Name: התפלגות המים xylem במפעלי וודי דמיינו בעזרת מיקרוסקופ אלקטרוני לסריקת ההקפאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: למד שיטה לצפייה בהתפלגות מים בתאי הזילם של צמחים מעוצים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני לסריקת הקפאה. שיטה זו מאפשרת תצפיות ברזולוציה גבוהה ללא ארטיפקטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI (מ20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04936, 17H03825, 18H02258)

הערה: תרשים סכמטי של פרוטוקול זה מוצג באיור 1.
1. דגימה: הרפיה מתיחות בתוך עמודת המים של קסיאו-תעלות
הערה: טיפול ההרפיה הבאה מומלץ לפני היישום LN2 כדי להימנע מהקפאה וממתחים-חפצים המושרה בהפצת המים הקפילאם.
<ol><li>הקף ענף ועלים לדיגום עם שקית ניילון שחורה כדי להאביק את הפוטנציאל המים בין עצה ועלים יותר משעתיים לפני הדגימה.</li>
	<li>לקבוע את פוטנציאל המים של לפחות שני עלים מן המדגם באמצעות תא לחץ או פסיכרומטר. כאשר פוטנציאל המים גבוה מ-ca.-0.5 MPa (כלומר, אין מתח מועט מאוד), מדגם ניתן לקצור לאחר הקפאת (להתייחס לסעיף 2: הקפאת קיבעון). כאשר פוטנציאל המים נמוך מ-0.5 MPa, יש צורך בטיפול בהרפיה כמתואר להלן.</li>
	<li>לתקן את הצווארון מסביב לגבעול כדי להתמלא במים. גביע פלסטיק ללא תחתית יכול לשמש כקולר הניתן לאטימה. יש לנקוט כדי לסגור בחוזקה את החללים בין הגבעול לצווארון באמצעות סרט דביק למניעת דליפת מדיה נוזלית המשמשים לאחר מכן. לקצירת גבעולים גמישים כגון ענפים דקים או זרדים, כיור חלק חיתוך לתוך דלי מלא מים על ידי כיפוף הגבעול. חותכים מתחת למשטח המים בעזרת מזמרה או מסור. העבירו את הדגימה למיכל אחר של מים במהירות האפשרית כדי למזער את חשיפת הקצה לאוויר.</li>
	<li>שמור את החלק החתוך. של הדגימה מתחת למים עבור מינים הרחבה, ודא כי האורך מהנקודה שבה מדגם ההקפאה עבור SEM יתקבל לקצה לחתוך של הגבעול שנקטפו הוא ארוך יותר מאשר הדגימות ' אורך כלי מקסימום כדי למנוע מתח-חפצים המושרה בתוך דגימת ההקפאה.</li>
	<li>מכסים את המדגם המכיל עלים עם שקית פלסטיק שחור כדי להפחית את דיות. לשמור על קצה לחתוך של המדגם במים ולשמור על מצב זה כ 30 דקות כדי להרגיע את המתח עצה. הימנע מזמן הרפיה ארוך (> 1 h) בשל מילוי מלאכותי אפשרי של מוליכי החמצן12.</li>
	<li>למדוד את פוטנציאל המים שוב כדי לאשר את ההרפיה של המתח עצה (כמעט 0 MPa). הערה: לפני הדגימה, יש לטפל באורך כלי הקיבול המקסימלי של מינים היעד או לקבוע אותם בדגימות דומות על-ידי שיטת הזרקת האוויר. בעת דגימת עץ גדול, או ענף גדול, קשה לנהל את הליכי ההרפיה המותחים המתוארים לעיל. לכן יש לאסוף דגימות מעצים גדולים במהלך תקופת הזריחה כאשר פוטנציאל המים הניתן גבוה יותר.</li>
</ol>2. הקפאת קיבעון עם LN2
<ol><li>חותכים ופותחים צד אחד של קולר עם מספריים או סכין שכלי. חברו בחוזקה את הצווארון סביב הגבעול עם סרט דביק תוך החזקת הצמצם במאוזן.</li>
	<li>ללבוש כפפות בידוד/כפפה, אבל הקפד להחזיק את הבקבוק של2 ב בבטחה, ולרוץב 2 לתוך הצווארון כדי למלא אותו ב2. שמור אותו מתמלא בהתמדה להוסיף LN2 כדי להקפיא לחלוטין את המים ב-xylem. הזמן הנדרש להקפאה תלוי בגודל המדגם; 1 דקות לאחר הרתיחה של שפךב 2 הפסיק הוא מספיק עבור ענף קטן או שתיל, בעוד יותר מ 20 דקות יש צורך בגבעול עץ גדול יותר20. הוסף LN2 ברציפות בזמן ההקפאה כפי שהוא מתאדה במהירות בשל הבדלי טמפרטורות גדולות בין LN2 וטמפרטורות הסביבה.</li>
	<li>לנתק את הצווארון מן החלק הקפוא של הגבעול לדוגמה כדי להסיר את LN2 אחרי זמן מספיק קפוא. הקפד ללבוש כפפות בידוד כדי למנוע מגע עם פוטנציאל LN2 נשפך הנגרמת על ידי ניתוק הצווארון.</li>
	<li>לקצור את המדגם עם יד יפה מסור מיד.</li>
	<li>לכסות את המדגם קפוא עם פיסת רדיד אלומיניום או לשים אותו לתוך צינור לדוגמה, שבו כתובים מספרי מזהה לדוגמה. מקום במהירות את המדגם שנקטפו לתוך מיכל מלא ב-LN2 או לארוז לתוך קופסה מבודדת מלא קרח יבש.</li>
	<li>אחסן את הדגימות במקפיא עמוק עד להשגחה. טמפרטורת האחסון המועדפת היא-80 ° c על מנת למנוע סובלימציה קרח והדרכה במהלך האחסון.</li>
</ol>3. הכנה לדגימה
הערה: כדי להתבונן, יש לגזוז דגימה ומשטח התצפית חייב להיות מהוקצע בטמפ ' תת-אפס כדי לשמור על הפצת המים בתוך מיקומו באתרו. מיקרוטומה ביולוגית עם מערכת קריוסטט (קריוסטט) היא אידיאלית לקיצוץ וחשיפת המשטח של הדגימה בסוג זה של התבוננות על ידי ההקפאה-SEM.
<ol><li>הגדר את הטמפרטורה של חדר הדגימה של הקריוסטט ל-30 ° c, אשר בדרך כלל קר מספיק כדי לשמור את המצוף של רוב הצמחים במצב קפוא.</li>
	<li>לקצץ מדגם לתוך חתיכה קטנה (< ca .2 ס"מ גובה ו < ca. 1 ס"מ רוחב או קוטר) כי ניתן לכוונן את המדגם של מתקן-SEM. השתמש בסכין חדה או מסור משובח לקיצוץ כדי למנוע שבירת הקרח במדגם. במקרה של מדגם גדול יותר שלא ניתן לגזור בסכין, במהירות לחתוך מראש עם מסור מקורר בתוך המקפיא.</li>
