore של קהילות microbiome בטקט, בדגימות סביבתיים, כגון רקמות אדמה או צמח. הדגימות היו הומוגני, מדולל במדיום M9 ששונתה (ללא Fe), העשרה תרבויות היו הדגירה למשך 3 ימים. Siderophore ההפקה נאמד בדגימות ב 24, 48, 72 שעות (h) באמצעות microplate 96-ובכן הרומן של רשויות אישורים (כרום azurol sulphonate)-Fe אגר assay, עיבוד של השיטה באופן מסורתי מייגע ולגזול ערכי צבע מוחלטים של הערכת siderophore פעילות, המבוצעות על הפרט טיפח מבודד מיקרוביאלי. נוכל להחיל את השיטה שלנו 4 שונים אחרים/שורות של חיטה (חיטת הלחם ל'), כולל Lewjain, מדסן, ו PI561725 ו- PI561727 בדרך כלל גדל בצפון-מערב האוקיינוס השקט היבשה. Siderophore הייצור היה בבירור מושפע של גנוטיפ של חיטה, ובעוד סוגים ספציפיים של רקמות הצמח שנצפו. אנחנו משתמשים בהצלחה השיטה שלנו על המסך במהירות עבור השפעת הצמח גנוטיפ על ייצור siderophore, פונקציה מפתח במערכות אקולוגיות יבשתי ו הימית. שהפקנו משכפל טכניים רבים, מניב אמינים מאוד הבדלים סטטיסטיים בקרקעות ובתוך רקמות הצמח. חשוב לציין, התוצאות מציגות שהשיטה המוצעת ניתן לבחון במהירות siderophore ייצור בדגימות מורכבים עם רמה גבוהה של אמינות, באופן המאפשר קהילות להישמר לעבודה מאוחר יותר לזהות את taxa ואת הגנים פונקציונלי.

Biosynthesized תערובת pyoverdine על ידי Pseudomonas fluorescens שימש תקן כדי לפענח ולכמת ספיגת (ב 420 ננומטר) של דגימות מבחינת pyoverdine מקבילות מיקרומטר איור 1 מציג את קשרי הגומלין בין ספיגת (420 ננומטר) מתחילה ריכוז של pyoverdine (molarity10 יומן ב מיקרומטר). EDTA לא סיפקו תקן נאותה כי דגימות הייצוגיים מדידות ספיגת גדול יותר מאשר היו השגה עם pyoverdine, R2 היה נמוך (איור 2). תוך כדי התחלתי לעבוד ...

אנו מציגים פרוטוקול להקרנה מהירה של דגימות סביבתי עבור siderophore פוטנציאל לתרום הזמינות הביולוגית micronutrient והמסירה במערכות יבשתי.

תפוקה גבוהה Siderophore הקרנה מדגימות סביבתי: צמח רקמות תפזורת קרקעות, Rhizosphere קרקעות

