הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

טכניקת הכנת מדגם זו נועדה לשלב את האיכות הטובה ביותר של שימור אולטרה-מבנה עם הניגודיות המתאימה ביותר לדרך ההדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים ממוקד לסריקת קרן יון. פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור דגימות הדורשות הכנה על ידי הקפאה בלחץ גבוה לשימור אולטרה-מבנה אמין אך אינן מקבלות ניגודיות מספקת במהלך החלפת ההקפאה להדמיית נפח. עבור הטמעה מינימלית של שף זה חיוני כדי להסיר כמה שיותר שף ככל האפשר כדי לאפשר מיקוד תקין בהמשך מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת קרן היונים ממוקד.

כדי להתחיל, להשתמש פיפטה לטפטף טיפה אחת של 20%PVP PBS על מחצלת חיתוך. לטבול את nervus tibialis נותק בטיפה. השתמש באזמל כדי לחתוך שני מילימטר אורך של המדגם.

השתמש בממטרים עדין כדי למקם את הדגימה במנשא מדגם מתכת מסוג A בעומק 0.2 מילימטר. העבר את המוביל לצלחת האמצעית של המחסנית. מניחים את מנשא B מצופה ההקסדקני בחלק העליון כמכסה.

סגור את ההרכבה על-ידי הנחתת החצי העליון של המחסנית. סגור את המחסנית בשלושה חלקים בתחנת הטעינה של המקפיא בלחץ גבוה. לחץ על לחצן התהליך והמשך בהתאם להוראות הפעולה של היצרן.

באמבטיה של חנקן נוזלי, מניחים נשאים מדגם לתוך בקבוקוני cryo המכילים שני מיליליטר של חומצה טאנית קפואה 0.1% ואצטון ולסגור את הכובעים. מניחים את בקבוקוני ההקפאה ביחידת החלפת ההקפאה שנקבעה במינוס 90 מעלות צלזיוס. הפעל את התוכנית ולשמור את הדגימות שם במשך 100 שעות.

ביחידת החלפת ההקפאה, לשטוף את הדגימות עם שני מיליליטר של אצטון שלוש פעמים במשך 30 דקות. מניחים 2%osmium tetroxide ב 0.1% אורניל אצטט ליחידת החלפת ההקפאה לקירור ומוסיפים אותו לדגימות במשך שבע שעות המשך הכתם במינוס 90 מעלות צלזיוס. כאשר טמפרטורת התוכנית ביחידת החלפת ההקפאה מגיעה למינוס 20 מעלות צלזיוס, שמור את הדגימות שם לעוד 16 שעות.

כאשר הטמפרטורה עולה ל 4 מעלות צלזיוס, להשליך את הנוזל בבקבוקונים ולמלא אצטון טהור. הסר את בקבוקוני ההקפאה מיחידה להחלפת הקפאה. טיפול לדוגמה לפני הקפאה ולאחר osmofication הוא קריטי מאז המדגם יכול להיפגע קשות.

במכסה המנוע של האדים, השתמש במטלות עדינות כדי להסיר את נושאות המתכת מבקבוקוני ההקפאה ולהעביר את הדגימות מהנשאים כדי להטביע אותן בצלחת זכוכית שעון עמוקה של 150 מ”מ מלאה באצטון. השתמש ממטרות בסדר להעביר את הדגימות לתוך שני צינורות תגובה מיליליטר מלא אצטון. קבעו את המיקרוגל על 250 וואט למשך 40 שניות והתחלו את המיקרוגל לשטוף את הדגימות ולחזור על הפעולה ארבע פעמים.

פיפטה מיליליטר אחד של 1%thiocarbohydrazide פתרון לתוך צינור התגובה ולשים אותו במיקרוגל. הפעל את פונקציית ואקום עם שתי דקות על ושתי דקות כבוי, איטרה במשך סך של 14 דקות ולהגדיר אותו ב 150 וואט. הפעל את המיקרוגל.

