Name: בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: חקור דינמיקת סידן בשרירי דופן של C. elegans באמצעות הדמיה in vivo. שיטות ההכנה באמצעות חיתוך או ננו-חלקיקים מאפשרות מעקב אחר שינויים מהירים ברמות הסידן התוך-תאיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד ר אלכסנדר גוטשאלק עבור ZX1659, RCaMP והמתקשרים המכילים זן התולעת, ד ר Hongkyun קים עבור מאמץ התולעת איטי-1 (eg142) , ואת הפרויקט הלאומי Bioresource עבור מאמץ של לסרוק -1 (tm5339) תולעת.

1. התקנת מיקרוסקופ
<ol><li>השתמש במיקרוסקופ מורכב עם יכולות של קרינה פלואורסצנטית. עבור מחקר זה, הנתונים נאספו על מיקרוסקופ זקוף (טבלת חומרים) מצויד נוריות עבור עירור.</li>
	<li>כדי להמחיש כראוי שינויים בעלי קרינה פלואורסצנטית שרירי הגוף, להשתמש במטרה הגדלה גבוהה.<ol>
<li>לקראת ההכנות לגזור, השתמש ב 60x NA 1.0 המים מטרה טבילה (טבלת חומרים).</li>
		<li>להכנות באמצעות nanobeads, השתמש ב-60x NA 1.4 מטרה טבילה שמן (טבלת חומרים). הגדלה זו מבטיחה רזולוציה מספקת של השרירים על חיישן המצלמה.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש במצלמה רגישות גבוהה מחוברת למיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות בקצב מסגרת גבוהה כדי לעקוב אחר שינויים מהירים ברמות הסידן. עבור מחקר זה, תמונה עם מערכת sCMOS (טבלה של חומרים) מסוגל הדמיה מסגרת מלאה ב 100 Hz, כזמני עלייה עבור Ca 2 + אותות יכול להיות מהיר כמו עשרות אלפיותהשני .</li>
	<li>בקרת רכישת מצלמה ועירור הזריחה LED עם תוכנה מיקרו מנהל פועל ImageJ10 על פי הוראות היצרן (טבלת חומרים).</li>
	<li>השתמש בקוד פתוח לפלטפורמה אלקטרונית, אשר מחבר לוח מיקרובקר חיצוני בקוד פתוח (טבלת חומרים), כדי לנהל את פולסים העיתוי החיצוני כדי לשלוט על עירור הקרינה. הערה: מקטעים דיגיטליים זמינים מפינים דיגיטליים 8 עד 13 המספקים סיביות פלט 0 עד 5. אלה יכולים להיות ממוען כבסיס 2 ערכים של 1, 10, 100, וכו '. הגדרות יציאה טורית מסומנות בטבלה 1 וזמינות מהאתר של מיקרו-מנהל (טבלת חומרים). הקושחה ללוח המיקרו-בקר זמינה באתר זה באופן דומה.</li>
	<li>כדי לשלוט בלוגיקת התזמון, הפעל את פרוטוקול הרכישה המירומגר בתוכנה בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים). הערה: זה במקביל יוזם מצלמה מוגדרת מראש משך מסגרת ואת מספר מסגרות להיות מופעל, כמו גם את התריס הלוגי מראש הנורית הקבועה לעירור של הזריחה. במקרה זה, כתום LED בורר מצב מוצק נשלט על ידי פלט מיקרו סיבית 1 דרך pin 9. המצלמה מסגרת את TTL (צלחת האחורי out 3 מחבר) מפעיל מעורר. זה בדיוק הזמן ההפעלה של האור הכחול LED להפעלת המתקשרים בזמן קבוע לאחר הפעלת רצף ההדמיה.</li>
	<li>כדי לעורר את המתקשרים עם אור כחול ושינויי שיא RCaMP, השתמש בשני נוריות. הפעל מתקשר עם LED עם השיא פליטת אורך הגל של 470 ננומטר ו מסנן bandpass (455 כדי 490 nm) ולהלהיב RCaMP עם LED עם גל פליטת שיא של ה594 ננומטר ו מסנן bandpass (570 כדי 600 nm).</li>
	<li>כדי להפעיל בו את המתקשרים וללכוד שינויים ברמות פלורסנט RCaMP, להאיר שיתוף הן נוריות ולהעביר את האור לאותו נתיב אופטי באמצעות מדיקרואיק קרן.</li>
	<li>שלוט בעיתוי של תאורה LED עם מתגי מצב מוצק (טבלת חומרים) נשלט על ידי אותות TTL (מקסימום מדורג בזמן הפעלה, 1 ms, לבטל את הזמן 0.3 ms: 0 כדי 90% הפעלה ולכבות את הזמן של < 100 μs).</li>
