Name: מיקרופוקוס X-ray CT (Microfocus) הדמיה של ההדמיה הסינית ( כיום) , וקסנוטורבלה גניקה (קסנואקואלאמפין) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: למדו הדמיית מיקרו-CT של חסרי חוליות ימיים כמו Actinia equina ו-Xenoturbella japonica. שיטה זו מאפשרת הכנה פשוטה עם חומרים נפוצים ומאפשרת חקירת מורפולוגיה פנימית וחיצונית בפרטים גבוהים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות לתוספקו שירושי לעזרתו ולמתן את סביבת המחקר במהלך מחקר זה. אנו אסירי תודה לקנסוקה יאנאגי ולטקאל איזמי לקבלת ייעוץ בנוגע ל -A. זנב, ומסיוסו טנקה לקבלת ייעוץ בנוגע לדגימה . אנו מודים לצוות במרכז המחקר הימי של שימודה, באוניברסיטת טסוקובה ובתחנה הביולוגית של מיססאקי, אוניברסיטת טוקיו לעזרתם באוספי מדגם. אנחנו רוצים להודות לנומרולאין (www.editage.jp) לעריכת שפה באנגלית. עבודה זו נתמכת על ידי ה-JSPS גרנט בסיוע עבור מדענים צעירים (א) (JP26711022) ל-HN, ו-JAMBIO, האגודה היפנית לביולוגיה ימית.