	<li>הצמד את החלק החתוך לצ, מחזיק להקפאה באמצעות הרכבה על מדיום הטבעה של רקמות (g., מתחם OCT) לצורך הקפאת ההקפאה. ואז, חברו את הצ למחזיק. דגימות של הקריוסטט</li>
	<li>חתוך את פני השטח על ידי גילוח שוב ושוב עם 5 – 7 יקרומטר סעיפים בעובי. זמירה על ידי גזירה יותר מ 1,000 כדי 2,000 μm, בעומק מוחלט מהמשטח הראשונית באוסף לדוגמה, הוא שימושי לחיסול החלק הפגום של המדגם שנגרם על ידי מראש חיתוך עם סכין או ראיתי כמתואר בשלב 3.2.</li>
	<li>לאחר חיתוך בערך משטח של המדגם, להתאים חלק בלתי מנוצל של להב מיקרוטומה מעל פני השטח של הדגימה. אל תאפשר ללהב לגעת במדגם שיעלה על הגדרת העובי.</li>
	<li>לפני החתך הראשון של חלק הלהב שלא נעשה בו שימוש, הרחב מעט את המרחק בין המשטח של הדגימה לבין הלהב.</li>
	<li>חותכים את פני השטח של הדגימה רק פעם או פעמיים. בנוסף, החלק את הלהב שוב כוונון חלק להב שאינו בשימוש על פני הדגימה.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.6 ו-3.7 שלוש או ארבע פעמים. זה חשוב על מנת לקבל משטח ברור ללא "סימני סכין" (איור 4).</li>
	<li>לאחר החיתוך הסופי, הגדר את מיקום הלהב רחוק מהדוגמה כדי למנוע מאבק לדבוק במדגם.</li>
	<li>לנתק את צ'אק מבעל הדגימה ולנתק את הדגימה מן צ ' אק על ידי הסרת מדיום הטבעה קפואה עם סכין חדה. ודא כי הדגימה ממוקם בחדר קריוסטט כדי למנוע את משטח מהוקצע מאבק כפור.</li>
	<li>עם מדיום הטבעה של רקמות. בחדר קריוסטט</li>
</ol>4. העברה לחדר הדגימה
הערה: על פני השטח-הדגם המוכן להיות מוגן מפני גידול של טמפרטורה או הצטברות של כפור במהלך ההעברה מחדר ההקפאה לשלב התצפית בחדר הדגימות של ההקפאה-סם.
<ol><li>שמרו על טמפרטורת הבמה הקרה בחדר הדגימות של ה-SEM-סם בנמוך מ-120 ° c עם LN2 בהתאם למדריך למשתמש של הציוד.</li>
	<li>מניחים את מחזיק הדגימה עם הדגימה מוכן לתוך מכולה בידוד מלא ב-LN2 בחדר קריוסטט.</li>
	<li>החזיקו את מחזיק הדגימה עם. מוט החלפהמתחת לחדר השני הימנע מחשיפת מחזיק הדגימה לאוויר כאשר הדבר אפשרי.</li>
	<li>הגדר במהירות את מחזיק הדגימה לחדר הפינוי מראש של תא הדגימה של ה-SEM-סם ברגע התחלת פינוי של תא טרום הפינוי. ואז, מניחים את מחזיק הדגימה על הבמה הקר לאחר האוויר מפונה לחלוטין. למרות שמעט הצטברות כפור היא בלתי נמנעת, הליך "הקפאת חריטה" (שלב 6) יכול להסיר אותו.</li>
</ol>5. הגדרת SEM
הערה: הגדרה אופיינית להתבוננות מתוארת להלן. חלק מהשינויים נדרשים בהתאם למצב הוואקום או לקרן האלקטרונים.
<ol><li>הגדר את פרמטרי ה-SEM להשגחה כדלקמן: מתח תאוצה: 3 – 5 kV טמפרטורת הבמה: <-120 ° c גלאי: פליטה משנית</li>
</ol>6. הקפאת חריטה
הערה: הקפאת-תחריט היא ההליך להדגשת הקצה של קירות התא של המדגם על ידי סובלימציה קלה של גביש קרח. הקפאת חריטה כרוכה גם הסרת dusts כפור פני השטח.
<ol><li>הפעל את מתח ההאצה של הרובה החשמלי בזמן הקפאת החריטה. מוטב לערוך חריטה בהקפאה תוך כדי צפייה בדגימה.</li>
	<li>העלו את טמפרטורת הדגימה ל-100 ° c.</li>
	<li>המתן מספר דקות עד להסרת אבק פרוסט ורמת פני השטח של הקרח בתאים עצה ירדה מעט בהשוואה לקירות התא.</li>
	<li>הנמך את טמפרטורת הדגימה ל-120 ° c. הערה: אם אין בקר טמפרטורה מותקן עבור הבמה הדגימה, להחזיק את הדגימה באמצעות מוט החליפין ולנתק אותו משלב הדגימה לכמה דקות. שימו לב לדגימה מספר פעמים במהלך תהליך ההקפאה, כדי לאמת את סטטוס הסובלימציה של הדגימה.</li>
</ol>7. ציפוי מתכת (אופציונלי)
הערה: השיפורים האחרונים בכלי SEM ועיבוד התמונה יכולים לספק תמונות באיכות גבוהה של דגימות חשמל ללא ציפוי מתכת. עם זאת, מרכיבים שאינם מוליכי החשמל, כגון חומרים ביולוגיים, לעיתים מגובים; בהירות גבוהה יותר במיקומים ספציפיים של הדגימה בשל הצטברות של אלקטרונים ("טעינה"). חשיפת הדגימה לקורות אלקטרונים למשך פרק זמן ארוך יותר, או להגדלה גבוהה, מגבירה את אפקטי הטעינה. ציפוי המשטח של הדגימה עם חומרי מתכת חשמליים מוליך מונע התרחשות של טעינה. השתמש במערכת ציפוי ואקום אשר מותקן בתוך יחידת ההקפאה כדי למנוע את הטמפרטורה של הדגימה להגדיל במהלך ציפוי.
<ol><li>ודא כי חומר הציפוי מותקן בראש מאייד מיועד של מערכת הציפוי.</li>
	<li>שמרו על טמפרטורת השלב הקרה במערכת הציפוי שמתחת ל-170 ° c.</li>
	<li>מניחים את מחזיק הדגימה בשלב הקר של מערכת הציפוי לאחר הקפאה מספקת.</li>
	<li>פתח מחיצה בין השלב הקר לראש המאייד.</li>
	<li>הגדר את הערך הנוכחי ואת ערך המתח של ראש המאייד ב-ca. 30 mA ו-ca .5 V, בהתאמה.</li>
	<li>להתנדף חומר ציפוי עבור ca. 30 לחלוק את פני השטח של הדגימה.</li>
	<li>הגדר את שני ערכי המתח הנוכחיים של ראש המאייד באפס וסגור את המחיצה.</li>
	<li>מניחים את מחזיק הדגימה על השלב הקר של חדר הדגימה להשגחה.</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