	<li>הגדר את עוצמת ה-LED באמצעות ספקי כוח ליניארי מבוקרים הנוכחיים של רעש נמוך (טבלת חומרים).</li>
	<li>כדי להבטיח את התזמון המדויק של נורית האור הכחולה, הפעל אותו ישירות על-ידי פעימת TTL לממסר המצב המוצק מגירוי. הפעל את פרוטוקול גירוי האור הכחול לתוך מתכנת (טבלת חומרים), המשמשת כטיימר מדויק מתחילת רכישת התמונה לתאורת LED כחולה. בניסוי זה, להפעיל גירוי באור כחול לאחר 2 s של לכידת RCaMP פלואורסצנטית בלבד ולהשתמש ברכבת של 5, 2 ms פולסים אור כחול עם 50 ms מרווחי הזמן הinterpulse כדי להפעיל את המתקשרים. הערה: העיכוב לפני פולסים באור כחול, משך הפולסים באור הכחול, הזמן שבין הפולסים, ומספר הפולסים ברכבת יכול להיות מוגדר בשלב זה ולשקף את הפרמטרים הספציפיים של עניין ניסיוני.</li>
</ol>2. ג. אלגיה הכנה לדוגמא ורכישת נתונים
<ol><li>כדי לעורר באופן מיסטי נוירונים טרום סינפטיות, להשיג בעלי חיים ביטוי המתקשרים הcholinergic הנוירונים, מונע עם האזור מקדם unc-17 , ו rcamp הביע בכל השרירים קיר הגוף מונחה עם היזם myo-3 אזור2. הערה: רק השימוש בבעלי חיים עם טרנסגנים משולבים ורמות עמידות של קרינה פלואורסצנטית מומלצים כביטוי המשתנה בסוגי התאים המתאימים עלול להשפיע על האמינות של רכישת נתונים.</li>
	<li>לעשות מלאי עבודה של כלטרנס ברשתית על ידי דילול אבקת הרשתית (טבלה של חומרים) באתנול כדי ליצור ריכוז סופי של 100 מ"מ ולאחסן ב-20 ° c. מלאי עבודה זה יהיה יציב למשך כשנה אחת.</li>
	<li>צור מלאי של OP50 E. coli, גדל ב-LB מדיה, שיושלם עם הרשתית כלטרנס מהמלאי עובד שנעשו בשלב 2.2, בריכוז הסופי של 80 μm. הכרך המשמש למניה OP50 + רשתית יהיה תלוי במספר הלוחות הנחוצים לניסוי.</li>
	<li>זרעים נמטודות הצמיחה מדיה (ngm) צלחות עם כ 300 μl של OP50 + מניות רשתית ולאפשר צלחות להתייבש בלילה בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>לגדול C. אלגיה זנים לגיל הרצוי בחושך על OP50 + לוחות ngm רשתית ב 20 ° c. , בשביל הניסוי הזה. תשתמשו בתולעים למבוגרים<ol>
<li>עבור הניסוי באמצעות הכנת גזור, רק להשתמש gravid למבוגרים תולעים כמו ביצוע הניתוח על הצעיר, בעלי חיים קטנים יותר הוא מאתגר מאוד. השאירו את החיות על הצלחות OP50-רשתית למינימום של 3 ימים עבור הפעלה המתקשר יעיל.</li>
	</ol></li>
	<li>אם משתמשים בתכשיר ההכנה לגזור8,11 (איור 1א), בצעו ניתוח באור נמוך.<ol>
<li>מקום בעלי חיים בצלחת מבתר עם בסיס coverslip מצופה סיליקון כי הוא מתמלא 1 מ"מ Ca2 + פתרון מסחטות המורכב של 150 MM הנאקל, 5 מ"מ kcl, 1 מ"מ cacl2, 4 מ"מ mgcl2, 10 מ"מ גלוקוז, 5 מ"מ מילימטר, ו 15 מ"מ hepes (pH 7.3 ,-340 osm).</li>
		<li>הדבק בעלי חיים באמצעות דבק עור אקטואלי נוזלי עם צביעה כחול לאורך הצד השני של התולעת ולעשות חתך קוטיקולה לרוחב לאורך ממשק הדבק/תולעת באמצעות מחטים זכוכית.</li>
		<li>השתמש בפיפטה בפה כדי לנקות את מעיים הפנים מחלל התולעת.</li>
		<li>הדבק את כנף הקוטיקולה של בעל החיים כדי לחשוף את השרירים קיר הגוף המדילי להדמיה.</li>
	</ol></li>
	<li>אם משתמשים בתכשיר להכנת nanobead (איור 1B)<ol>
<li>הפוך פתרון מותכת 5% agarose באמצעות ddH2O לנפח הסופי של 100 mL.</li>
		<li>באמצעות הפיפטה פסטר, מניחים טיפה של הפתרון agarose מותכת על שקופית זכוכית ומיד מניחים שקופית זכוכית שנייה מעל החלק העליון, בניצב הראשון, באמצעות לחץ עדין כדי ליצור כרית agarose אפילו. הסר את השקופית העליונה לפני השימוש.</li>