1. קיבעון
<ol><li>עבור המלון,הרפה את בעלי החיים ב -10% MgCl2 מי ים במשך כ -15 דקות בטמפרטורת החדר. העברה ל 70% אתנול ולאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>עבור harmothoe sp., לשים את החיות על ידי הצבת אותם במי ים קר במשך כ 15 דקות. העברה ל 10% (v/v) פתרון פורמלין עם מי ים וחנות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בשביל להרגיע את החיה באמצעות 7% MgCl2 במים מתוקים. לתקן ב 4% פאראפורמלדהיד (בכיוון הבמה) של מי ים מסוננים בלילה. המקום ב-70% אתנול וחנות ב -4 ° c. התראה: המטה מסוכן ויש לטפל בו בזהירות.</li>
</ol>2. כתמים
<ol><li>להעביר את הדגימות כדי 50% אתנול ולאחסן בטמפרטורת החדר עבור 15 h. החלף את ה 50% אתנול עם האתנול 25% החנות בטמפרטורת החדר עבור 2 h. הערה: אין צורך לדגום את הדגם Harmothoe ב-10% (v/v) בתמיסה עם מי-ים.</li>
	<li>להחליף את הפתרון עם מים מזוקקים (DW) ולאחסן את הדגימות ב-DW בטמפרטורת החדר עבור 2 h. חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>הכינו 25% Lugol פתרון על ידי דילול פתרון המניה (להלן) ל -25% עם DW. פתרון מניות (100% Lugol הפתרון) מכיל 10 גרם של קי ו 5 g של I2, מותאם ל 100 ML עם DW. הערה: לוגול הפתרון הוא רגיש לאור, ולכן לאחסן ולטפל בפתרון מוגן מפני אור. בצע את ההוראות של כל מדינה ומוסד לטיפול יוד וסילוק פסולת.</li>
	<li>Decant DW מן הדגימות ויוצקים ב 25% Lugol הפתרון. . כתם ל -24 שעות בטמפרטורת החדר</li>
</ol>3. הרכבה על הבמה
<ol><li>הכינו 0.5% agarose על ידי המסת 500 mg agarose ב 100 mL של DW ב בקבוקון 250 משנת בקבוק בתוך מיקרוגל (800 W, כ-1-3 דקות). מגניב עד 30-40 ° צ' על ידי שמירה על טמפרטורת החדר. התראה: לא להתחמם או לאטום לחלוטין את הבקבוקון כאשר החימום כדי למנוע את הרתיחה מעל.</li>
	<li>הר דגימות גדולות כגון . זנב באמצעות שפופרת 50 mL. הערה: השתמש בצינורות 50 mL לצורך הרכבה של דגימות גדולות שאינן מתאימות ל-"כחול" מיקרופיפטה 1,000 μL.<ol>
<li>מניחים את המדגם בצלחת 60-mm עם DW לשטוף פתרון כתמים מוגזמת מפני השטח.</li>
		<li>בעדינות לשפוך 5 מ ל של 0.5% agarose לתוך שפופרת 50 mL והרדן את הצמח על קרח. להיזהר לא לעשות בועות בתוך הצמח.</li>
		<li>הוסף בעדינות 20 מ ל של 0.5% agarose לתוך שפופרת ה-mL 50 ומקום על הקרח עד agarose מתחיל הארדן. מניחים את הדגימה בתוך 0.5% agarose באמצעות מלקחיים. להיזהר לא לעשות בועות בתוך הצמח.</li>
		<li>להתאים את המיקום ואת הכיוון של המדגם עם מלקחיים להקשיח את הצמח על הקרח.</li>
		<li>מניחים חימר על הבמה הרכבה microCT ולהגדיר את צינור 50 mL על החימר (איור 2א).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מטען דגימות קטנות כגון Harmothoe sp. ו -X. יפני באמצעות טיפ מיקרופיפטה של 1,000 μl. הערה: לקבלת דגימות קטנות יותר, ניתן להשתמש בתיאור ' צהוב ' מיקרופיפטה 200 μL. במקרה זה, להשתמש 30 μL של agarose עבור התקע ולהוסיף 200 μL של מים מזוקקים או מזוקק.<ol>
<li>לצייר את 100 μL של 0.5% agarose לתוך מיקרופיפיפטה המיקרו-1,000 מיקרו-μL ' כחול ' ולהקשיח את האגקם על ידי החזקת הקצה על הקרח, ביצוע תקע בקצה (איור 2ב-א).</li>
		<li>Decant את המדגם לתוך צלחת 60-mm ללא שימוש מלקחיים.</li>
		<li>בעדינות להעביר את המדגם באמצעות מלקחיים טבעת למנה אחרת 60-mm עם DW לשטוף פתרון כתמים מוגזמת מן המשטח.</li>
		<li>הוסף 1,000 μL של או 0.5% agarose או DW לתוך הקצה המחובר (שלב 3.3.1) באמצעות מיקרופיפטה. הערה: השימוש ב-0.5% agarose מומלץ, אך השתמש ב-DW לקבלת דגימות שבירות או יקרות שבהן יש להימנע ממנה.</li>
		<li>להעביר בעדינות את המדגם ממנה 60-mm לתוך הצמח או DW בקצה מחובר באמצעות מלקחיים טבעת.</li>
		<li>התאימו בעדינות את המיקום והכיוון של המדגם בעזרת מחט פטוקולטה או מלקחיים מדויקים. להיזהר לא לעשות בועות במדיום הגובר. ודא שהמדגם יציב בין קירות העצה כאשר DW משמש כאמצעי טעינה (איור 2D-b). מניחים את הקצה על הקרח כדי להקשיח את agarose אם הוא משמש כמדיום גובר.</li>
		<li>גזור את הקצה מתוך קצה מיקרופיפטה חדש 1,000 μL (איור 2b-b, c) והכנס את קצה הקצה המחובר לקצה החדש.</li>