שיטות ההתבוננות ב-"קריו-SEM" שהוצגו במסמך זה מעשיות לצורך המחשה מהירה של חלוקת המים בקנה מידה תאי. באמצעות שיטה זו, לחקור את השינויים בחלוקת המים בתוך עצה יכול לעזור להבהיר את המנגנון של מינים העצים סובלנות ללחץ אביוטיים (מחסור במים או הקפאה) או מתחים ביוטי (מחלת עץ).
הצעד המכריע ביותר בשיטה זו הוא שמירה על הפצת המים האופיינית למצב המים הילידים במהלך איסוף המדגם וההכנה לדוגמה הבאה. רקמת מינים מסוג xylem עם תעלות ארוכות (בעיקר כלי האריווד של טבעת, מחוררים עצים) יכולים בקלות לאבד מים במהלך הקציר...

זמינות של משאבי מים (כלומר, משקעים, תוכן אדמה) קובעת בקפדנות את התמותה ואת ההתפלגות הגיאוגרפית של מינים צמחיים, שכן הם צריכים לקלוט מים מהאדמה ולהעביר אותו לעלים לייצור פוטוסינתטי. הצמחים חייבים לשמור על מערכת התחבורה. המים שלהם תחת תנודות המים בפרט, צמחים וודי ליצור מתחים גבוהים התעלות שלהם לאורך הזרמים דיות כמו, במקרים מסוימים, הם צריכים להחזיק את הכתר שלהם יותר מ ~ 100 m מעל הקרקע. כדי לשמור על עמודי המים בלחץ שלילי כה גבוה, מורכבות התעלות ברצף של תאים צינורי עם קירות תאים קשיחים והידרופוביות מסוג1. הפגיעות בתפקוד הלקוי של המין השני במינים היא הדטרמיננטה טובה של הישרדות המינים תחת אספקתהמים. בנוסף, לימוד מעמד המים של התעלות הוא חשוב להערכת מצבם הבריאותי של העצים הבודדים החשופים ללחצים בריאותיים או ביוטיים. מדידת זרימת sap או פוטנציאל מים יכול לספק הערכות של מעמד המים של צמח וודי בשל הפונקציה הידראולי משולבת של התעלות עצה. יתר על כן, להמחיש את התפלגות המים בתאי עצה יכול להבהיר את המצב של רכיבים בודדים של מערכת הידראולי עצה.
מספר טכניקות להמחיש את מצב המים של התעלות האלה הם3. השיטות הקלאסיות והשימושיות להתבוננות במסלולי המים ברקמת העור כרוכות בצביעת עמודת המים על-ידי הטבאתה בקצות הענפים החתוכים לצבע או על-ידי הזרקת צבע לתוך עץ עומד. צילומי רנטגן רכים מאפשרים גם הדמיה של הפצת מים של דיסקי עץ חתוכים בשל עוצמת הספיגה הדיפרנציאלי של קרני רנטגן של הלחות ב-עצה5,6. שיטות אלו, עם זאת, מספקות רק שירים של תנועת מים או הפגנת הפצות מאקרוסקופי במים. לאחרונה, טכניקות תצפית שאינן הרסניות, כגון מיקרו מיקוד רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (μct)7,8,9,10ודימות תהודה מגנטית (MRI)11, 12, שופרו באופן משמעותי כדי לאפשר השגחה של מים בתוך שתילים שלמים. לשיטות אלה שאינן הרסניות יש יתרונות גדולים בכך שאנו יכולים להתבונן במצב המים של xylem ללא אפקטים מלאכותיים, ואנו יכולים לעקוב אחר הדינמיקה של זרימת המים באמצעות הדמיה רציפה או החדרת סוכן ניגודיות10. עם זאת, אנחנו צריכים להשתמש ב-MRI מותאם אישית עבור הדמיה של הצמח או מתקן מיוחד עבור Μסינכרוטרון מבוסס-Ct כדי לקבל את התמונות אשר יכול לזהות תוכן המים ברמה התאית. בנוסף, למרות מערכת μct מבוסס סינכרוטרון לקבל תמונות משובחות עם רזולוציה מרחבית גבוהה, הדומה למיקרוסקופיה קלה7,8,9, תאים חיים יכולים להיפגע על ידי ה קרינה של אנרגיה גבוהה X-ray13,14. שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני סריקה שבו יחידות ההקפאה מותקנות (ההקפאה-SEM) היא שיטה שימושית מאוד לאיתור בדיוק את המים ב-עצה ברמה התאית, למרות שהדבר דורש לקצור את