		<li>הוסף כ 4 μL של פוליסטירן nanobeads (טבלת חומרים) לאמצע כרית agarose.</li>
		<li>באור נמוך, לקחת 4-6 C. אלגיה לתוך הפתרון nanobead, בטוח בעלי חיים לא שוכב אחד על השני, ובזהירות המקום שמיכות על גבי.</li>
	</ol></li>
	<li>מניחים את השקופית המוכנה או את הצלחת לחיתוך על המיקרוסקופ, ולמצוא ולהתמקד תולעת באמצעות הגדלה 10x ו עמעום שדה בהיר התאורה.</li>
	<li>מעבר להגדלה 60x ו-RCaMP עירור הזריחה כדי לזהות שריר קיר הגוף ventromedial כי הוא הקדמי אל הפות ובמישור המוקד הנכון. הערה: השרירים הקדמי של הפות נבחרו כפי שהם משקפים שרירים בדרך כלל מגורה בניסויים אלקטרופיזיולוגיה.</li>
	<li>לשנות את מסלול התמונה מן העין למצלמה על ידי משיכת החוצה למתג ולחיצה בתוך תוכנת רכישת נתונים (טבלת חומרים). הערה: ודא כי מסלול גירוי האור הכחול מכובה בנקודה זו כדי לוודא שהמתקשר אינו מופעל לפני שהוא מבצע לכידת תמונות.</li>
	<li>למקד את התמונה בתוך תוכנת רכישת נתונים באמצעות מיקרוסקופ מיקוד דק.</li>
	<li>לאחר השריר הוא בבירור בפוקוס, לכבות את התמונה לחיות על ידי ביטול לחיצה על כפתור חי .</li>
	<li>לחץ על לחצן ROI בתוכנה לרכישת נתונים וליצור תיבה סביב שריר להיות מרוכז.</li>
	<li>על הגירוי, לעבור על מסלול גירוי האור הכחול שתוכנן בעבר בשלב 1.10.</li>
	<li>לחץ על ' רכוש ' בתוכנת הדימות כדי ללכוד את התמונה באמצעות מצלמת ה-CMOS. כדי לעשות זאת, לקבוע את זמן החשיפה 10 s עם 1,000 מסגרות 2x binning.</li>
</ol>3. ניתוח נתונים
<ol><li>פתח את קובץ הנתונים בתוכנת הדימות (טבלה של חומרים) ובאמצעות הכלי מצולע, המתאר את שריר הריבית. זוהי ההחזר.</li>
	<li>עבור לתמונה | ערימות | מגרש Z הפרופיל ציר ולייצא את נקודות הנתונים המתקבלים לתוך תוכנת הגיליון האלקטרוני (טבלת חומרים). פונקציה זו מתווה את הערך הממוצע לבחירת ROI לעומת נקודת הזמן.</li>
	<li>הזז את ROI השריר שנוצר עם הכלי מצולע מחוץ לבעל החיים כדי לקבל מדידה ברקע הזריחה באמצעות השלבים המתוארים ב 3.2. יצא את הנתונים שיתקבלו בחוברת העבודה של הגיליון האלקטרוני.</li>
	<li>בחוברת העבודה של הגיליון האלקטרוני, הפחת את ערכי הזריחה ברקע מערכי הקרינה השרירים בכל נקודה. פעולה זו מספקת את אות הפלורסנט המופחת.</li>
	<li>ממוצע הרקע המחוסר את הזריחה עבור 2 ה-s הראשונים של נקודות הנתונים. זה ייתן את המדידה הבסיסית של זריחה, F.</li>
	<li>השתמש במדידה הפלואורסצנטית הבסיסית כדי לחשב את רמת הזריחה המנורמלת בכל נקודת זמן. לשם כך, השתמש במשוואה (ΔF/F) + 1. ΔF מייצג (F (t)-F), כאשר F (t) הוא המדידה הפלואורסצנטית בכל נקודת זמן נתונה ו-F הוא הערך הבסיסי. ה-+ 1 נוסף כהיסט של ציר y.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.2-3.6 עבור כל תמונת שריר שנאספה. שימוש בתאי שריר יחיד או מרובים לכל תמונה הוא לפי שיקול דעתה של החוקר. את ה-n של הניסוי ניתן לקבוע על ידי ביצוע ניתוח כוח.</li>
	<li>השתמש בנתונים המעובדים משלבים 3.2-3.6 כדי ליצור מעקב אחר ערכי הפלורסנט בתוכנת הגרפים בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים).</li>
	<li>מתוך מעקב זה, למדוד את הקינטיקה של זמני הסידן, כגון עלייה לזמן שיא ומחצית הזמן ריקבון, באמצעות הכלים המסופקים בתוכנת הגרפים לפי הוראות היצרן.</li>
</ol>