		<li>מניחים חימר על הבמה הרכבה microCT ולהגדיר את הטיפים עם המדגם בתוך החימר (איור 2C, D). הערה: הפתרון מכתים יתחיל לשטוף את המדגם פעם אחת הוא ממוקם ב-DW, אז להמשיך צעד הסריקה הבא מיד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. סריקת מיקרו-Ct
<ol><li>תדליק את קרן הרנטגן ב 80 kV, 100 μA.</li>
	<li>תוך כדי צפייה בתמונת ה-X-ray במרכז המסך (איור 3א), הזז את השלב כך שניתן יהיה לראות את המדגם כולו על-ידי לחיצה על הלחצנים X ו- Z (איור 3א), ובאופן ידני התאמת כפתור ציר Y בשלב ההרכבה (איור 3B). הגדר את הניגודיות של התמונה כך שניתן יהיה לצפות במבנים הפנימיים על-ידי כוונון תנאי הניגודיות (איור 3A: ניגודיות תמונה).</li>
	<li>כוונן את הכיוון של המדגם על-ידי שינוי זווית השפופרת/עצה בחימר (איור 2 א). סובב את השלב 90 ° על-ידי הגדרת ציר הסיבוב (איור 3א) כדי 90 ולחיצה על לחצן התנועה היחסית (איור 3א). בצע את אותו תמרון ארבע פעמים כדי להשלים סיבוב מלא. הערה: כבה את קרן ה-X באופן ידני בכל פעם שדלת הדגימה נפתחת, אלא אם המערכת תכבה אותה באופן אוטומטי.</li>
	<li>הזז את השלב כך שהמדגם יהיה במרכז התצוגה על-ידי לחיצה על לחצן ציר Z (איור 3א) ובאמצעות התאמה ידנית של כפתור ציר Y בשלב ההרכבה (איור 3ב). להפוך את השלב על ידי 90 ° ולעשות את אותו הדבר. הפעל את השלב 360 ° ובדוק שהמדגם נמצא במרכז התצוגה מכל הכיוונים.</li>
	<li>הזז את הבמה לאורך ציר ה-x לכיוון מקור קרן X-ray על-ידי לחיצה על לחצן ציר x (איור 3א) כדי להגדיל את המדגם ולהתאים לפי הצורך, כך שיתאים לתצוגה (איור 3ג).</li>
	<li>הפעל את השלב 360 ° והתאם לפי הצורך כך שהדוגמה תתאים לתצוגה מכל הכיוונים.</li>
	<li>כוונן את תנאי הסריקה כפי שמוצג בטבלה 1.</li>
	<li>התחל סריקה; זה לוקח בערך 10 דקות.</li>
</ol>5. שחזור תמונה
<ol><li>הפעל את תוכנת העזר של מערכת microCT ( עיין בטבלת החומרים) ופתח את הנתונים הסרוקים.</li>
	<li>כוונן את ההבדלים בציר הסיבוב של המדגם במהלך הסריקה על-ידי לחיצה על לחצן חישוב ערך המשמרת האוטומטי (איור 4א: תיבה ירוקה).</li>
	<li>כוונן את כיוון התמונה על-ידי סיבוב החיצים הכתומים (איור 4ב'). אם הכיוון השתנה, חזור על שלב 5.2.</li>
	<li>לחץ על הכרטיסיה אזור (איור 4ג: מגנטה תיבה) ואזורי חיתוך שבהם הדוגמיות אינן קיימות (איור 4ג: תיבה צהובה).</li>
	<li>לחץ על הכרטיסייה שינוי תצורה (איור 4ד: מגנטה תיבת) ולהגדיר את המסננים כדלקמן כדי להסיר רעש. מסנן טבעת להפחית את המסנן: מסנן חציון-3; מסנן חיסול רעש: ממוצע מסנן -1.</li>
	<li>לבצע תצורה מקדימה על ידי לחיצה על לחצן מינוי תצורה (איור 4ד: תיבת ירוק).</li>
	<li>כוונן בהירות וניגודיות של תמונה על-ידי הגדרת ערכי השחור-לבן כערך שחור 0, ערך לבן 250 (איור 4ד: תיבה כחולה).</li>
	<li>שמור את ערכת הנתונים של תמונת TIFF ששוחזר כ-TIFF של 8 סיביות על-ידי לחיצה על לחצן שמור. שינוי שם של קובצי TIFF כדלקמן: Date_sample_resolution (μm) _ number. TIFF. הערה: הנתונים microCT המקורי ממחקר זה זמינים במאגר תאנה, דוי: 10.6084/m9. תאנה. 767083736.</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>הפעל את תוכנת ניתוח הנתונים (ראה את הטבלה של חומרים) ולאפשר ייבוא של קבצי TIFF על ידי לחיצה על סמל מסד הנתונים (איור 5A: תיבת מגנטה) וכיבוי התיבה המוצגת באיור 5ב.</li>
	<li>לחץ על סמל הייבוא (איור 5ג: מגנטה בתיבה), בחר את ערכת הנתונים שנשמרה בסעיף 5 ולחץ על ' פתח'.</li>
	<li>לחץ על לחצן העתק קישורים (איור 5ד) כדי לייבא את הנתונים.</li>
	<li>הצג את החתך השני על-ידי לחיצה על סמל מציג דו-ממדי (איור 5ג: תיבה כחולה).</li>
	<li>כיול ערכת הנתונים על-ידי לחיצה על הכרטיסיה מציג תלת -ממד (איור 5E: תיבה מגנטה) והזנת ערך הרזולוציה בסריקה (שהיה 0.018 במחקר זה [איור 5F]).</li>
	<li>לחצו על סמל הבהירות/הניגודיות (איור 5E בתיבה ירוקה). כוונן את הבהירות והניגודיות על-ידי הזזת הסמן בתוך התמונה הדו-ממדית המוצגת ושינוי רמת החלון ורוחב החלון (איור 5G).</li>
	<li>בדוק תמונות חוצות-מקטעים אחרות על-ידי הזזת פס הגלילה (איור 5G: box).</li>
	<li>שנה את הכיוון של חתך הרוחב על-ידי לחיצה על סמל הכיוון (איור 5E: תיבה כחולה) ובדוק תמונות בכל הכיוונים (איור 5H).</li>
	<li>לחצו על התמונה המוצגת, ובחרו בכרטיסייה ' ייצוא ' לאחסון תמונות בחתך הרוחב.</li>
</ol>