הדגימה להסתכלות. כדי לתקן את המים ב-עצה, חלק מהגבעולים (כלומר, זרדים, ענפים או גבעולים) קפואים באתרו על ידי חנקן נוזלי (LN2). תצפיות של פני השטח של גזוז, יצורים קפואים על ידי ההקפאה-SEM לספק תמונות מוגדלות ביותר של מבנה עצה שממנו אנו יכולים לזהות את המים ב-עצה כקרח. הגבלה משמעותית של שיטה זו היא כי התבוננות רציפה על מתנוכי המים בתוך אותה דוגמית היא בלתי אפשרית. עם זאת, היישום של μCT או MRI עבור התבוננות רציפה של עצים החיים בשדה הוא מאוד מאתגר משום שמכשירים אלה אינם ניידים. לעומת זאת, לבית-SEM יש פוטנציאל לשימוש בטכניקה זו על עצים גדולים בניסויים בשטח כדי להמחיש בבהירות את תוכן המים במישור הסלולר בלבד, אלא גם ברמת מבנה עדינה יותר, למשל, מים בבורות בין-כלים15, מים ב החללים הבינתאיים16, או בועות בעמודת המים17.
מחקרים רבים התבוננות מים עצה על ידי ההקפאה-SEM דווחו 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi ואח ' (1996) הקים בתחילה את הפרוטוקול להתבוננות של עצה באתרו על ידי הקפאת קיבעון של גזע חי באמצעות מילוי LN2 לתוך מיכל להגדיר על גזע21. הטמפרטורה של המדגם נשמרה למטה-20 ° c במהלך איסוף המדגם במהלך הכנת ההקפאה-SEM כדי למנוע המסת הקרח בתוך התעלות עצה. שיטה זו שימש להתבונן במים ב-עצה כדי להבהיר את הפצת המים תחת שינוי משטר המים11,12,24,25,26, 27,28, הווריאציה העונתית של הפצת מים21,29,30, ההשפעה של מחזורים להפשיר הקפאה17,31, 32, התפלגות המים בעץ רטוב5, שינויים בחלוקת המים במהלך המעבר מ סאפרווד לשמוע20, קורס הזמן העונתי של פעילות הקמשוקה והבידול של כלי33, והתוצאה הנגרמת על ידי מתחים ביוטיים מסוימים23,34. מוליכות הידראולית ופגיעות תעלות כדי קוויטציה גם אומתו באמצעות ההקפאה-SEM35,36. המלון שימש לחקר התפלגות אלמנט על פני השטח של מדגם המכיל מים37, והוא מצויד באנרגיה המדלדת בעזרת הספקטרומטריה.
הקפאת קיבוע של גזע חי אשר מכיל תעלות תחת מתח הידראולי גבוה לעיתים גורם cavitations אשר נצפו על ידי המקפיא-SEM כמו גבישי קרח שבורות לומן של תעלות38,39. במיוחד, מינים ברועלים עם תעלות ארוכות ורחבות יותר פגיעים לחפצים הנובעים ממתח, כגון הפחתת החיתוך של המדגם, גם אם בוצעו מתחת למים3,40. הממצאים החזותיים להיות בולט לאחר הדגימה של עץ הטרנס (כלומר, הדגימה בזמן היום) או בתנאים חמורים בצורת והם יכולים להטעות הערכה יתר של מופע מוגזם3,38, 39. לפיכך, יש לשחרר את המתח העובד בתעלות כדי למנוע את האפשרות הארטיטיבית3,12,39.
טכניקת שבר ההקפאה באמצעות סכין מותקן בחדר דגימה מועסק לעתים קרובות כדי לחשוף את משטח הדגימה עבור התבוננות ההקפאה-SEM. עם זאת, הקפאת שבורה מטוסים של רקמות הצמח וודי, במיוחד בחלקים רוחבי של xylem משני, הם גסים מדי כדי להתבונן בבהירות תכונות אנטומית ומים ברקמה6. היישום של קריוסטט עבור זמירה דגימה מאפשר הכנה מהירה ובאיכות גבוהה של משטחים לדוגמה20,23. המטרה הכוללת של שיטה זו היא מתן ראיות עם הרזולוציה אלקטרון מיקרוסקופ של התפלגות המים בסוגים שונים של תאים עצה באתרו ללא התרחשות של חפצי הדגימה. אנו מציגים את ההליך המעודכן שלנו, אשר כבר השתפר בהתמדה מאז שאימצנו אותו לראשונה, לגבי הדגימה, זמירה וניקוי משטח הדגימה להשגת מיקרוגרפים אלקטרונים באיכות גבוהה של דגימות מתקן ההקפאה של xylem.