<ol><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca2%2B+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+analysis+of+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li>
<li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li>
<li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li>
<li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+umanager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li>
<li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li>
<li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+isoforms+of+sarco%2Fendoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+%28SERCA%29+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li>
<li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2%2B+ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li>
<li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+sarco%28endo%29plasmic+reticulum+calcium-ATPases+%28SERCA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serca+pumps+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Calcium+Signalling+and+Disease%3A+Molecular+Pathology+of+Calcium%22%5BJournal%5D)">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li>
<li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCA+pump+isoforms%3A+Their+role+in+calcium+transport+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li>
<li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle%3A+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li>
<li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sarco%28endo%29plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li>
<li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li>
<li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li>
<li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+differentially+modulates+Ca2%2B+transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li>
<li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li>
<li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li>
<li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li>
<li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-type+voltage-dependent+Ca2%2Bchannel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li>
<li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הסמנים הם כלי רב-עוצמה בנוירוביולוגיה. עבודה קודמת יש שימוש בטכניקות הדמיה סידן כדי לבחון מגוון רחב של פונקציות הן נוירונים ותאי שריר, כולל תגובות חישה והתנהגותית, עם שיטות מגוונות של גירוי. מחקרים מסוימים השתמשו גירויים כימיים כדי להפעיל מארעיות סידן בנוירונים אפר חושי22,23 או כדי לגרום לגלי סידן בשריר הלוע24. קבוצה נוספת מנוצל גירוי מכני בעוד תולעים הוחזקו בצ microflu, כדי לבחון תגובות סידן ב קולטן מגע נוירונים...