<ol><li>Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).</li>
<li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+of+fixed+tissue%3A+a+review+from+a+microscopist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).</li>
<li>Greenbaum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+CLARITY%3A+clearing%2C+imaging%2C+and+computational+analysis+of+osteoprogenitors+within+intact+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow.</a> Science Translational Medicine. 9, (2017).</li>
<li>Konno, A., Okazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous-based+tissue+clearing+in+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Letters%22%5BJournal%5D)">Aqueous-based tissue clearing in crustaceans.</a> Zoological Letters. 4, 13(2018).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+comparative+morphology%3A+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiology%22%5BJournal%5D)">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiology. 9, 11(2009).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+developmental+biology%3A+a+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li>
<li>Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+3D+phenotyping+of+cardiovascular+development+in+mouse+embryos+by+micro-CT+with+iodine+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining.</a> Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomographic+imaging+of+intact+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).</li>
<li>Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+three-dimensional+microscopic+imaging+in+marine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology%22%5BJournal%5D)">The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology.</a> Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).</li>
<li>Mizutani, R., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomography+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomography in biology.</a> Micron. 43, 104-115 (2012).</li>
<li>Merkle, A. P., Gelb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ascent+of+3D+X-ray+microscopy+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory.</a> Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).</li>
<li>Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZiegler%2C+A+%22Computation+for+humanity.+Information+technology+to+advance+society%22">Computation for humanity. Information technology to advance society</a>. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).</li>
<li>Gignac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+iodine-based+contrast-enhanced+computed+tomography+%28diceCT%29%3A+an+emerging+tool+for+rapid%2C+high-resolution%2C+3-D+imaging+of+metazoan+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues.</a> Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).</li>
<li>du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+x-ray+micro-computed+tomography%3A+a+user+guideline+for+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples.</a> GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).</li>
<li>Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography%3A+Introducing+new+dimensions+in+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22ZooKeys%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy.</a> ZooKeys. 263, 1-45 (2013).</li>
<li>Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+tissues+in+3D+via+X-ray+tomography%3A+simple+contrasting+methods+allow+high+resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging.</a> PLoS One. 8 (9), 75295(2013).</li>
<li>Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sine+Systemate+Chaos%3F+A+Versatile+Tool+for+Earthworm+Taxonomy%3A+Non-Destructive+Imaging+of+Freshly+Fixed+and+Museum+Specimens+Using+Micro-Computed+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography.</a> PLoS One. 9 (5), 96617(2014).</li>
<li>Paterson, G. L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+using+micro-computed+tomography+in+gross+and+microanatomical+assessments+of+polychaetous+annelids%5BTitle%5D)+AND+%22Memoirs+of+Museum+Victoria%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids.</a> Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).</li>
<li>Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+micro-CT+become+an+essential+tool+for+the+21st+century+taxonomist%3F+An+evaluation+using+marine+polychaetes%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes.</a> Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).</li>
<li>Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+limitations+of+X-ray+micro-computed+tomography+in+arthropod+neuroanatomy%3A+a+methodological+and+comparative+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey.</a> Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).</li>
<li>Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+describing+brooding+in+three+species+of+South+African+brittle+stars%2C+comprising+seven+high-resolution%2C+micro+X-ray+computed+tomography+scans%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans.</a> GigaScience. 4 (1), 52(2015).</li>
<li>Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+king+crab+Hapalogaster+mertensii+Brandt%2C+1850+%28Anomura%3A+Paguroidea%3A+Hapalogastridae%29+-+new+insights+into+the+evolutionary+transformation+of+hermit+crabs+into+king+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Contributions+to+Zoology%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs.</a> Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).</li>
<li>Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+X-ray+micro-computed+tomography+for+soft-bodied+and+gelatinous+cnidarians+with+emphasis+on+scyphozoan+and+cubozoan+statoliths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plankton+Research%22%5BJournal%5D)">Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths.</a> Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).</li>
<li>Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+End+of+the+Cold+Loneliness%3A+3D+Comparison+between+Doto+antarctica+and+a+New+Sympatric+Species+of+Doto+%28Heterobranchia%3A+Nudibranchia%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia).</a> PLoS One. 11 (7), 0157941(2016).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+species+of+Xenoturbella+from+the+western+Pacific+Ocean+and+the+evolution+of+Xenoturbella%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella.</a> BMC Evolutionary Biology. 17, 245(2017).</li>
<li>Tsuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KNOTTED1+Cofactors%2C+BLH12+and+BLH14%2C+Regulate+Internode+Patterning+and+Vein+Anastomosis+in+Maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize.</a> Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).</li>
<li>Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+annelid+anatomy+using+micro-computed+tomography%3A+A+taxonomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Zoologischer+Anzeiger%22%5BJournal%5D)">Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach.</a> Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).</li>
<li>Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+avatars+for+Myriapods%3A+Complete+3D+morphology+of+type+specimens+transcends+conventional+species+description+%28Myriapoda%2C+Chilopoda%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda).</a> PLoS One. 13 (7), 0200158(2018).</li>
<li>Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemones+through+X-rays%3A+visualization+of+two+species+of+Diadumene+%28Cnidaria%2C+Actiniaria%29+using+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22American+Museum+Novitates%22%5BJournal%5D)">Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT.</a> American Museum Novitates. 3907, (2018).</li>
<li>Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+imaging+applied+to+description+of+a+new+species+of+Pagurus+Fabricius%2C+1775+%28Crustacea%3A+Decapoda%3A+Anomura%3A+Paguridae%29%2C+with+selection+of+three-dimensional+type+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data.</a> PLoS One. 13 (9), 0203107(2018).</li>
<li>Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+micro-computed+tomography+as+a+minimally+invasive+tool+for+anatomical+study+of+bivalves+%28Mollusca%3A+Bivalvia%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Journal+of+the+Linnean+Society%22%5BJournal%5D)">The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia).</a> Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).</li>
<li>Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSasaki%2C+T+%22Biomineralization%22">Biomineralization</a>. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).</li>
<li>Maeno, A., Tsuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+Tomography+to+Visualize+Vascular+Networks+in+Maize+Stems%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems.</a> Bio-protocol. 8 (1), 2682(2018).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+to%3A+A+new+species+of+Xenoturbella+from+the+western+Pacific+Ocean+and+the+evolution+of+Xenoturbella%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella.</a> BMC Evolutionary Biology. 18, 83(2018).</li>
<li>Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+files+from+%27Microfocus+X-ray+computed+tomography+%28microCT%29+imaging+of+Actinia+equina+%28Cnidaria%29%2C+Harmothoe+sp.+%28Annelida%29%2C+and+Xenoturbella+japonica+%28Xenacoelomorpha%29%27%5BTitle%5D)+AND+%22figshare%22%5BJournal%5D)">MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'.</a> figshare. , (2019).</li>
<li>Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+specimen+shrinkage+in+iodine-enhanced+microCT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT.</a> Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).</li>
<li>Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+shrinkage+of+bone%2C+brain+and+muscle+tissue+in+sample+preparation+for+micro-CT+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+%28LSFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM).</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).</li>
<li>Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+of+mechanical+inaccuracies+in+micro-CT+and+nano-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT.</a> Proceedings of SPIE. 7078, 70781(2008).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

