Name: שליטה אשכול הראשונית תא 3D היברידית גל קוביה התקן עבור תצורות דפוס הדיר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: למד שיטה לשליטה בצורת אשכולות תאים תלת-ממדיים באמצעות מכשיר קובייתי עם הידרוג'לים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה רב-כיוונית ויצירת דפוסים חוזרת בחקר הנדסת רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי JSPS KAKENHI (18H 04765) ואת התוכנית להפצת מערכת מעקב אחר הקביעות, MEXT, יפן.

1. ייצור של היברידית ג'ל קוביה התקן
<ol><li>להכין מסגרת מעוקב פוליקרבונט (PC) באמצעות תהליך עיבוד שבבי או מדפסת תלת-ממד. הגודל של המסגרת PC תלוי גודל המדגם. במחקר זה, השתמשנו באפשרות מסגרת של 5 מ מ בכל צד כך הענפים היה די שטח כדי להאריך במהלך culturing.</li>
	<li>להציב את המסגרת PC על שקופית זכוכית טרום מקורר או משטח חלק אחר בתיבה קרח (< 0 ° C) (איור 1 א').</li>
	<li>להוסיף 12 µL של 1.5% מחומם מראש agarose (w/v) מן הפנים העליון של המסגרת מעוקב המשטח התחתון פיפטה. ללטף את פיפטה כך agarose מתפשט כדי ליצור משטח שטוח (איור 1B).</li>
	<li>בתוך דקות, agarose תתרפא. לאסוף את המסגרת המחשב על-ידי הזזת אותו לקצה השקופית זכוכית באמצעות פינצטה. שימו לב כי אנכית אוספת את המסגרת של השקופית זכוכית עלולים לגרום של ניתוק של agarose מהמסגרת מעוקב בשל הכוח דבק בין agarose את השקופית זכוכית (איור 1C).</li>
	<li>סיבוב מסגרת מעוקבים כדי להפוך הפנים פתוח למטה, ולאחר מכן מקם בשקופית זכוכית שוב (איור 1D).</li>
	<li>חזור על שלבים 1.3-1.5 עד לשלושה משטחים מלאים agarose (איור 1E).</li>
	<li>כדי ליצור חומה agarose על פניהם הרביעית והחמישית, שחרר את agarose של פנים פתוח (איור 1F). ברגע קיר של agarose נוצרת על פני החמישי, הכנת HGC הושלמה.</li>
</ol>2. ייצור של micromolds על ידי פוטוליתוגרפיה או תהליך עיבוד שבבי
<ol><li>ייצור על ידי פוטוליתוגרפיה<ol>
<li>נקי רקיק צורן (Si) באמצעות שטיפה עם אצטון, אלכוהול איזופרופיל (IPA), ואז (DI) מים מזוקקים למשך 5 דקות. לאחר חנקן נושבת כשהפחד Si עם חנקן, מייבשים בתנור ב 140 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (איור 2 א(א)).</li>
		<li>ספין-קואט שכבה ההקרבה כגון לור ו- Az יתנגד על כשהפחד סי (2,000 סל ד, 30 s) באמצעות ספין-coater תחת אור צהוב. מיד לאחר ספין-ציפוי, מחממים את לחם הקודש על פלטה חמה ב 90 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (איור 2 א(ii)). עובי השכבה ההקרבה הרצוי הוא יותר 1 מיקרומטר כך המעלית את התהליך יכול להתבצע בקלות, אבל עובי מדויק. זה לא נחוץ.</li>
		<li>למקם את לחם הקודש על פלטה חמה ב- 70 מעלות צלזיוס ולאחר מכן למינציה גיליון עבה photoresist שלילי עם העובי הרצוי בשכבה ההקרבה באמצעות גלגלת יד (איור 2 א(iii))</li>
		<li>חמש דקות לאחר רבוד, במקום את לחם הקודש על aligner מסכת חשיפה UV. להגדיר את photomask עם התבנית הרצויה להתנגד גיליון ולחשוף עם אור UV עבור משך הזמן המתאים. זמן החשיפה נקבעת לפי העובי של photoresist לבין עוצמת האור UV. לאחר מכן, למקם את לחם הקודש על פלטה חמה עבור לאפות לאחר חשיפה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, ואחריו אפיה ב 90 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (איור 2 א(iv))</li>
		<li>לפתח photoresist שלילי במועט כשהפחד בפרופילן גליקול monomethyl אתר אצטט (PGMEA) עד אזור סמויה היא התפרקה לחלוטין (כ- 20 דקות) (איור 2 א(v)).</li>