<table><tbody><tr><td>חומר ציפוי</td><td>JOEL בע"מ, יפן</td><td>חוט זהב, 0.50 & פעמים; 1000 מ"מ, 99.99%, חלקים מס' 125000499&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קריו</td><td>JOEL בע"מ, יפן</td><td>JSM-6510 מותקן עם MP-Z09085T / MP-51020ALS</td><td></td></tr><tr><td>cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>CryoStar NX70</td><td></td></tr><tr><td>להב מיקרוטום</td><td>Thermo Scientific</td><td>HP35 ULTRA להבי מיקרוטום חד פעמיים, 3153735</td><td></td></tr><tr><td>הקפאת רקמות הטבעה בינוני</td><td>שרף הטמעה Thermo Scientific</td><td>Shandon Cryomatrix, </td><td></td>6769006</tr></tbody></table>

התפלגות המים xylem במפעלי וודי דמיינו בעזרת מיקרוסקופ אלקטרוני לסריקת ההקפאה

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה מותקן מותקנת-יחידת (ההקפאה-SEM) מאפשר תצפית דגימה בטמפרטורות מתחת ושימש לחקר הפצת מים ברקמות הצמח בשילוב עם הקפאת טכניקות קיבוע באמצעות חנקן נוזלי ( ב 2). עבור מינים וודי, עם זאת, ההכנות להתבוננות במשטח החתך הרוחבי של עצה כרוכות בקשיים כתוצאה מכיוון של סיבי עץ. בנוסף, מתח גבוה יותר בעמודת המים ב-עצה יכול מדי פעם לגרום לשינויים העובדתיים בהפצת המים, במיוחד במהלך קיבוע המדגם והגבייה. במחקר זה, אנו להפגין הליך יעיל להתבונן התפלגות המים בתוך עצה של צמחים וודי באתרו באמצעות קריוסטט ו-הקפאה-SEM. בתחילה, במהלך איסוף המדגם, מדידת פוטנציאל המים עצה צריך לקבוע אם המתח הגבוה נמצא בתעלות עצה. כאשר הפוטנציאל הגלום במים נמוך (< ca. 0.5 MPa), נדרש הליך הרפיה במתח כדי לאפשר שימור טוב יותר של מעמד המים ב-עצה במהלך דגימת קיבוע ההקפאה. בשלב הבא, צווארון המים האטומה מוצמד מסביב לגבעול העץ ומתמלא ב-LN2 לצורך הקפאת הקיבעון של מעמד המיים של xylem. לאחר הקציר, יש לנקוט כדי להבטיח כי המדגם נשמר קפוא תוך השלמת ההליכים של הכנה לדוגמה להתבוננות. קריוסטט מועסק בבירור לחשוף את המשטח הרוחבי עצה. בתצפיות ההקפאה, התאמת הזמן לחריטה בהקפאה נדרשת כדי להסיר אבק כפור ולהדגיש את קצה קירות התא על משטח הצפייה. התוצאות שלנו להפגין את תחולת טכניקות ההקפאה-SEM להתבוננות של הפצת מים בתוך עצה ברמות סלולר ו subcellular. השילוב של ההקפאה-SEM עם שאינם הרסניים טכניקות תצפית באתרו יהיה מאוד לשפר את החקירה של הדינמיקה זרימת מים צמח וודי.

תמונות מייצגות של משטחי חיתוך רוחבי של עץ מחטניים וברועלים, שנצפתה על ידי המקפיא-SEM, מוצגים באיור 2. בהגדלה הנמוכה, האזור השחור בתמונות מציין את החללים שמהם המים לחלוטין או בחלקו נעלמים, והאזור האפור מצביע על קירות תא מסוימים, ציטופלסמה ומים (איור 2א). בהגדלה גבוהה, ניכר כי המים אינם אבודים לחלוטין מלומינה של שלוש דלקת הקנה, ומציינים את הופעת בועות המאקרו ב-עצה באתרו (איור 2...