תיקונים באמצעות פורמלין, כגון 10% (v/v) הפתרון של מי ים בשימוש במחקר זה, ידועים כדי לשמר את המבנה של חסרי חוליות מגוונות ימיים ומשמשים לעתים קרובות הדמיה microct18,24,25 ,26,28,30,33. עם זאת, ההגבלות על השימוש בכימיקלים זה הפכו קפדנית במדינות מסוימות בשנים האחרונות, ותחליפים כגון פאראפורמלד...

בדרך כלל, חוקרים ביולוגיים היו צריכים לעשות קטעים דקים ולבצע תצפיות על ידי מיקרוסקופ אור או אלקטרון כדי לחקור את המבנים הפנימיים של אורגניזמים אטומים. עם זאת, שיטות אלה הן הרסניות ובעייתיות כאשר הם מוחלים על יצורים נדירים או יקרי ערך. יתר על כן, מספר שלבים בשיטה, כגון הטבעה והפחתה, הם זמן רב, והוא יכול להימשך מספר ימים כדי להתבונן במדגם, בהתאם לפרוטוקול. יתר על כן, בעת טיפול בסעיפים רבים, תמיד יש אפשרות להזיק או לאבד חלקים מסוימים. טכניקות ניקוי רקמות זמינים עבור כמה דגימות1,2,3,4,5 אך אינם ישימים עדיין עבור מינים רבים של בעלי חיים.
כדי להתגבר על בעיות אלה, כמה ביולוגים החלו להשתמש microfocus רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (microfocus) הדמיה6,7,8,9,10,11, . 12,13,14,15 ב-X-ray CT, המדגם הוא הוקרן עם קרני רנטגן מזוויות שונות הנוצרות ממקור X-ray נע סביב המדגם, ואת הרנטגן המשודר מנוטרים על ידי גלאי כי גם נע סביב המדגם. נתוני שידור הרנטגן שהושגו מנתחים כדי לשחזר תמונות בחתך הרוחב של הדגימה. שיטה זו מאפשרת התבוננות של מבנים פנימיים ללא הרס של המדגם. בשל בטחונו וקלות, הוא משמש בדרך כלל ביישומים רפואיים ושיניים, וניתן למצוא מערכות CT בבתי חולים ובמרכזי שיניים ברחבי העולם. יתר על כן, רנטגן תעשייתי CT משמש לעתים קרובות להתבוננות בדגימות לא רפואי עבור בדיקה מטרולוגיה בתחום התעשייה. בניגוד CT רפואי, שבו המקור רנטגן וגלאי הם ניידים, שני החלקים הם קבועים CT תעשייתי, עם המדגם מסתובבת במהלך הסריקה. CT תעשייתי בדרך כלל מייצרת תמונות ברזולוציה גבוהה יותר מאשר CT רפואי והוא המכונה microCT (ברמת מיקרומטר ברמה) או nanoCT (רזולוציה ברמת נאנמטר). לאחרונה, מחקר באמצעות microct גדל במהירות בתחומים שונים של ביולוגיה14,15,16,17,18,19, מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , בת 24 , מיכל בן 25 , מיכל בן 26 , בן 27 , מיכל בן 28 , בן 29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33 , 34.
מחקרים ביולוגיים באמצעות CT ממוקדות בתחילה מבנים פנימיים המורכבים בעיקר של רקמה קשה, כגון עצם. ההתקדמות טכניקות צביעת שימוש בחומרים כימיים שונים אפשרה ויזואליזציה של רקמות רכות באורגניזמים שונים6,7,8,9,14,15 , מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , בת 24 , מיכל בן 25 , מיכל בן 26 , בן 27 , מיכל בן 28 , בן 29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33 , 34. של אלה ריאגנטים, מבוססי יוד סוכנים בניגוד הם בטוחים יחסית, זול, והוא יכול לשמש להדמיה של רקמות רכות באורגניזמים שונים7,14. בנוגע לחסרי חוליות ימיים, microct נעשה שימוש נרחב על בעלי חיים כגון רכיכות6,25,32,33, annelids18,19, מיכל בן 20 , 28, וארתוראופהלחמה21,23,29,31. עם זאת, היו דיווחים מעטים על החיה האחרת phyla, כמו bryozoans6, xenacoelomorphs26, ו קטריגרים24,30. באופן כללי, היו פחות מחקרים באמצעות microCT על חסרי חוליות ימיים מאשר אלה על בעלי חוליות. אחת הסיבות העיקריות לשימוש מוגבל זה על חסרי חוליות ימיים הוא מגוון עצום שנצפו בבעלי חיים אלה. בגלל הגדלים המגוונים, הורפולוגיות והפיזיולוגיות שלהם, כל מין מגיב בצורה שונה להליכים ניסיוניים שונים. לכן, זה הכרחי במהלך הכנת המדגם לבחור את הקיבעון המתאים ביותר והכתים מגיב, ולקבוע תנאים בכל שלב, מותאם לכל מין. באופן דומה, יש צורך גם להגדיר את תצורות הסריקה, כגון שיטת ההרכבה, מתח, זרם, שיעור מגדילה מכני, ואת עוצמת רזולוציית החלל, בהתאם לכל מדגם. כדי להתגבר על בעיה זו, מדריך פשוט ומובן המכסה את כל הצעדים הנחוצים, מסביר כיצד ניתן לכוונן כל שלב בהתאם לדגימה, ומציג דוגמאות מפורטות מדגימות מרובות.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים את פרוטוקול הדמיה microCT צעד אחר צעד, מתוך קיבעון דגימה לניתוח נתונים, באמצעות שלושה מינים חסרי חוליות ימיים. בסמוך לתחנה הביולוגית של מיססאקי, האוניברסיטה של טוקיו, נאספו דגימות של שושנת הים באקניה (אנתותים). היה להם גוף רך וכדורי שהיה בקוטר של 2 ס מ (איור 1A-C). Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) דגימות נאספו גם ליד תחנת מיססאקי ימית ביולוגית. הם היו תולעים דק שהיו כ 1.5 ס מ אורך, עם chaetae קשה הנוכחי לאורך כל הגוף (איור 1D). הדגימה של Xenoturbella35 (Xenoturbella, Xenacoeloma) מדגם נאסף ליד שימודה ימית מרכז המחקר, אוניברסיטת טסוקובה, במהלך ה -13 החוף jambio האורגניזם משותף סקר. הייתה זו תולעת עדינה שהייתה כ-0.8 ס מ אורך (איור 1E). התאמות שבוצעו עבור התנאים והתצורות של כל מדגם מוסברות בפרוטרוט. המחקר שלנו מספק מספר הצעות על איך לבצע הדמיה microCT על חסרי חוליות ימיים, ואנו מקווים כי זה יהיה השראה ביולוגים להשתמש בפרוטוקול זה עבור המחקר שלהם.

<table><tbody><tr><td>בקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל</td><td>CLS430183</td><td></td><td>צינור</td></tr><tr><td>דגימה ST-500</td><td>BIO-BIK</td><td>103010</td><td></td></tr><tr><td>צינור פוליפרופילן 50 מ"ל</td><td>Greiner Bio One International</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>צלחת לא מטופלת 60 מ"מ</td><td>IWAKI</td><td>1010-060</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>קצה כיתה אקולוגית (כחול) 1000 ומיקרו; l</td><td>BMBio</td><td>BIO1000RF</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Wako תעשיות כימיות טהורות</td><td>057-00451</td><td></td></tr><tr><td>פורמלין</td><td>וואקו תעשיות כימיות טהורות</td><td>061-00416</td><td></td></tr><tr><td>יוד</td><td>וואקו תעשיות כימיות טהורות</td><td>094-05421</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידראט</td><td>וואקו תעשיות כימיות טהורות</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>OsiriX DICOM Viewer</td><td>Pixmeo SARL</td><td>OsiriX MD v10.0</td><td></td></tr><tr><td>https://www.osirix-viewer.com Paraformaldehyde</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>מחט פטוטרת</td><td>AS ONE</td><td>2-013-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P200 Micropipette</td><td>GILSON</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000 מיקרופיפטה</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן יודיד</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>166-03971</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מדויקת 5</td><td>DUMONT</td><td>0302-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>QuickRack MultI קצה מתאים (צהוב) 200 ul</td><td>Sorenson</td><td>10660</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>נוצה</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>טבעתית NAPOX</td><td>A-26</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאוסקופי</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיית מיקרו-CT רנטגן</td><td>Comscantechno</td><td>ScanXmate-E090S105</td><td></td></tr></tbody></table>