נייר זה מציג שיטות לדימות סידן vivo של C. אלגיה שרירי קיר הגוף באמצעות הגירוי העצבי הגנטי. זיווג שריר הביע מחוון סידן מקודד גנטית (סמא) עם אור כחול המופעל הנוירופולריזציה והוא מספק מערכת להתבונן בבירור את הארעיות מעורר הסידן סינפטית. זה מונע את השימוש בגירוי חשמלי, המאפשר ניתוח לא פולשני של מוטציות המשפיעות על הדינמיקה סידן פוסט סינפטית.
חד-פלואורוופפור, כגון gcamp, משתמש במולקולה אחת של חלבון פלורסנט התמזגו לתחום M13 של רירן שרשרת האור בקצה N-terminal שלה ו קלמודולין (CaM) ב C-טרמינוס. עם כריכת סידן, התחום CaM, אשר יש זיקה גבוהה לסידן, עובר שינוי הקונפורמציה גרימת שינוי מאוחר יותר בחלבון פלורסנט המוביל להגדיל את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית1. GCaMP הזריחה הוא נרגש ב 488 ננומטר, מה שהופך אותו לא מתאים לשמש בשילוב עם המתקשרים, אשר יש גל עירור דומה של 473 ננומטר. כך, על מנת למספר מדידות סידן עם גירוי מתקשר, חלבון פלורסנט ירוק של GCaMP צריך להיות מוחלף עם חלבון פלורסנט אדום, mRuby (RCaMP). באמצעות שריר הביע את RCaMP, בשילוב עם ביטוי הcholinergic המנוע המוטוריים של המתקשרים, היתרי לימודים בצומת הנוירוסקולריות התולעת (NMJ) עם שימוש סימולטני של אלקטרואופטיקה והדמיה פונקציונלית בתוך אותה חיה 2. שתיים.
השימוש במתקשרים עוקף את הצורך בגירוי החשמלי כדי לפשט את הצמתים הנוירוולוגיים של ה -אס. אס.אס, שניתן להשיג רק באופן גזור, ובכך להפוך טכניקה זו לקלה יותר ומדויקת יותר בעת התמקדות ברקמות ספציפיות. לדוגמה, המתקשרים השתמשו בעבר ב -C. אלגיה כדי להפעיל נוירונים מסוימים באופן הפיך, המוביל להפעלה חזקה של הנוירונים או מעכבות הניריונים3,4. השימוש בדפולריזציה מגורה גם חוסם את סוגיית הנזק העצבי בשל גירוי חשמלי ישיר. זה מספק הזדמנות לבחון את ההשפעות של פרוטוקולי גירוי שונים רבים, כולל הגירוי מתמשכת וחוזרים, על הדינמיקה הסידן פוסט סינפטית4.
האופי השקוף של הג הופך אותו לאידיאלי עבור האנליזה הפונקציונלית של ההדמיה הפלואורסצנטית. עם זאת, כאשר מגרה את הנוירונים הNMJ הממריצים בבית הספרים, בעלי חיים צפויים להגיב עם כיווץ שרירים מיידי4, מה שהופך את השתק של תולעים קריטי להמחיש שינויי סידן דיסקרטית. באופן מסורתי, סוכני תרופתי. שימשו כדי לשתק את החיות אחד תרופה כזאת בשימוש הוא levamisole, קולטן cholinergic אצטילכולין האגוניסט5,6,7. מאז levamisole מוביל הפעלה מתמדת של תת סוג של קולטני שריר מרגש, מגיב זה אינו מתאים למחקר של הדינמיקה סידן שרירים. הפעולה של levamisole מעוררת הדפולריזציה הפוסט, מרוממת את הסידן ציטוסולג, וסגר תצפיות בעקבות גירוי טרום סינפטיות. כדי להימנע משימוש בסמים משתקת, בדקנו שתי שיטות חלופיות כדי לשתק את הג. בעלי חיים היו מודבקים למטה ולאחר מכן לגזור לחשוף את שרירי הקיר הגוף, בדומה C. אלגיה NMJ אלקטרופיזיולוגיה שיטה8, או nanobeads שימשו לשתק בעלי חיים שלמים9. שני ההליכים מותר עבור מדידות הניתנות לכימות של השריר מנוחה ומעורר משני השרירים המשורשים שהיו בקלות ככמת.
השיטות בנייר זה ניתן להשתמש כדי למדוד את רמות הסידן בסיסית ציטוטים ו ארעיות בתאי גוף השריר הפוסט-סינפטיות ב- C. אלגיה. דוגמאות לנתונים המעסיקים את שתי טכניקות השתק השונות ניתנות. שתי טכניקות לנצל אלקטרואופטיקה כדי לחסל את תאי השריר ללא שימוש בגירוי חשמלי. דוגמאות אלה מדגימות את הכדאיות של שיטה זו בהערכת מוטציות המשפיעות על טיפול בסידן פוסט-סינפטית בתולעים ומצביעים על היתרונות והחסרונות של שתי גישות השתק.