התבוננות בחלוקת המים בתוך העצה מספקת מידע משמעותי בנוגע לדינמיקה של זרימת מים בצמחי הודי. במחקר זה, אנו מדגימים את הגישה המעשית להתבונן הפצת מים עצה באתרו באמצעות קריוסטט ו-הקפאה-SEM, אשר מבטלת שינויים מעשיים במצב המים במהלך הכנת המדגם.

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק לנו רזולוציה אלקטרומיקרוסקופית של חלוקת המים בסוגים שונים של תאים xylem במקום. שיטה זו שימשה להתבוננות במים בקסים על מנת להבהיר את חלוקת המים ומשטרי המים המשתנים, את השונות העונתית של חלוקת המים, את השפעת מחזורי ההקפאה/ההפשרה, את חלוקת המים בעץ רטוב ואת cavitation הנגרמת על ידי לחצים ביוטיים מסוימים. הקפאה-קיבעון של גזע חי תחת מתחים הידראוליים גבוהים לפעמים גורם cavitations מלאכותי, אשר נצפו על ידי cryo-SEM כמו גבישי קרח קרועים בלומן של צינור.הליך מעודכן זה מתמקד בהשגת מיקרוגרפים אווירוטום באיכות גבוהה של xylem ללא החפץ בהליך הדגימה. הדגמה בת קיימא היא קריטית מכיוון שיש מספר פרטים חשובים שלא ניתן להסביר בקלות. יחד עם זאת, קבלת הכשרה אינה קלה כי רק כמה מעבדות ברחבי העולם לתרגל שיטה זו.כדי להתחיל בהליך זה, יש להקיף ענף ועלים לדגימה בשקית ניילון שחורה כדי לצייד את פוטנציאל המים בין קסלם לעלים יותר משעה לפני הדגימה. באמצעות תא לחץ, לקבוע את פוטנציאל המים של לפחות שני עלים מהדגימה. כאשר פוטנציאל המים גבוה יותר ממינוס 0.5 מגה פסקל, ניתן לקצור דגימה לאחר ההקפאה.כאשר פוטנציאל המים נמוך ממינוס 0.5 מגה פסקל, להמשיך עם הטיפול עבור הרפיה. לתקן צווארון אטום למים סביב הגבעול, אשר יהיה מלא במים. באמצעות גיזום גיזום או מסור, לחתוך את הגבעול מתחת לפני המים ולשמור על הקצה החתך של המדגם מתחת למים.מעבירים את הדגימה למכל מים אחר במהירות האפשרית כדי למזער את חשיפת הקצה החתך לאוויר. עבור מינים בעלי עלים רחבים, ודא כי האורך מהנקודה שבה דגימת קריו עבור SEM תושג לקצה החתך של הגבעול שנקטף ארוך יותר מאורך הכלי המרבי של המדגם על מנת למנוע ממצאים הנגרמים על ידי מתח בתוך crysoample. לאחר מכן, מכסים את הדגימה בשקית ניילון שחורה כדי להפחית את התרחשותה.שמור על הקצה החתך של המדגם במים ולשמור על מצב זה במשך כ 30 דקות על מנת להרגיע את המתח xylem. לאחר מכן, למדוד את פוטנציאל המים שוב כדי לאשר את הרפיה של המתח xylem. ראשית, השתמש במספריים או בסכין שירות כדי לחתוך ולפתוח צד אחד של צווארון הדוק למים.חבר את הצווארון בחוזקה סביב הגבעול עם סרט דבק תוך החזקת הצמצם אופקית. לשים על כפפות בידוד, בבטחה להחזיק את כלי החנקן הנוזלי. הפעל חנקן נוזלי לתוך הצווארון עד שהוא מלא ולשמור אותו מלא על ידי הוספת בהתמדה חנקן נוזלי נוסף כדי להקפיא לחלוטין את המים בקסילם.לאחר זמן הקפאה מספיק, לנתק את הצווארון מן החלק הקפוא של גזע המדגם על מנת להסיר את החנקן הנוזלי. מיד להשתמש ביד יפה מסור כדי לקצור את הדגימה. ואז לכסות את המדגם הקפוא עם חתיכת רדיד אלומיניום או לשים אותו בחזרה לתוך צינור מדגם.מניחים במהירות את הדגימה שנקטפו לתוך מיכל מלא חנקן נוזלי. לאחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לבצע את התצפית. כדי להתחיל, להגדיר את הטמפרטורה של תא הדגימה של cryostat למינוס 30 מעלות צלזיוס, אשר בדרך כלל קר מספיק כדי לשמור על sap xylem של רוב הצמחים במצב קפוא.השתמש בסכין חדה או במסור דק כדי לקצץ את הדגימה לחתיכה קטנה שניתן להתאים למחזיק הדגימה של cryo-SEM. הר את החתיכה הגזוצה לצ'אק, מחזיק להקפאת קריוסטט, עם מדיום הטבעה המקפיא רקמות לחיתוך קריו. חבר את הצ'אק למחזיק דגימה של מיקרוטום של ההקפאה.חותכים את פני השטח על ידי גילוח חוזר ונשנה של חמישה עד שבעה חלקים בעובי מיקרומטר. חיתוך יותר מ-1,000 עד 2,000 מיקרומטר בעומק כולל לפני השטח ההתחלתיים שימושי להדגשת החלק הפגום של המדגם שנגרם על ידי חיתוך מראש. לאחר גיזום גס של משטח הדגימה, התאימו חלק לא שימוש של להב המיקרוטום מעל פני השטח של הדגימה.