מיקרופוקוס x-ray ct (microfocus) הדמיה של ההדמיה הסינית ( כיום) , וקסנוטורבלה ג'ניקה (קסנואקואלאמפין)

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

באופן מסורתי, ביולוגים נאלצו להסתמך על שיטות הרסניות כגון הסתמכות על מנת לחקור את המבנים הפנימיים של אורגניזמים אטומים. שאינם הרסניים מיקרופוקוס רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (Microfocus) הדמיה הפכה לפרוטוקול עוצמה והמתעוררים בביולוגיה, בשל פיתוחים טכנולוגיים בשיטות מכתים לדוגמה וחידושים בחומרה Microfocus, עיבוד מחשבים, ונתונים תוכנות ניתוח. עם זאת, פרוטוקול זה אינו משמש בדרך כלל, כפי שהוא בשדות הרפואיים והתעשייתיים. אחת הסיבות לשימוש מוגבל זה היא העדר מדריך פשוט ומובן המכסה את כל השלבים הדרושים: אוסף לדוגמה, קיבעון, כתמים, הרכבה, סריקה, ניתוח נתונים. סיבה נוספת היא מגוון עצום של מטזואים, במיוחד חסרי חוליות ימיים. בגלל המידות המגוונות, המורפולוגיות והפיזיולוגיות, חיוני להתאים את התנאים הניסיוניים ותצורות החומרה בכל שלב, בהתאם למדגם. כאן, שיטות הדמיה microCT מוסברים בפירוט באמצעות שלושה שונים בעלי חוליות ים ימיים מגוונים: הפיניה שווה (האנטיתים, Cnidaria), Harmothoe Sp. (Polychaeta, אנאלאידה), ו xenoturbella יפני ( . קסנוטורסלדה, קסנאקומורפין הצעות על ביצוע הדמיה microCT על בעלי חיים שונים מסופקים גם.

בוצעו הדמיה microct על A. זנב (האנטיתים, cנדבך), harmothoe sp. (polychaeta, annelida), ו X. יפני (xenoturda, xenacoeloma) לאחר צביעת דגימות עם 25% lugol פתרון. הצביעת הגדילו בהצלחה את הניגודיות של המבנים הפנימיים בכל הדגימות, דבר המאפשר תצפיות של רקמות רכות פנימיות (איור 6). יחד עם דו חות העבר6,7,16,19,22</sup...

כאן, פרוטוקולים לביצוע מיקרופוקוס רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (Microfocus) הדמיה של שלושה חיות חסרי חוליות ימיים מוסברים בפרוטרוט. מחקר זה מתאר שלבים כגון קיבעון לדוגמה, כתמים, הרכבה, סריקה, שחזור תמונה, וניתוח נתונים. הצעות לגבי אופן ההתאמה של הפרוטוקול עבור דגימות שונות מסופקות גם כן.

מיקרופוקוס X-ray CT (Microfocus) הדמיה של ההדמיה הסינית ( כיום) , וקסנוטורבלה ג'ניקה (קסנואקואלאמפין)

Traditionally, biologists have had to rely on destructive methods such as sectioning in order to investigate the internal structures of opaque organisms. ...