<table><tbody><tr><td>all-trans רשתית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R2500</td><td>הכרחי לעירור של ערוץ רודופסין</td></tr><tr><td>תאורת LED</td><td></td><td></td><td>ענבר RCaMP</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>Mouser</td><td>782-A000066</td><td>שולט בתאורת פלואורסצנטיות</td></tr><tr>ערוץ<td>LED</td><td></td><td></td> כחול <td>תאורת רודופסין</td></tr><tr><td>BX51WI מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>מיקרוסקופ מורכב במצב קבוע</td></tr><tr><td>נשלט זרם רעש נמוך ספק כוח ליניארי</td><td>Ametek</td><td>Sorenson</td><td>בקרות עוצמת LED</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>Wavemetrics</td><td>Wavemetrics.com</td><td>תוכנת גרפים</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov</td><td>תוכנת עיבוד תמונה</td></tr><tr><td>LUMFLN 60x מים NA 1.4</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>מטרת טבילה במים עבור הכנה מנותחת</td></tr><tr><td>מאסטר-8 סטימולטור</td><td>A.M.P.I</td><td></td><td>טיימר מאסטר לרכישת תמונה ותאורת LED</td></tr><tr><td>מיקרו-מנהל</td><td></td><td>micro-manager.org</td><td>בקרות רכישת מצלמות והנעת LED</td></tr> תוכנת <tr><td>גיליון אלקטרוני</td><td>של מיקרוסופט</td><td>מיקרוסופט</td><td></td></tr><tr><td>pco.edge 4.2 CMOS מצלמה</td><td>pco</td>.<td>4.2</td><td>מצלמה מהירה</td></tr><tr><td>PlanApo N 60x שמן NA 1.4</td> מטרת טבילה בשמן <td>אולימפוס</td><td></td><td>להכנת ננו-חרוזים</td></tr><tr><td>מיקרוספירות Polybead</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>00876-15</td><td>עבור קיבוע תולעת</td></tr><tr><td>מתגי מצב מוצק</td><td>Sensata Technologies</td><td>Crydom CMX100D6</td><td>בקרות תזמון של תאורת LED</td></tr><tr><td>מתח טרנסגני, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Richmond Lab</td><td>SY1627</td><td>ערוץ עצבי מעורררודופסין ושריר דופן הגוף RCaMP המבטא קו תולעת עם אלל מוטנטי SERCA</td></tr><tr><td>זן טרנסגני, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Richmond Lab</td><td></td><td>ערוץ עצבי מעורררודופסין ושריר דופן הגוף RCaMP המבטא קו תולעת עם אלל מוטנטי של תעלת אשלגן BK המופעל על ידי סידן</td></tr><tr><td>, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Gottschalk Lab</td><td>ZX1659</td><td>תעלה עצבית מעוררתרודופסין ושריר דופן הגוף RCaMP המבטא קו תולעת</td></tr></tbody></table>