הרחב מעט את המרחק בין פני השטח של הדגימה לבין הלהב. וחותכים את פני השטח רק פעם או פעמיים. לאחר מכן, החלק שוב את הלהב והצב חלק לא שימוש של הלהב על משטח הדגימה.חזור על עיבוד חיתוך זה שלוש עד ארבע פעמים כדי להשיג משטח ברור ללא סימני סכין. לאחר החתך הסופי, הגדר את מיקום הלהב הרחק מהדגימה כדי למנוע מאבק להידבק לדגימה. ותנתק את הצ'אק מהמיקרוטום.לאחר מכן, חבר את הדגימה למחזיק דגימת קריו-SEM עם מדיום הטבעה המקפיא רקמות בתא ההקפאה. ראשית, השתמש בחנקן נוזלי כדי לשמור על טמפרטורה מתחת למינוס 120 צלזיוס בתא הדגימה cryo-SEM על פי המדריך למשתמש הציוד. לאחר מכן, מניחים את מחזיק הדגימה עם הדגימה המוכנה לתוך מיכל בידוד מלא חנקן נוזלי בתא ההקפאה.השתמש במוט החלפת דגימה כדי להחזיק את מחזיק הדגימה מתחת לחנקן הנוזלי. העבר במהירות את בעל הדגימה לתא טרום הפינוי של חדר הדגימה cryo-SEM ברגע שמתחילים בפינוי של חדר טרום הפינוי. כדי להתחיל, הפעל את מתח התאוצה של האקדח החשמלי.לאחר מכן, להעלות את הטמפרטורה של שלב הדגימה למינוס 100 מעלות צלזיוס. המתן מספר דקות עד שאבק הכפור יוסר ושרמת פני השטח של הקרח בתאי הקסים תרד מעט בהשוואה לקירות התא. לאחר מכן, להוריד את הטמפרטורה של שלב speiumen למינוס 120 מעלות צלזיוס.במחקר זה, שיטות תצפית cryo-SEM משמשים כדי לדמיין בבירור את חלוקת המים בקנה מידה תאי. בהגדלה נמוכה, האזור השחור בתמונות מציין את החללים שממנו נעלמים מים לחלוטין או בחלקם, בעוד שהאזור האפור מציין קירות תא קסילם, ציטופלסמה ומים. בהגדלה גבוהה, מתברר כי המים אינם אבודים לחלוטין מן הלומינה של שלוש קנה, המציין את התרחשותן של בועות מאקרו בסאפ xylem במקום.ביחס למינים בעלי עלים רחבים, התרחשות cavitation מזוהה בקלות בתוך כלי, בעוד קיומו של מים קשה להבחין בתוך סיבים, במיוחד בהגדלה נמוכה. ניתן להבדיל בין תאי ציטופלסמה ופרנצ'ימה לבין מים בתוך קנה ים או כלי שיט באמצעות מרקמי מישור קרח. ניתוח השפעת הטמפרטורה על תהליך תחריט ההקפאה מגלה כי אבק כפור סובלימציה בהדרגה, קרום בור אנדוטרקהיד מתבהר באמצעות התקדמות סובלימציה עם עליית הטמפרטורה.חלקיקי אבק כפור גדולים שנותרו יכולים להיות מסולקים על ידי הקפאת תחריט נוסף. אבל זה יכול להיות בעייתי כפי שהוא שלא לצורך מקטין את פני השטח של קרח בתעלות xylem. איכות התצפית הגבוהה מושגת במידה רבה באמצעות הכנת דגימה מדויקת.החלקת פני השטח עם הלהב החד של המיקרוטום חשובה במיוחד. החלקה לא מספקת על-ידי להב משומש יכולה לעיתים ליצור משטח מחוספס הדומה ל סימני סכין, או ליצור מופעים רבים של אבק מהחתכים. הקפאת מדגם ללא הרפיה של לחץ עמוד מים שלילי יגרום אינדוקציה חפץ של cavitation בצינורות xylem.גבישי קרח מקובצים נצפו בכלי דגימה שבהם המדגם לא היה רגוע. לעומת זאת, לא נצפו גבישי קרח מקובצים בדגימות המדגם הנינוחות עם פוטנציאל מים דומה. היישום של קיבוע הקפאה לצמחים חיים הסובלים מבצורת עלול לגרום לחפצים מבוססי תוצאה כגון גבישי קרח מקובצים באשכולות.החפצים האלה מובילים לפירוט מוטעה של מצב המים בצינור קסלם. לכן חשוב לאשר תחילה את פוטנציאל המים של דגימות לפני הקפאת קיבעון. למרות שהליך זה מספק תמונה של מה מצב בצינור xylem, עץ חי חייב להיהרס לתצפית.שילוב שיטות תצפית לא פולשניות אחרות כגון MRI או מיקרו-CT עם תצפית תמונה ברמת חברת הבת יעמיק את הבנתנו את הטבע בין הובלת מים לשימוש. התצפית על מצב המים שהוצגה על ידי נייר זה תספק גם שיטה לבירור הקשר של מים המעורבים בתאים ותגובות אנטומיות אחרות ללחץ אביוטי או ביוטי. Cryo-SEM מצויד בספקטרוסקופיית רנטגן פיזור אנרגיה או סים העליון שימשו לחקר הפצת אלמנטים על פני השטח של דגימה המכילה מים.שילוב של ניתוח יסודי והליך זה במסגרת דומה זו יכול לתת לנו ידע מעמיק על התנהגות התא הקסילם הקשורה למצב המים. בעת שימוש בחנקן נוזלי להקפאת קיבוע דגימות בחדר, אל תשכח לאוורר את החדר כדי למנוע מחסור בחמצן.