מיקרו CT לא הוחל באופן נרחב על חסרי חוליות ימיים בשל המגוון שלהם במורפולוגיה. השיטה שלנו מאפשרת הרכבה קלה של דגימות בכל זווית שמתאימה למורפולוגיה שלה. זה יכול להתבצע עם חומרים נפוצים, כגון מים, חימר, צינורות, ואם ישים, דגימות עם מגוון רחב של צורות, מתולעת ארוכה לכדור עגול.הדגמת ההליך תהיה אקיטרו Maeno, טכנאי במכון הלאומי לגנטיקה, יפן. כדי להתחיל, להכין 0.5% agarose על ידי המסת 500 מיליגרם של אגרוז ב 100 מיליליטר של מים מזוקקים בבקבוק חרוט 250 מיליליטר, ול מניחים את הבקבוק במיקרוגל בכח של 800 וואט כדי לחמם כ 1 עד 3 דקות. מקררים את הבקבוק בטמפרטורת החדר.כדי להרכיב דגימות גדולות שאינן מתאימות לקצה כחול מיקרופיפיט 1000 מיקרוליטר, כגון A.equina, במקום הראשון את המדגם המוכתם בצלחת 60 מ"מ עם מים מזוקקים לשטוף את פתרון כתמים מוגזם מפני השטח. בצינור של 50 מיליליטר, יוצקים בעדינות חמישה מיליליטר של 0.5% מבלי לייצר בועות. מניחים את הצינור על הקרח כדי להקשיח את ההתעוררות.לאחר מכן הוסיפו 20 מיליליטר של 0.5% לצינור, מניחים על הקרח עד שהאגוז מתחיל להתקשות, ולהשתמש במדפים כדי למקם את הדגימה בתוך ההתעוררות. התאם את מיקום הדגימה כך שציר הגוף שלה יהיה אנכי. להקשיח את ההתעוררות על קרח.מניחים חימר על שלב ההרכבה microCT ולהגדיר את הצינור 50 מיליליטר על החימר. כדי להרכיב דגימות קטנות המתאימות לקצה כחול מיקרופיגט 1000 מיקרוליטר, כגון הרמות'ו sp. ו- X.japonica, decant המדגם המוכתם לתוך צלחת 60 מילימטר ללא שימוש במדפים.עם פינצטה טבעתית, מעבירים בעדינות את הדגימות לתבשיל נוסף של 60 מ"מ מלא במים מזוקקים כדי לשטוף תווי כתם מוגזמים מפני השטח. לאחר מכן, ציירו 100 מיקרוליטרים של 0.5% התעוררו לתוך קצה כחול מיקרופיפיט 1000 מיקרוליטר והצב אותו על קרח כדי להקשיח. בעת טיפול הרמות'ו sp.להוסיף 1000 microliters של 0.5% agarose לתוך תקע אגרוז בקצה. השתמש פינצטה טבעת להעביר בעדינות הרמות'ו sp. מן המנה 60 מילימטר לתוך הפתרון agarose בקצה.עם מחט petiolate או פינצטה מדויקת, להתאים את המיקום ואת הכיוון של sp. Harmothoe כך chaetae אינם כפופים באופן לא טבעי. ודאו שאין בועות, ולאחר מכן מניחים את הקצה על הקרח כדי להקשיח את ההתעוררות.כאשר מטפלים בדגימות שבריריות כמו X.japonica, השתמשו במיקרופיגט כדי להוסיף 1000 מיקרוליטרים של מים מזוקקים לקצה הכחול עם תקע אגרוז מוקשח. מקם את X.Japonica במים מזוקקים, כך שהוא יציב בין הקירות של הקצה. עבור דגימות קטנות יותר, ניתן להשתמש בקצה צהוב מיקרופיפיט 200 מיקרוליטר.במקרה זה, השתמש 30 microliters של agarose עבור התקע, ולהוסיף 200 microliters של אגרוז או מים מזוקקים. לאחר מכן, חותכים את הקצה של קצה כחול micropipette חדש, 1000 מיקרוליטר, ולהכניס את קצה הקצה המחובר לתוך הקצה החדש. מניחים חימר על שלב ההרכבה microCT ולהגדיר את הטיפים עם המדגם בפנים על החימר.מיד לאחר הרכבת הדגימות, הפעל את קרן הרנטגן ב 80 קילו-וולט ו 100 מיקרואמפ. תוך כדי התבוננות בתדמית שידור קרני הרנטגן, הזיזו את הבמה כך שניתן יהיה לראות את המדגם כולו על ידי לחיצה על כפתורי ציר x ו- z, ועל ידי כוונון ידני של ידית ציר y על במת ההרכבה. התאימו את תנאי החדות של התמונה כך שניתן יהיה לצפות במבנים הפנימיים.התאם את כיוון המדגם על ידי שינוי זווית הצינור בחימר. סובב את השלב ב- 90 מעלות על-ידי הגדרת ציר הסיבוב ל- 90 ולחיצה על לחצן תנועה יחסית. בצע את אותו תמרון ארבע פעמים כדי להשלים סיבוב מלא.כבה ידנית את קרן הרנטגן בכל פעם שהדלת לדוגמה נפתחת, אלא אם המערכת מכבה אותה באופן אוטומטי. עכשיו לחץ על כפתור ציר z ולהתאים באופן ידני את הידית ציר y כדי להזיז את שלב ההרכבה, כך המדגם הוא במרכז התצוגה. להפוך את הבמה על ידי 90 מעלות ולהתאים את המדגם למרכז שוב.להפוך את השלב 90 מעלות שלוש פעמים נוספות, ולהתאים לפי הצורך כדי להיות בטוח כי המדגם נמצא במרכז הנוף מכל הכיוונים. לאחר מכן, לחץ על לחצן ציר הרנטגן כדי להזיז את הבמה לאורך ציר ה- x לכיוון מקור קרן הרנטגן כדי להגדיל את הדגימה, ולהתאים לפי הצורך כך שהיא תתאים רק לתצוגה. סובב את הבמה והתאם לפי הצורך כדי לוודא שהדגימה מתאימה לתצוגה מכל הכיוונים.כוונן את תנאי הסריקה ולאחר מכן התחל בסריקה. בניסוי זה, הדמיית microCT בוצעה על אקטין אקווינה, הרמות'ו sp. ו Xenoturbella japonica לאחר הכתם עם 25% הפתרון של Lugol.הכתמים שיפרו בהצלחה את הניגודיות של המבנים הפנימיים בכל הדגימות, ואפשרו תצפיות על רקמות רכות פנימיות. שיטה זו ישימה דגימות שבירות גם עם נזק חיצוני, כפי שניתן לראות מן הדגימה X.japonica עם אפידרמיס פגום קשות. ערכת נתונים אחת ברזולוציה גבוהה של דגימה שלמה שוחזרה עבור הרמות'ו sp.ו-X.japonica מסריקות מרובות שבוצעו בחלקים שונים אך חופפים של הדגימה. הקפד להגדיר את המדגם בצינור או בקצה ולהסתדר הצינור או קצה microCT, כך שהוא לא זז במהלך הסריקה. הנתונים המתקבלים מהליך זה יכולים לשמש לשחזורי תמונה תלת-מימדיים, המאפשרים לחוקר להבין באופן מלא הן מורפולוגיה פנימית והן מורפולוגיה חיצונית של המדגם.כל מערכות המיקרו-CT משתמשות בקרני רנטגן, אך הפרטים עשויים להיות שונים ממערכת אחת לאחרת, לכן הקפד לעקוב מקרוב אחר ההוראות של כל מערכת.

microfocus-x-ray-ct-microct-imaging-actinia-equina-cnidaria-harmothoe

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

השתמשנו synchrotron רנטגן טומוגרפיה במתקן האירופי קרינה Synchrotron (ESRF) אל הלא פולשני לייצר 3D מערכי נתונים טומוגרפית עם רזולוציה פיקסל של 0.7μm. באמצעות עיבוד תוכנה נפח, זה מאפשר את שיקום מבנים פנימיים במצב הטבעי שלהם, ללא חפצים המיוצר על ידי חתך היסטולוגית.

