הקרנת מבחני עבור הערכה של השפעות על Ca^{2 +}תפוקה בינונית-איתות ותגובה Acrosome זרע אנושי

ניתן להשתמש בבדיקה שלנו כדי לבדוק תרכובות עבור ההשפעות שלהם על תפקוד תאי הזרע האנושיים. באופן ספציפי, שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לסנן במהירות ובקלות מספר גדול של תרכובות עבור ההשפעות שלהם על איתות סידן ותגובת אקרום בתאי זרע אנושיים. הדגמות חזותיות של שיטה זו יקלו על אחרים להקים ניסויים דומים במעבדות שלהם.

התחל על ידי הצבת צינור אחד 50 מיליליטר לכל מיליליטר אחד של דגימת זרע גלם לתוך מתלה צינור בזווית של 45 מעלות והוספת ארבעה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס נוזל תובל אנושי או מדיום חיובי HTF לכל צינור. לאחר מכן, בזהירות pipette מיליליטר אחד של דגימת זרע נזילות לתחתית של כל צינור ולה מניחים את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, השתמש בקצה פיפטה שונה שנערך בזווית של 45 מעלות כדי להעביר בעדינות חלק גדול מהשבר העליון של תא הזרע המניע המכיל מדיום חיובי HTF ככל האפשר לתוך צינור פלסטיק חדש 15 מיליליטר.

כדי לספור את תאי הזרע שנאספו, לדלל aliquot 20 microliter לגורם של 10, 20, 30, 50, או 90 ב S100 חיץ בצינור עגול התחתון שני מיליליטר על פי הריכוז הצפוי. מערבולת תאי הזרע מדולל במשך 10 שניות ב 700 סיבובים לדקה. לאחר מכן, לטבול קלטת SP1 לתוך המדגם ולדכא באופן מלא את הבוכנה הלבנה כדי לשוכך aliquot של המדגם לתוך הקלטת.

לאחר מכן מניחים את הקלטת במגש ציטומטר התמונה ולהפעיל את PI מוכתם תא זרע אנושי assay על פי גורם דילול להחיל. כדי למדוד שינויים בריכוז הסידן תאי חינם, בעדינות pipette דגימת הזרע למעלה ולמטה פעם אחת ולהשתמש פיפטה חוזר אוטומטי aliquot 50 microliters של תאי זרע מוכתמים פלואורופור ל 24 בארות של שורה אחת של צלחת 384 מיקרו באר. מניחים את צלחת המיקרו היטב אצל קורא לוחיות הפלואורסצנטיות ב-30 מעלות צלזיוס ובחרו את הפרוטוקול המתאים ל פלואורופור.

בחר באר בשורה של תאי זרע והתאם את הרווח לערך יעד של 20% ולאחר מכן התחל את המדידה. לאחר 10 מחזורי בסיס, השהה את הניסוי ופלט את המגירה עם צלחת המיקרו באר. באמצעות פיפטה של 12 ערוצים, הוסף במהירות 25 מיקרוליטרים של הפתרונות המוכנים של תרכובות ובקרות עניין לתוך 12 בארות כפולות בשורה ומיד להחזיר את הלוח לקורא להמשיך את המדידה מהר ככל האפשר.

כל שינוי פלואורסצנטי בתגובה לתוספת של תרכובות או פקדים יילכדו על ידי המכשיר. לניתוח תגובה אקרוסום, לאחר דגירה של תאי הזרע קיבולי עם צבעים פלואורסצנטיים המתאימים, תרכובות או פקדים, לערבב את הדגימות על ידי pipetting ולהוסיף 50 microliters של כל מדגם בדיקה ל 100 microliters של פתרון immobilizing. מערבבים שוב את הדגימות ועומסים את התאים של שקופית A2 אחת לדגימה עם כ-30 מיקרוליטרים של דגימה לתא.

לאחר מכן מקם את השקופית הראשונה שנטענה על המגש של ציטומטר התמונה. בחר את פרוטוקול FlexiCyte והקש על הפעל. כאן תוצאות מייצגות מניסוי בדיקת ההשפעה של ארבע תרכובות, בקרת פרוגסטרון חיובית ובקרת חיץ שלילית באמצעות בדיקת איתות סידן בתפוקה בינונית כפי שהוכח ניתן לראות.

בגרף זה, עקומת תגובה מנה של פרוגסטרון נגזר שיא אחוזים שינויים בריכוז הסידן החופשי תאיים המושרה על ידי ריכוז מדולל סדרתי של פרוגסטרון מוצג. נתונים אלה ממחישים את ההשפעות של שלילי אחד או אחד משני פקדים חיוביים על אינדוקציה של תגובה acrosome בתאי זרע אנושיים קיבוליים בתגובת תפוקה בינונית. כדי למנוע החמצת פסגות האותות המושרים, חיוני להוסיף את הכימיקלים במהירות לתכפל בארות ולהמשיך מיד את המדידה לאחר מכן.

על ידי שינוי סוג הפלואורופורים והצבעים, ניתן לשנות בקלות את הראיה שלנו כדי לענות על שאלות מדעיות שונות. אלה assays כבר שימשו במספר מחקרים כדי לבדוק קבוצות גדולות של תרכובות עבור ההשפעות שלהם על תפקוד הזרע האנושי.