xylem-water-distribution-woody-plants-visualized-with-cryo-scanning

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

רזולוצית רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת גבוהה (HRCT) היא טכניקת הדמיה לאבחון לא הרסנית שניתן להשתמש בו כדי ללמוד את המבנה והתפקוד של מערכת כלי דם צמח ב-3D. אנחנו מדגימים איך HRCT מאפשר חקר של רשתות העצה על פני מגוון רחב של רקמות צמח ומינים.

שימוש ברזולוציה גבוהה טומוגרפיה ממוחשבת כדי להמחיש את המבנה התל ממדים ופונקציה של הצמח vasculature

הרכב דופן התא של הצמח משתנה בין סוגי הרקמות ויכול לכלול ליגנין, תאית, המיצלולוז ופקטין. טכניקות צביעה שונות פותחו כדי להמחיש הבדלים ברמת סוג התא. מאמר זה הוא אוסף של טכניקות צביעת דופן תאים נפוצות.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד לדגום דגימות עץ להערכה כוללת של מבני הגידול שלהן. מתוארות טכניקות הכנה והדמיה מאקרו ומיקרוסקופיות הנחוצות ליצירת מערך נתונים אנטומי ודנדרואקולוגי של עץ משוכפל היטב וברזולוציה גבוהה.

פרספקטיבה טכנית במחקר העץ-טבעת מודרנית - כיצד להתגבר על Dendroecological ואתגרי אנטומי עץ

כאן אנו מתארים הליך לחקר רקמות צמחים שבורות בהקפאה. דגימות עלים קפואות בלחץ גבוה שבורות בהקפאה ומצופות בשכבה כפולה, ומניבות דגימות קפואות-לחות שמורות היטב המצולמות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בהגדלות גבוהות עם נזק מינימלי לאלומה.

לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

אנו מספקים שיטה כדי לשפר את הניגודיות הקליטה רנטגן רקמת תירס מתאים סריקת טומוגרפיה microcomputed רגיל. על סמך CT תמונות, אנחנו מציגים את ערכה של זרימות עבודה של עיבוד תמונה עבור חומרים תירס שונים ביעילות לחלץ פנוטיפים מיקרוסקופיים של וסקולריים צרורות של תירס.

טכניקות Phenotyping בקנה מידה מיקרון של חבילות וסקולריים תירס מבוסס על צילום רנטגן טומוגרפיה Microcomputed

פרוטוקול זה מציג כיצד לחיות התמונה ולנתח את meristems apical לירות מכל מיני צמחים שונים באמצעות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

כאן, מוצג פרוטוקול המתאר את שלבי הכנת הדגימה ואיסוף הנתונים הנדרשים בטומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של cryo (SXT) כדי לדמות את מבנה האולטרה-מבנה של תאים שלמים שהשתמרו בקריו ברזולוציה של 25 ננומטר חצי גובה.

תיאור קרטוגרפי תלת-ממדי של התא על ידי טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של Cryo

Micro-CT הוא כלי לא הרסני שיכול לנתח מבנים צמחיים בתלת מימד. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכנת הדגימה כדי למנף מיקרו-CT לניתוח מבנה ותפקוד צמחים טפיליים. מינים שונים משמשים כדי להדגיש את היתרונות של שיטה זו בשילוב עם תכשירים ספציפיים.

מינוף סריקת מיקרו-CT לניתוח אינטראקציות טפיליות בין צמח למארח

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה אופטימלית לתצפית היסטולוגית של גלים המושרים על ידי פלזמודיופורה brassicae. מקטעי ויברטומים של היפוקוטיל מנוקים לפני הדמיה פלואורסצנטית כדי לחקור את המעורבות של גורמי שעתוק ופיטוהורמונים במהלך התקדמות המחלה. פרוטוקול זה מתגבר על מגבלות הטמעת הרגם, ומאפשר הדמיה של חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים.

שילוב של מיקרוסקופיית ניקוי ופלואורסצנציה להדמיית שינויים בביטוי גנים ותגובות פיזיולוגיות לפלסמודיופורה brassicae

כאן אנו מראים כיצד לעבד ליבות עץ עם שרשרת כלים טומוגרפיה ממוחשבת רנטגן. למעט מיצוי כימי למטרות מסוימות, אין צורך בטיפול מעבדה פיזי נוסף. שרשרת הכלים יכולה לשמש להערכות ביומסה, לקבלת נתוני רוחב MXD/טבעות עצים וכן לקבלת נתונים כמותיים על אנטומיה של עץ.

ניתוח ליבת עץ עם טומוגרפיה ממוחשבת רנטגן

למד שיטה לצפייה בהתפלגות מים בתאי הזילם של צמחים מעוצים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני לסריקת הקפאה. שיטה זו מאפשרת תצפיות ברזולוציה גבוהה ללא ארטיפקטים.

התפלגות המים xylem במפעלי וודי דמיינו בעזרת מיקרוסקופ אלקטרוני לסריקת ההקפאה

גלה סרטונים נוספים