לא פולשני-3D ויזואליזציה עם תת מיקרון החלטה שימוש Synchrotron-X-ray-טומוגרפיה

ניגודיות משופרת כלי שיט קטן בעל חיים הדמיה על ידי microCT היא מהירה, חסכונית תפוקה גבוהה טכניקה...

כלי משופר ניגודיות הדמיה באמצעות MicroCT

Non-הרסני להדמיה נפח יכולה להיות מושגת רק על ידי טכניקות טומוגרפית, מתוכם היעילה ביותר היא טומוגרפיה רנטגן מיקרו ממוחשבת (CT).

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של Ex-Vivo דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרו-CT

מקור: Choi, J. P.  ואחרים. אינדוקציה והדמיית מיקרו-CT של מומים במערות המוח במודל עכבר. J. Vis. exp. ( 2017)} סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיית מיקרו-CT כדי להמחיש נגעים של מום מערות מוחי (CCM) במוח של עכבר. הוא מפרט את השלבים להכנת דגימה, הדמיה ושחזור תמונה תלת מימדית כדי להעריך את הצפיפות והמיקום של נגעי CCM ברקמת המוח.

הדמיית מיקרו-CT משופרת ניגודיות של נגעי מום במערות המוח במוח עכבר

נייר זה מציג את השיטות המשמשות לחיטוט כימי מרחבית מתואמת, מבני, ותכונות מכאניות של קנה המידה רב שכבתית של מרית Atractosteus (מרית א ') באמצעות nanoindentation, התמרת אינפרא אדום ספקטרוסקופיה (FTIR), במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), וה-X ray טומוגרפיה ממוחשבת (CT רנטגן). תוצאות הניסוי שנעשו שימוש כדי לחקור את עקרונות העיצוב של חומרים ביולוגיים מגן.

אפיון של קשקשים דגים שכבתיים Multi-(<em&gt; מרית Atractosteus</em&gt;) באמצעות Nanoindentation, רנטגן CT, FTIR, וSEM

חבילה משולבת של טכניקות הדמיה יושמה כדי לקבוע מורפולוגיה פוליפ ומבנה רקמה בannularis Montastraea אלמוגי האיים הקריביים ומ ' faveolata. הקרינה, פנים בלוק סדרתי, ומיקרוסקופ סריקת לייזר confocal שני פוטונים זיהו מבנה lobate, קירות פוליפ, וchromatophore מוערך וצפיפויות zooxanthellae והפצות.

Multimodal שיטות מיקרוסקופית אופטיות לחשוף רקמות מורפולוגיה ומבנה פוליפ בקריביים אלמוגי בניית ריף

אנו מדגימים את השימוש בשיטות מיקרוסקופיה שונות השימושיות בהתבוננות בהסתיידות של תולעת צינור, Hydroides elegans, כמו גם באיתור ואפיון החומר המסוייד הראשון. מיקרוסקופיה חיה ומיקרוסקופ אלקטרונים משמשים יחד כדי לספק מידע פונקציונלי וחומרי החשוב בחקר ביו-מינרליזציה.

אפיון של אירועים קלציפיקציה שימוש אופטי חיה מיקרוסקופית אלקטרונים טכניקות בתוך ימית תולעת-שפופרת

אנחנו פיתח פרוטוקולים ועוצב מנגנון מותאם אישית כדי לאפשר הטבעה של מילימטר-סולם דגימות. אנו מציגים מדגם הכנת נהלים תוך שימת דגש על הטמעת שרף אקרילי, פוליאימיד אבובים להשיג הנייח נוקשה, אחסון לטווח ארוך של דגימות לחקירה הרקמה תא ואדריכלות מורפולוגיה של...

נוקשה ההטמעה של קבוע, צבעונית, ככלל, דגימות מילימטר-סולם עבור היסטולוגיה ללא סעיף תלת-ממד על-ידי מיקרו-שחושב טומוגרפיה

פלואורומטר קצב חזרה מהיר (FRRf) היא שיטה מועילה למדידת פוטו-פיזיולוגיה של פוטו-מערכת II ופרודוקטיביות ראשונית. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד פוטופיזיולוגיה PSII של אצה אפיזואית, Colacium sp. על מצע zooplankton באמצעות FRRf סוג cuvette.

מדידת פוטופיזיולוגיה של השלב המצורף של קולאקיום sp. על ידי פלואורומטר קצב חזרה מהירה מסוג Cuvette

Micro-CT הוא כלי לא הרסני שיכול לנתח מבנים צמחיים בתלת מימד. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכנת הדגימה כדי למנף מיקרו-CT לניתוח מבנה ותפקוד צמחים טפיליים. מינים שונים משמשים כדי להדגיש את היתרונות של שיטה זו בשילוב עם תכשירים ספציפיים.

מינוף סריקת מיקרו-CT לניתוח אינטראקציות טפיליות בין צמח למארח

למדו הדמיית מיקרו-CT של חסרי חוליות ימיים כמו Actinia equina ו-Xenoturbella japonica. שיטה זו מאפשרת הכנה פשוטה עם חומרים נפוצים ומאפשרת חקירת מורפולוגיה פנימית וחיצונית בפרטים גבוהים.

מיקרופוקוס X-ray CT (Microfocus) הדמיה של ההדמיה הסינית ( כיום) , וקסנוטורבלה ג'ניקה (קסנואקואלאמפין)

גלה סרטונים נוספים