בשנת הדמיה vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

האורגניזם מודל C. אלגיה מספק מערכת מעולה לבצע הדמיה vivo סידן. הגוף השקוף והmanipulability הגנטי שלו מאפשרים ביטוי ממוקד של חיישני סידן מקודדים גנטית. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחיישנים אלה עבור הדמיה vivo של הדינמיקה סידן בתאים ייעודיים, במיוחד שרירי הגוף של התולעים. על ידי ניצול הביטוי המשותף של המתקשר הטרום סינפטיות, גירוי של שחרור אצטילכולין מפני הנוירונים מוטוריים מוטורי יכול להיגרם באמצעות פולסים באור כחול, וכתוצאה מכך שרירים depolarization שריר ושינויים בסידן cytoplasmic רמות. שתי טכניקות השתק התולעים נידונות עם רמות שונות של קושי. השוואה בין טכניקות אלה ממחישה כי שתי הגישות משמרות את הפיזיולוגיה של הצומת העצבי ומאפשרים לכמת את הסידן. על-ידי שיוך אלקטרואופטיקה והדמיה של סידן פונקציונלי, שינויים בטיפול בסידן פוסט-סינפטית והומאוסטזיס ניתן להעריך במגוון של רקעים מוטציה. הנתונים המוצגים מאמתת הן טכניקות השתק ובודקת באופן ספציפי את התפקידים של C. אלגיה sarco (לאנדו) פלמיק סידן ATPase ואת הסידן מופעל בערוץ האשלגן המופעל בתוך שריר קיר הגוף בוויסות הסידן.

טכניקה זו העריכה שינויים מוטציות חשבו להשפיע על טיפול בסידן או depolarization השריר. רמות הניאון הבסיסית ו ארעיות פלורסנט היו דמיינו ומנוחה cytosolic סידן וקינטיקה סידן בתוך השריר הוערכו. חשוב כי החיות גדלו על הרשתית כל הטרנס לפחות שלושה ימים כדי להבטיח את התאגדות מוצלחת של הרשתית, ובכך לאחר מכן הפעלת המתקשר (איור 2א). אם בעלי חיים אינם חשופים הרשתית כל טרנס, לא השריר החולף הסידן הוא הפעיל (איור 2ב</stron...

שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

פרוטוקול זה מספק שתי שיטות לגייס C.Elegans לבצע הדמיה סידן vivo של שרירי קיר הגוף. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות הקשורות לטיפול בסידן הומאוסטזיס וסידן, וסינאפזה נגישה באורגניזם הניתן למתיחה גנטית. טכניקה זו יכולה לספק הבנה טובה יותר של המנגנונים המסדירים הומאוסטזיס סידן שרירים, ולכן יכול להיות חשוב בזיהוי תנאים או מסלולים מולקולריים המשפיעים על התכווצות צירים באמצעות ניסוח שגוי של סידן רכיבה על אופניים.שיטות אלה יכולות לספק תובנות על תחומי מחקר הכוללים, אך גם לא מוגבלים, נוירוביולוגיה, ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של התא. טכניקות אלה יכולות להיות מותאמות ללמוד מגוון רחב של סוגי תאים C.elegans, nematodes הקשורים אחרים, כמו גם זחלים filsafat. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כך שהנסיין יכול להבין את טכניקת הניתוח, ולהצליח להעריך במדויק את תחלופת הסידן מבעלי חיים משותקים כראוי.התחל על ידי הגדרת המיקרוסקופ להדמיה פלואורסצנטית. השתמש במצלמת CMOS מדעית המסוגלת להדמיית מסגרת מלאה ב- 100 הרץ כדי לעקוב אחר שינויים מהירים ברמות הסידן. בקרת רכישת מצלמה וגירוי פלואורסצנטי LED עם תוכנה מיקרו-ניהולית הפועלת ב- ImageJ.השתמש בתוסף פלטפורמה אלקטרונית Opensource המתחבר ללוח מיקרו-בקרים חיצוני של opensource כדי לנהל את פולסים התזמון החיצוניים השליטה ברגשות פלואורסצנטיים. כדי לשלוט בלוגקת התזמו

in-vivo-calcium-imaging-in-c-elegans-body-wall-muscles

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מציג את המושגים מאחורי דימות סידן וכולל פרוטוקול לדוגמה להדמיית הילוך מהיר של תולעים הכלולות בבארות אגרוז יצוקות.