		<li>להמיס את שכבת ההקרבה באמצעות IPA עבור שטיפה כדי להמריא את מיקרו. פעם אחת מיקרו קולפה מ כשהפחד, לשטוף עם מים DI על ידי שטיפה-10 דקות (איור 2 א(vi)).</li>
		<li>לטבול את התבנית ב 30 µL של הפולימר MPC למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (כ 20 ° C) להתייבש לחלוטין זה. איור 2B מראה כייר פריזמה מפוברק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ייצור של תבנית גליל<ol>
<li>לפברק תבנית גליל פלדה עם הגודל הרצוי על ידי תהליך עיבוד שבבי. לחלופין, השתמש זמינים מסחרית פלדת אל-חלד. (במחקר זה, צילינדר מיקרומטר 600 φ משמש).</li>
		<li>לטבול את גליל פלדה 30 µL של הפולימר MPC למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (כ 20 ° C) להתייבש לחלוטין זה.</li>
		<li>הכן polydimethylsiloxane נוזלי (PDMS) על ידי ערבוב בסיס שרף הזרז (ראה טבלה של חומרים) על יחס 10:1 ואחריו degassing עם ואקום degassing מערכת עבור 20 דקות. לאחר מכן שופכים את PDMS בצלחת 12-. טוב.</li>
		<li>הגדר גליל פלדה בניצב לשטח נתון וקבוע לשלב-z ליניארי כך זה יכול להיות מוכנס בניצב השטח PDMS משומרים בתוך 12-ובכן-צלחת מניחים על פני השטח של דנון אותו על-ידי הזזת z-הבמה. דגירה של PDMS עם פלדה גליל בתנור למשך 20 דקות ב 90 מעלות צלזיוס לריפוי. חותכים את PDMS כדי ליצור משטח האגף כך pipet יכול להיות מוכנס בתהליך הבא (איור 2C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. שליטה הצורה אשכול תא הראשונית הידרוג
<ol><li>להזריק ECM המתאים עבור התרבות התא הרצוי, כגון קולגן, קרום המרתף מלאכותי, לתוך HGC כדי למלא את החלל תרבות (איור 3 א).</li>
	<li>להגדיר את micromold מפוברק HGC במישרין או בעקיפין עם מחזיק המתאים, כפי שמוצג באיור 3B. לאחר מכן, מקם את HGC חממה2 CO במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לריפוי זה.</li>
	<li>הרם בזהירות החוצה micromold כך ה-ECM לא יתדרדר (איור 3C). הכיס, של הצורה הרצויה עובש, להיות מפוברק ב- ECM.</li>
	<li>קציר תאים מן המנה בתרבית על ידי טריפסין-EDTA או שווה ערך בהתאם סוגי תאים. לאחר מכן, centrifuge את התאים כדי להשיג את התאים מרוכז (לתרבות NHBE, להחיל 0.25% טריפסין-EDTA, דגירה תאים עבור 3 דקות, לאחר מכן לנטרל עם FBS המכילות בינוני, צריך שתוציאו ב x 300 גרם במשך 4 דקות).</li>
	<li>לאחר צריך שתוציאו, להסיר את המדיום supernatant לתמצת את התאים, מזריקים תאים מרוכז (3.0 × 104 תאים/µL עבור תאים NHBE) לתוך הכיס ב ה-ECM (דמות תלת-ממד).</li>
	<li>דגירה של HGC עם תאים חממה2 CO כעשרים דקות ב 37 ° C כך התאים ליפול לתוך הכיס ECM כדי למלא את החלל שנוצר על-ידי micromolds. אם בינוני מוגזמת או תאים קיימים על המשטח העליון, הסר בזהירות בעזרת פיפטה.</li>
	<li>למקם את HGC על צלחת 24-ובכן, להוסיף 100 µL של המדיום המתאים (איור 3E). עבור תאים NHBE, השתמש תערובת 1:1 של בינוני מיוחדים זמינים מסחרית עבור NHBE ותאי אנדותל (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להזריק ECM נוספים כדי לסגור את הכיס ב- ECM ולאחר מכן דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות.</li>
	<li>לקרר טרופה agarose 1.5% לטמפרטורת החדר (כ 20 ° C). ירידה בערך 10 µL של agarose על גבי המשטח העליון של HGC סגירת השטח ולמנוע את ECM מנפילה מתוך HGC במהלך culturing והדמיה (איור 3F). לאחר מכן, דגירה HGC עוד כעשרים דקות ב 37 ° C כדי לרפא את agarose.</li>