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Siderophores הם משקל מולקולרי נמוך, ביומולקולות מתכת-chelating מעורב רכיבה על אופניים ברזל בסביבה. פרוטוקול זה מאפשר הערכת תפוקה גבוהה ומהירה של פעילות siderophore בדגימות קרקע וצמחים. שיטות קודמות לגילוי siderophore חיסלו את הסביבה הקריטית של הקהילה המיקרוביאלית.הטכניקה שלנו מאפשרת זיהוי בתוך הקהילה המיקרוביאלית השלמה יחסית ובית הגידול שבו היא מעורבת. מכיוון שזמינות הברזל חיונית לפרודוקטיביות החקלאית, כך בפרוטוקול זה ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור את תפקידם של מיקרואורגניזמים בהוסת את הזמינות של ברזל לצמחים. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך את ההשפעה של שיטות ניהול החווה על בריאות הקרקע וקהילות המייצרות siderophore, כמו גם את הפיתוח של קהילות כאלה לאורך זמן.כדי להתחיל, חומצה לשטוף את כל כלי הזכוכית ב 100 מילימולרית הידרוכלורית 100 מילימולרית חומצה חנקתית לפחות שעתיים לפני ניצול במבחן CAS. מכינים תבנית אפייה מאלומיניום במילוי חול ברמה מעבדתית ומכסים אותה בנייר אלומיניום. אוטוקלאב ב-121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ומניחים בצד.הכן HDTMA על ידי הוספת 0365 גרם ל 20 מיליליטר של מים כפולים deionized, ולמקם את הפתרון באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לקדם מינון. מוסיפים 0302 גרם של CAS ל-25 מיליליטר של מים כפולים, בעודם תוך ערבוב עדין עם פס ערבוב מגנטי סטרילי. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר של הקסהידראט ברזל טוחן אחד ל-25 המיליליטרים של פתרון CAS תוך המשך ערבוב עדין.עכשיו, לאט להוסיף את 20 מיליליטר של פתרון HDTMA לתוך פתרון ברזל CAS מורכב תוך ערבוב עדין. הכן את פתרון החיץ על ידי המסת 15.12 גרם של PIPES לתוך 375 מיליליטר של מים כפולים deionized עם ערבוב עדין. כוונן את ה- pH ל- 6.8 עם חמישה נתרן הידרוקסידי טוחן.לאחר מכן מוסיפים מים כדי להביא את הנפח ל 450 מיליליטר. עכשיו להוסיף חמישה גרם של אגרוז לפתרון. יש לבודד באופן אוטומטי את פתרון המאגר PIPES ואת הפתרון המורכב של ברזל CAS ב-121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.בזהירות להוסיף את כל הפתרון מורכב CAS ברזל לאורך כל מאגר PIPES בארון biosafety לאחר כל אחד מהם כבר autoclaved. מניחים את הפתרון המעורב באמבט מים ב 50 מעלות צלזיוס. עכשיו מניחים סירת ריג'נט סטרילית בחול הסטרילי בתוך הארון הביו-בטיחותי וחום ל-50 מעלות צלזיוס.העבר את אגר קומפלקס CAS ברזל לסירה, ואז במהירות aliquot 100 microliters לכל באר של מיקרופלסטיק סטרילי שטוח 96-well ברור. הכינו תקן פיוברדין 800 מיקרו-מולארי במדיום M9 שהוכן בעבר. לדלל את הפתרון לפתרונות 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 ו- 6.25 מיקרומולרים.הוסף EDTA ל 500 מיליליטר של מדיום M9 שהוכן בעבר כדי להכין את תקן EDTA 3.2 מילימולר. לדלל פתרון זה לתוך 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, ו 6.25 מיקרומולרים פתרונות. כדי ליצור עקומה סטנדרטית, להוסיף 100 microliters של כל ריכוז של פיוברדין ו EDTA להפריד בארות של מיקרופלסטיק 96 היטב המכיל 100 microliters של ברזל CAS מורכב אגר בינוני.בצע שכפולים טכניים כפולים של כל ריכוז. הוסף גם בארות ריקות עם M9 בלבד. באמצעות קורא מיקרופלסטיק, למדוד ספיגה לאחר אחד, שש, ו 24 שעות דגירה ב 22 מעלות צלזיוס, ולהשתמש מדידות ספיגה כדי ליצור עקומות סטנדרטיות. לשטוף את ציוד הדגימה עם 22 מיקרון מסנן כפול deionized מים ואחריו 70% אתנול ולנגב עם מגבות נייר.בצע את הכביסה לפני הדגימה ובין דגימות כדי לשמור על טכניקה סטרילית ולהפחית זיהום צולב. לאחר כריתת רקמות הצמח וחפירת כדור שורש קטן מצמחים בשטח, מניחים את כדור השורש בשקית ניילון נפרדת המסומנו להפרדת דגימה בסביבת המעבדה. מניחים את כל הדגימות ישירות על קרח ולשמור על ארבע מעלות צלזיוס עד דגימות מעובדים עבור הבדיקה ייצור siderophore.דגימות אדמה משויכות שורש נפרדות לאדמה ריזוספירה בתפזורת, כבולות באופן רופף ואדמה רזופרית קשורה היטב. כדי לעשות זאת, להוציא את כדורי השורש מתוך השקיות בעדינות לנער את האדמה מכדור השורש. מזועזעים מהאדמה, יחד עם האדמה שנותרה בשקית, מהווים את האדמה בתפזורת.זוהי אדמת הריזוספירה הכבולה באופן רופף. צור אדמה rhizopshere קשור היטב על ידי לקיחת שורשים עם מדגם קשור בחוזקה ולשים אותם בצינור צנטריפוגה. מוסיפים 30 מיליליטר של מים כפולים ומערבולת במשך שתיים עד שלוש דקות.