שליטה אשכול הראשונית תא 3D היברידית ג'ל קוביה התקן עבור תצורות דפוס הדיר

פרוטוקול זה משתמש בשיטה פשוטה לשיפור האמינות של מודל תרבות תאים תלת-ממד ללא שימוש בציוד מיוחד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים לנהל את הניסוי תרבות 3D חוזר על ידי שליטה על מצב התרבות הראשונית בתוך המכשיר מעוקב. לאחר הכנת מסגרת מעוקב פוליקרבונט של חמישה על חמישה מילימטרים, מניחים את המסגרת על מגלשה מקורר מראש ותיבת קרח ולהשתמש פיפטה להוסיף 12 microliters של 1.5% שחומם מראש התעורר מהפנים העליונות של המסגרת מעוקב אל פני השטח התחתון.

להפיץ את agarose כדי לקבל משטח שטוח ולאפשר פולימר לרפא. השתמש פינצטה כדי להחליק את המסגרת לקצה הזכוכית ולסובב את המסגרת כך הצד הפתוח פונה כלפי מטה לפני הצבת המסגרת בחזרה על השקופית. לאחר מילוי שני המשטחים הבאים של המסגרת עם יותר agarose, כפי שהודגם רק, טיפת agarose לתוך מיכל מפנים פתוחות כדי ליצור קיר אגרוז בצד הרביעי והחמישי.

כדי להגדיר צורת אשכול תאים ראשונית להזריק מטריצה חוץ תאית מתאימה לתרבות התאים של עניין לתוך שטח תרבות קוביית ג'ל היברידית ולהגדיר תבנית מיקרו מפוברק על הקוביה. ואז למקם את הקובייה באינקובטור פחמן דו חמצני במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר המטריצה החוץ-תאית נרפאת, יש להרים בזהירות את תבנית המיקרו כך שהמטריצה לא תתדרדר.

כיס בצורת התבנית הרצויה יהיה מפוברק במטריצה החוץ-תאית. כדי לטעון את התאים לרכז את ההשעיה תא ניסיוני לאחר צנטריפוגה במדיום תא הניסוי המתאים להזריק את התאים לכיס בתוך מטריצה חוץ תאית. מניחים את הקובייה לתוך אינקובטור פחמן דו חמצני במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים ליפול לתוך כיס מטריצה חוץ תאית, מילוי החלל שנוצר על ידי עובש מיקרו.

בסוף הדגירה, מניחים את הקובייה לתוך באר אחת של צלחת 24 באר ולהוסיף 100 microliters של מדיום תרבות התא המתאים ל הבאר. להזריק מטריצה חוץ תאית נוספת כדי לסגור את הכיס ולהחזיר את הקובייה לאנקובטור במשך 25 דקות. כאשר מטריצה חוץ תאית נרפא טיפה כ 10 microliters של 20 מעלות צלזיוס התעורר על פני השטח העליונים לקוביה כדי לסגור את פני השטח לרפא את הירידה במשך 10 עד 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מכסים את הקובייה כולה במדיום טרי כדי לקדם לחץ אוסמוטי להקלה על העברת התזונה לתאים בתוך הקובייה. לזיהוי צורה תלת-ממדית לא פולשנית על ידי התבוננות רב-כיוונית, הנח את הלוח על שלב מיקרוסקופ והשג תמונות של כל צד של הקוביה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או ניגודיות פאזה, באמצעות פינצטה כדי לסובב את שירות הקוביה כדי לדמיין אותו בין לכידות. להדמיה אימונופלואורסצננטית על ידי התבוננות רב-כיוונית, ישאף תחילה את העל-טבעי מהקלפיה המכילה את הקובייה ותקן את הקובייה ב-4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

בסוף קיבעון, לשטוף את הקובייה פעמיים עם PBS במשך 10 דקות לכל לשטוף. ערערו את הקובייה עם 0.5% טריטון x-100 ו-PBS למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את הקובייה שלוש פעמים PBS במשך 10 דקות לכל לשטוף, לפני חסימת כל מליטה לא ספציפית עם סרום עזים חיץ immunofluorescence במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.

ואז להכתים את התאים עם הנוגדן העיקרי המתאים של עניין על פי פרוטוקולי הכתמת נוגדנים סטנדרטיים. ואז תמונה כל ששת הצדדים של הקובייה על לייזר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי כפי שהוכח רק. בניסוי מייצג זה הדמיה רב-כיוונית של קוביות ג'ל היברידיות, המתורבתות בתאי אפיתל אנושיים רגילים, מדגימה את הדור של תרבות תאים גלילית או פריזמה ראשונית בצורת ניגודיות פאזה והדמיה אימונופלואורסצנטית של התרבויות.

כאן כתמים חיסוניים של תאי אפיתל אנושיים נורמליים נשלט בתחילה לצורה גלילית בקוביית הג'ל ההיברידית, לאחר הדור של עץ הסופתנות מוצג. הענפים מדגימים את הניצב לציר הגלילי, כפי שנחשף בהדמיה רב-ממדית. חשוב להזריק צפיפות גבוהה של תאים לכיס מטריצה חוץ תאית, כמו צפיפות נמוכה של תאים עלול לגרום להידרדרות של איכות התא לאחר הדגירה.

תבנית שיטה זו היא היווצרות חוזרת של תבנית תאית תלת-ממדית עם מדידה כמותית על ידי הדמיה רב-כיוונית כדי לחקור את המנגנון של פיתוח כלים.