	<li>הוסף בינוני כדי לכסות את HGC כל כך לחץ אוסמוטי יכול לסייע במתן תזונה על התאים בתוך HGC.</li>
</ol>4. רב כיוונית הדמיה
<ol><li>זיהוי לא פולשנית צורה תלת ממדית על-ידי צפייה רב כיווניות.<ol>
<li>למקם את תרבות מאכל או צלחת טוב המכיל את HGC-מיקרוסקופ, אוריינט את HGC למסגרת המצלמה. לאחר מכן, להשיג תמונה לדוגמה לעומת שדה או שלב בהיר.</li>
		<li>לאסוף וסובב את HGC להציב משטח שונה למטה.</li>
		<li>חזור על שלבים 4.1.1 ו 4.1.2 עד תמונות מכל הצדדים 6 מתקבלים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חיסונית-פלורסנט הדמיה באמצעות התבוננות רב כיוונית<ol>
<li>עבור קיבוע, חלות paraformaldehyde 4% המדגם מעל HGC בטמפרטורת החדר (כ 20 ° C) במשך 20 דקות, ואחריו שתי שטיפות של PBS למשך 10 דקות.</li>
		<li>Permeabilize את HGC עם PBS המכילה 0.5% טריטון X-100 10 דקות ב 4 ° C, אז תרחץ 3 x 10 דקות עם PBS.</li>
		<li>דגירה של HGC עם 10% סרום עז במאגר-אם (0.2% טריטון X-100, אלבומין שור 0.1% ו- 0.05% Tween-20 ב- PBS) עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר במשך צעד חסימת העיקרי.</li>
		<li>עבור צביעה של מולקולה מסוימת, השתמש הנוגדן המתאים. כדי לבחון את הגיאומטריה תא קולקטיבית, אלקסה עבור חיל הים 488 Phalloidin יכול לשמש כתם אקטין.</li>
		<li>מניחים את HGC על צלחת תחתית זכוכית תחת מיקרוסקופ לייזר או פלורסנט ולבצע סריקה מתוך ששת הצדדים כדי לקבל את תמונת מדגם כולו.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-+cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+epithelial+sheet+morphology+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).</li>
<li>Tawk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mirror-symmetric+cell+division+that+orchestrates+neuroepithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis.</a> Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).</li>
<li>Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).</li>
<li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+or+not+tube%3A+Remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Huisken, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. , 1007-1009 (2004).</li>
<li>Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+in+Cube%3A+In+Vitro+3D+Culturing+Platform+with+Hybrid+Gel+Cubes+for+Multidirectional+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).</li>
<li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+Scale+Imaging+by+Fine+Spatial+Alignment+of+Multi-Scanning+Data+with+Gel+Cube+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device.</a> Applied Sciences. 8 (235), (2018).</li>
<li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li>
<li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+Tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li>
<li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li>
<li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li>
</ol>

המחברים ו אוסקה פריפקטורה של אוניברסיטת קיושו מכון טכנולוגי הגישו בקשה לרישום פטנט היברידית ג'ל קוביה המכשיר, ואת ניפון רפואי, מכשירים כימי ושות' בע מ, יפן יש לאחרונה ממוסחר הקוביה. החברה לא השפיע על כל של עיצוב, תהליך, בשיטות המתוארות.