לשטוף את המדגם ארבע פעמים אצטון כמו קודם לכן. פיפטה מיליליטר אחד של 2%osmium פתרון tetroxide לתוך צינור התגובה. מניחים את הדגימה במיקרוגל ולהשתמש באותן הגדרות מיקרוגל כמו עם thiocarbohydrazide.

לשטוף את המדגם ארבע פעמים אצטון כמו קודם לכן. פיפטה מיליליטר אחד של 25% סרן באצטון לתוך צינור התגובה ולשים אותו במיקרוגל. הפעל את פונקציית הוואקום במשך שלוש דקות והגדר אותה על 250 וואט.

הפעל את המיקרוגל. השתמש קיסם כדי להסיר את השוקית nervus מתוך צינור התגובה ולהמקם אותם על פיסת סרט פלסטיק. מניחים מנורת הלוגן קרוב לדגימות כדי לחמם את הגוף.

באמצעות קיסם, בעדינות לדחוף את המדגם סביב על סרט הפלסטיק עד שלא מזוהה שף שנותר. שים את סרט הפלסטיק עם המדגם על גבי בתנור ולהגדיר את הטמפרטורה ב 60 מעלות צלזיוס כדי להפוך את הדגימות לפחות 48 שעות. השתמש בסכין גילוח כדי לגזור את הדגימות המפולמורות יחד עם סרט הפלסטיק בגודל שמתאים לסטוב SEM.

השתמש בקיסם כדי להוסיף שף כסף מוליך על Stubs SEM ולצרף את דגימות לחתוך אליו. ולאחר מכן להוסיף שף סביב הדגימות. שים את Stubs SEM בתנור כדי לפולימר ב 60 מעלות צלזיוס לפחות 4 שעות או לילה.

לאחר הפולימריזציה, מקם את ספבי ה- SEM במעיל sputter. הגדר את מעיל sputter ב 35 מיליאמפר ולהחיל 10 ננומטר עבה ציפוי זהב או מעיל במשך דקה אחת. לאחר הציפוי, מניחים את סטטי SEM בתוך מיקרוסקופ האלקטרונים הממוקד של סריקת קרן היונים.

במחקר זה בוצע פרוטוקול משופר עבור nervus tibialis של העכבר, כמו גם C.elegans כדי להמחיש את השימור והניגודיות האופטימליים לביצוע הדמיית נפח תלת מימדית עם מיקרוסקופ אלקטרונים ממוקד לסריקת קרן יון. פרוטוקולים סטנדרטיים סובלים לעתים קרובות מחוסר ניגודיות קרום שבו כמו הפרוטוקול המשופר מספק ניגוד קרום חזק. תמונות חתך רוחב של C.elegans עם פרוטוקול משופר פרוטוקול סטנדרטי להראות הבדל ייחודי.

בנוסף לתמונות חתך רוחב של nervus tibialis, הפרוטוקול המשופר מסייע להראות ניגוד ממברנה חזק יותר בהשוואה לפרוטוקול סטנדרטי. לאחר העיבוד, נתוני מיקרוסקופ אלקטרונים הם דמיינו באמצעות IMOD, עיבוד תמונה תוכנית מידול. האזור המסומן בכחול מציג אקסונים מקובעים.

האזור המסומן באדום מציג את חבילות Remak. האזורים הצהובים והתפוזים מסומנים בנדן מילין. והאזובן המודגש בצבע טורקיז מראה מיטוכונדריה.

שריד וירטואלי והמודל התלת מימדי ממחישים את ארכיטקטורת הרקמה העדינה ומסייעים להבין את תפקידה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פני בלוק טורי וטומוגרפיה של מערך. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור מיקרוסקופ אלקטרונים שידור וסוגי מדגם אחרים כגון דגימות של מערכת העצבים המרכזית.

אוסיום טטרוקסיד, thiocarbohydrozide, וראניל אצטט הם כימיקלים רעילים ויש להשתמש בהם בזהירות. שף מזיק גם ויש להשתמש בו בזהירות. ציוד מגן אישי כגון כפפות ומעיל מעבדה צריך להיות משוחק עבור הפרוטוקול המלא.