הסר את השורשים כדי לקבל את דילול תרחיף הקרקע rhizosphere קשור היטב. הומוגניזציה כל דגימת אדמה בתוך שקית המדגם על ידי ערבוב והפיכת הקרקע ככל האפשר מבלי לפתוח את השקית. לאחר כל מדגם כבר מעורבב ביסודיות, aliquot ולהשעות שני גרם של כל דגימת אדמה ב 20 מיליליטר של מדיום M9 שונה בתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 50 מיליליטר.מדללים את הדגימה ולאחר מכן לאטום את הצינור עם תקע קצף סטרילי כדי לאפשר aeration. לדגימות ריזוספירה קשורות היטב, הוסיפו שני מיליליטר של תרחיף אדמת הריזוספירה ל-20 מיליליטר של מדיום M9 שונה בתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר. מדללים את הדגימה ולאחר מכן לאטום את הצינור עם תקע קצף סטרילי כדי לאפשר aeration.כדי להכין את דגימת הרקמה, פני השטח מעקרים את השורש, היורה והתבואה עם 70%אתנול. Macerate שני גרם של רקמה טרייה ב 20 מיליליטר של מדיום M9 שונה באמצעות בלנדר על גבוה במשך 30 שניות. לאחר מכן, להעביר את המדגם לצינור צנטריפוגה סטרילי 50 מיליליטר, לדלל, ולאטום את הצינור עם תקע קצף סטרילי.כדי להעשיר את ייצור siderophore באמצעות הגבלת ברזל דגירה צינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר בטמפרטורת החדר לנער ב 160 סל"ד. בגיל 24, 48 ו-72 שעות לאחר ייזום תרבות ההעשרה, יש להסיר תת-דגימה אחת מצינורות ההעשרה בטכניקה סטרילית. צנטריפוגה תת דגימות ב 10, 000 פעמים G במשך דקה אחת בשני צינורות צנטריפוגה מיליליטר כדי גלולה את התאים.באמצעות טכניקה סטרילית, להוסיף 100 microliters של supernatant לפתרון 100 microliter של ברזל CAS מורכב אגר כפול או טריפלג בתוך המיקרופלסטיק. כמו כן להוסיף 100 microliters של בינוני M9 סטרילי כמו ריקים. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס.כל צלחת צריכה להיות אטומה ומכסה בנייר כסף לפני המיקום באינקובטור. להשעות את העל-טבעי הנותר ואת גלולה עבור כל מדגם לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי משלו שני מיליליטר. הוסף 400 microliters של גליצרול סטרילי לתוך כל צינור על טבעי מדגם מחדש להשעות את גלולה כדי ליצור מניות גליצרול.להקפיא את המניה במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח מאוחר יותר. למדוד את הספיגה בשש, 24, 48, ו 72 שעות באורך גל של 420 ננומטר. תערובת פיוברדין biosynthesized על ידי פלואורסצנטים Pseudomonas שימש כסטנדרט לפרש ולכימת ספיגה של דגימות בדגימות של שקילות פיוברדין במיקרומולר.הקשר בין ספיגה ב 420 ננומטר ואת הריכוז ההתחלתי של פיוברדין מוצג כאן. פעילות Siderophore של העשרה 72 שעות הוערך ב 48 שעות דגירה כדי לקבוע את ההשפעה של גנוטיפ וסוג המדגם על בידוד siderophore. פעילות Siderophore בדגימות קרקע בתפזורת הייתה נמוכה יחסית ולא הציגה הבדלים בין גנוטיפ החיטה שממנו נדגמה הקרקע בתפזורת.עם זאת, העשרות של אדמה קשורה באופן רופף מבודד מן הגנוטיפ 725 הציג ייצור siderophore גדול יותר לעומת האדמה קשורה באופן רופף מדסן ו 727 אבל לא מ Lewjain. לעומת זאת, ייצור סיידרופור בהעשרות מאדמה קשורה היטב לא הושפע במידה רבה על ידי גנוטיפ. תרבות העשרה של רקמת תבואה הניבו ייצור siderophore נמוך יחסית ללא קשר גנוטיפ.העשרה של רקמת לירות Lewjain היה ייצור siderophore נמוך באופן משמעותי מאשר גנוטיפים אחרים, ו 725 לירות תרבות רקמה הביא ייצור siderophore משתנה יותר. ההבדל הגדול ביותר בפעילות siderophore נצפתה בתרבויות העשרה רקמת השורש שבו 725 היה יותר מ 200% פעילות siderophore גדול יותר מאשר כל genotypes אחרים. אחד ההיבטים הממיסויים ביותר של ביצוע הפרוטוקול הוא שמירה על תנאים ספיטיים תוך השלמת השלבים הרבים ליצירת מיקרופלסטיק אגר ברזל CAS ובדיקת דגימות עבור פעילות siderophore.ניתן ליישם מגוון רחב של טכניקות מבוססות תרבות כרומטוגרפית או מבוססות דנ"א על באר המיקרוטיטר בפועל או על התרבות השתמרה גליצרול לבדיקות ביוכימיות נוספות או אפיון גנטי ומידול מטבולי. על ידי שימוש בפעילות siderophore פרוטוקול זה יכול להיות קשור מאוחר יותר עם אורגניזמים ספציפיים האחראים על פעילות זו או לאחר מכן ממוקד כמנגנון להשפעות אקולוגיות גדולות יותר. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות שונה כדי להעריך את ייצור siderophore בתרבויות העשרה שנוצר מדגימות שנאספו תאים סביבתיים אחרים כולל אוויר, מים, ומעים.