השיטה המובאת בעיתון הזה הוא פשוט, יכול להתבצע ללא ציוד טכנולוגיה. במקביל, ניתן להשיג תוצאה שליטה צורה של אשכול תא מדויק במרחב תלת-ממדי של הידרוג. לאחר הפקד הראשונית, התאים יכולים לגדול ב- HGC עד כמה הם בתרבית על צלחת. ההדמיה רב כיוונית מתבצע על ידי סיבוב הדגימה עם HGC באמצעות כל מערכת מיקרוסקופ, מגבירה באופן משמעותי את איכות הדמיה. הבחירה של החומרים עבור מסגרת HGC ו- micromold הוא גמיש, כל עוד הם מסתיימים. מדפסת תלת-ממד עשוי לשמש כדי לייצר את המסגרת HGC או micromold אם הדיוק של המדפסת 3D מספיקה על היישומים שלהם. השיטה המ...

חשיבותה של תרבות 3D, אשר כדאי מחקה סביבות ביולוגי מאשר תרבות 2D, מודגשת במידה ניכרת תא/רקמות תרבות1,2,3. האינטראקציה בין תאים מטריצה חוץ-תאית (ECM) מספק רמזים חשובים לגבי מורפוגנזה4,5. תצורות רקמות רבים יכולים לצאת רק תחת סביבות תלת-ממד, כגון תהליך קיפול6,7, invagination8ו מבנה צינורי9,10. עם זאת, הקשיים למנוע חוקרים הסטה ל ניסויים תלת-ממד של ניסויים 2D בצלחת. אחד הקשיים העיקריים בניסויים 3D הוא הנושא של דגימות 3D הדמיה. לעומת ניסויים מישורי, רכישת תמונות תלת-ממד המתאים הוא עדיין מאתגר במקרים רבים. בפרט, קבלת תמונה תלת-ממדית המתאימה היא משימה קשה כאשר גודל המדגם מגיע הטווח מ מ בשל העומק מוקד גדול של עדשות ההגדלה נמוך. לדוגמה, עומק מוקד מגיע יותר מ 50 מיקרומטר כאשר 10 x עדשת הגדלה בזמן הגודל של התא הבודד הוא בדרך כלל פחות מ- 10 מיקרומטר. כדי לשפר את איכות הדמיה, מפתחים מערכות טכנולוגיה מיקרוסקופ (למשל מיקרוסקופ שני הפוטונים11 ו מערכת מיקרוסקופ אור-גיליון12), אבל את זמינותם מוגבל בשל מחירן יקר. כחלופה, פותחו בעבר היברידית ג'ל קוביה (HGC) התקן13. המכשיר מורכב משני סוגים של hydrogels: agarose ג'ל תמיכה, ECM כמו קולגן או Matrigel כמו ג'ל תרבות. HGC מאפשר לנו לאסוף את הדגימה במהלך culturing לסובב את הקוביה כדי להשיג הדמיה רב כיוונית, אשר פותר את הבעיה של מוקד עומק14.
קושי נוסף בניסויים 3D הוא שלהם הדיר נמוכה בשל בקירות וצפיות המסכן סביבות תלת-ממד. בניגוד תרבות מישורי בצלחת פלסטיק, בווריאציות התנאים התרבות הראשונית בקלות להתרחש במרחב תלת-ממדי מוקף בחומר רך. וריאציה משמעותי בתוצאות הניסוי מתדרדר את הניתוח הבא ומסכות המנגנונים המשמשת כבסיס. טכנולוגיות הנדסיות רבות פותחו ליישור במרחב תאים בודדים, כגון15,bioprinting16, סיבים אריגה17, פיגומים18, אבל הם דורשים preprocessing מורכבים או באופן ספציפי ציוד מעוצב. לעומת זאת, פיתחנו מתודולוגיה להשגת תא 3D יישור HGC19.