הדמיית סידן: שיטה להמחשת פעילות עצבית ב- C. elegans חי

סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית סידן בתאי עצב בודדים של Caenorhabditis elegans המתנהגים באמצעות חלבוני כתב פלואורסצנטיים מקודדים גנטית. הוא מתאר את השלבים המעורבים בהדמיית תנועת תולעים ומדידת יחסי פלואורסצנטיות של כתב מתאי עצב כדי לקשר בין רמות הסידן התוך-תאיות לפעילות עצבית ושינויים התנהגותיים במהלך הטלת ביצים.

הדמיית סידן בתאי עצב בודדים המווסתת את התנהגות הטלת הביצים ב- Caenorhabditis elegans

מקור: Doser, R., et al. הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי in vivo. J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים הדמיה in vivo של שטף סידן תת-תאי בנוירונים של חוט העצב הגחוני של זני Caenorhabditis elegans טרנסגניים. נעשה שימוש בשני מדדי סידן נפרדים: אינדיקטור ציטופלזמי בזן אחד ואינדיקטור מיטוכונדריאלי באחר. נוירונים נצפים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לנטר שינויים בזמן אמת בעוצמת הקרינה בתוך הציטופלזמה העצבית והמיטוכונדריה, המשקפים שטף סידן במהלך פעילות עצבית ספונטנית.

הדמיית דינמיקת סידן תת-תאית בתאי עצב של Caenorhabditis elegans

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים...

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

הדמיית התנהגות ופעילות עצבית לאורך זמן ארוך ללא קיבוע של החיה היא תנאי מוקדם להבנת התנהגות. ניתן להשתמש בהדמיית תאים מיקרופלואידיים של אגרוז (AMI) כדי לדמות פעילות עצבית והתנהגות עבור כל שלבי החיים של Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

כאן אנו מציגים פרוטוקול סידן התמונה איתות באוכלוסיות של סוגי תאים בודדים באזור צומת עצב-שריר מאתר.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

דווח כאן על מערכת להדמיית סידן בדלקת אלגנס המתנהגת באופן חופשי עם רטט מבוקר היטב, שאינו לוקלי. מערכת זו מאפשרת לחוקרים לעורר תנודות לא-לוקליות בעלות תכונות מבוקרות היטב בתזוזה בקנה מידה ננומטרי ולכמת זרמי סידן במהלך תגובות של C. elegans לתנודות.

הדמיית סידן באלגנים של Caenorhabditis המתנהגים בחופשיות עם רטט מבוקר היטב, שאינו מלוטש

עמודי שדרה דנדריטים הם מאפיינים תאיים חשובים של מערכת העצבים. כאן מתוארות שיטות הדמיה חיות להערכת המבנה והתפקוד של קוצים דנדריטיים ב - C. elegans. גישות אלה תומכות בפיתוח מסכים מוטנטיים לגנים המגדירים צורה או תפקוד של עמוד שדרה דנדריטי.

הדמיה של קוצים דנדריטיים בקאנורהבדיטיס אלגנס

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים וכלים להמחשת סידן במהלך הפריה ועובריות מוקדמות באמצעות מדווח סידן מקודד גנטית המתבטא בקו הנבט של נמטודת המודל C. elegans.

הדמיה in vivo של מעברי סידן במהלך הפריה והתפתחות מוקדמת ב - C. elegans

חקור דינמיקת סידן בשרירי דופן של C. elegans באמצעות הדמיה in vivo. שיטות ההכנה באמצעות חיתוך או ננו-חלקיקים מאפשרות מעקב אחר שינויים מהירים ברמות הסידן התוך-תאיות.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

גלה סרטונים נוספים