high-throughput-siderophore-screening-from-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

חיידקים מייצרים תרכובות מופרשות שיש לו את הפוטנציאל להשפיע על הפיסיולוגיה של חיידקי השכנים שלהם. כאן אנו מתארים מסך coculture המאפשר זיהוי של אינטראקציות כאלה interspecies תיווך כימי על ידי ערבוב של חיידקים אדמה עם זני כתב תעתיק ניאון של Bacillus subtilis על תקשורת מוצקה.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

Assay bioreporter התא שלם עם sartisoli Burkholderia RP037-mChe פותח כדי לזהות שברים של מזהמים אורגניים (כלומר, fluorene) זמינים לשפלת חיידקים לאחר תחבורה פעילה על ידי mycelia גישור נקבוביות אוויר מלא במערכת מודל בלתי רוויה מים.

גישת Bioreporter תא כל להערכת תחבורה וזמינות ביולוגית של מזהמים אורגניים במערכות לא רוויים מים

מתואר מבחן תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים. ערכת בדיקה מוכנה לשימוש מרובה זו מורכבת ממצעי Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) שנבחרו מראש ומצעי Chromogenic B iomass (ICB) מורכביםI בלתי מסיסים. אנזימי המטרה הם אנדו-אנזימים ופרוטאזות מפרקים רב-סוכרים.

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

האינטראקציה עם התרבות המשותף המוצגת בפרוטוקול זה היא זולה, תפוקה גבוהה ופשוטה. ניתן להשתמש בתנאים אלה כדי להתבונן באינטראקציות מיקרוביאלית בתרבות המשותף, לזהות דפוסי אינטראקציה, ולאפיין את הפוטנציאל המעונה של מאמץ מחיידקים של התעניינות במחלות אנושיות וסביבתיות.

התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה עבור הדמיה דו-ממדית תת-מ"מ של מינים מרובים של חומרים מזינים אנאורגניים מזהמים ומינים מזהמים באמצעות מעברי צבע דיפוזיביים בסרטים דקים (DGT) בשילוב עם הדמיית ספקטרומטריית מסה. דגימה מסיסת וניתוח כימי ברזולוציה גבוהה מתוארים בפירוט למיפוי כמותי של מסיסים בריזוספרה של צמחים יבשתיים.

הדמיה דו מימדית וכימות של Labile, חומרים מזינים ומזהמים צמחיים אנאורגניים באדמה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת המגוון הביולוגי בקרקע כדי לחפש זנים פטרייתיים המעורבים בפירוק של חומרים סרבנים. ראשית, זנים פטרייתיים המסוגלים לגדול על חומצות הומיות או ליגנוצלולוז מבודדים. פעילותם נבדקת לאחר מכן הן במבחנים אנזימטיים והן במזהמים כגון פחמימנים ופלסטיק.

בידוד וסינון מהמגוון הביולוגי בקרקע עבור פטריות המעורבות בהתדרדרות של חומרים סרבנים

הבידוד של מיקרובים עמידים למתכות כבדות ממעיינות גיאותרמיים הוא נושא חם לפיתוח מערכות ביולוגיות וניטור סביבתי. מחקר זה מספק גישה מתודולוגית לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים למתכות כבדות ממעיינות חמים.

ביו-פרוספקציה של מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים לטיפול בזיהום סביבתי

פרוטוקול זה מספק ניתוחים איכותיים וכמותיים של סך כל הסידרופורים, פיוברדין ופיוצ'לין מ - Pseudomonas aeruginosa.

ניתוח איכותני וכמותי של ייצור סידרופור מ Pseudomonas aeruginosa

פרוטוקול זה מתאר גישה בעלת תפוקה גבוהה להערכת דליפת יוני צמחים, פעילות פרוקסידאז וייצור קלוז באותה דגימה.

הערכת תגובות עלים למטבוליטים משניים מיקרוביאליים באמצעות פורמט בעל תפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מציג תהליך סינון סטנדרטי עם תפוקה גבוהה עבור מיקרואורגניזמים תעשייתיים. הוא כולל בניית ספריית מוטנטים באמצעות מוטגנזה של ARTP, ביצוע סקר חיובי לטיפות באמצעות מיקרופלואידיקה אוטומטית, ולאחר מכן אימות התוצאות. אמינות זרימת העבודה אושרה על ידי סינון זני B. coagulans בעלי תפוקה גבוהה.

סקר מהיר של מוטנטים של חיידקים קואגולנס המופרזים בחומצה L-לקטית באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית של טיפות

חקור שיטת סקר מהירה לבחינת פעילות סידרופורים בדגימות קרקע וצמחים. הפרוטוקול מאפשר הערכת זמינות ברזל ובריאות הקרקע באמצעות קהילות מיקרוביאליות שלמות.

תפוקה גבוהה Siderophore הקרנה מדגימות סביבתי: צמח רקמות תפזורת קרקעות, Rhizosphere קרקעות

גלה סרטונים נוספים