ב פרוטוקול זה, אנחנו מאויר הליך פשוט עם ציוד נפוץ לשליטה הצורה אשכול 3D תא הראשונית HGC. ראשית, הודגם תהליך ייצור HGC. לאחר מכן, micromolds מפוברק על ידי פוטוליתוגרפיה או תהליך עיבוד שבבי יכניסו את HGC לייצר כיס עם צורה שרירותית ב- ECM. לאחר מכן, הוזרקו תאים בעלי צפיפות גבוהה לאחר צנטריפוגה לתוך הכיס כדי לשלוט בצורה אשכול תא הראשונית ב HGC. האשכול התא מבוקרת בדיוק יכול לדימות מכיוונים רבים בגלל HGC. האדם הסמפונות אפיתל (NHBE) תאים נורמליים שימשו כדי להפגין השליטה של הצורה אשכול תא ראשוני והדמיה של הענפים מכיוונים רבים לשיפור איכות הדמיה.

<table><tbody><tr><td>12 צלחות</td><td>קורנינג בע"מ</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>2-מתוקסי-1-מתילאתיל אצטט</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td><td>130-10505</td><td>PGMEA, CAS: 108-65-6&nbsp;</td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td><td>161-20141</td><td>CAS: 30525-89-4</td></tr><tr><td>אגרוז, טמפרטורת ג'ל נמוכה&nbsp; BioReagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>AZ1512</td> ערכת כדורים <td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>מדיום מיוחד לתאי NHBE</td></tr><tr><td>תמיסת אלבומין בסרום בקר (10%)</td>ערכת כדורים <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>מדיום מיוחד לתאי אנדותל</td></tr><tr><td>Lipidure</td><td>NOF co.</td><td></td><td>MPC</td></tr><tr><td>פולימר Matrigel גורם גדילה מופחת מטריצת ממברנת הבסיס</td><td>Corning&nbsp; Inc.</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל (10%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50197Z</td><td></td></tr><tr><td>תאי אפיתל סימפונות אנושיים רגילים</td><td>Lonza</td><td>CC-2541</td><td></td></tr><tr><td>SILPOT 184 W/C</td><td>Dow Corning Co.</td><td>3255981</td><td>שרף בסיס וזרז עבור PDMS</td></tr><tr><td>SUEX D300</td><td></td><td>DJ MicroLaminates, Inc</td><td>פוטו-רזיסט שלילי עבה (עובי: 300 מ"מ)</td></tr> <tr><td>Triton X-100 (1%)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

שליטה אשכול הראשונית תא 3d היברידית ג'ל קוביה התקן עבור תצורות דפוס הדיר

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

החשיבות של תרבויות 3D במבחנה מודגשת במידה ניכרת בתרבות תא/רקמות. עם זאת, חוסר ניסיוני הדיר הוא אחד את ההגבלות שהיא מטילה. הפקת תוצאות הדיר כמה תבניות מתדרדר הניתוח של המנגנונים הארגון עצמית. הפחתת וריאציה של תנאי התרבות הראשונית צפיפות התאים והפצה מטריצה חוץ-תאית (ECM), חיוני לשפר את הדיר של תרבות תלת-ממד. במאמר זה נדגים הליך פשוט אך חזקים לשליטה הצורה אשכול תא הראשונית מטריצה חוץ-תאית תלת-ממד כדי לקבל תבנית מאוד הדיר תצורות. Micromold לצורה הרצויה היה מפוברק על-ידי שימוש פוטוליתוגרפיה או תהליך עיבוד שבבי, הוא נוצר כיס תלת-ממד ב- ECM הכלול קוביה ג'ל היברידית (HGC). תאים מרוכז ואז הוזרקו בכיס כך הצורה אשכול תא מתאימים עם הצורה עובש מפוברק. HGC מועסקים מותר רב כיוונית סריקה על ידי הסיבוב שלה, שאיפשר דימות ברזולוציה גבוהה ועל לכידתו של המבנה כולו רקמות למרות עדשת הגדלה נמוכה שימש. אדם נורמלי הכיל. תאים אפיתליים הסמפונות שימשו כדי להדגים את המתודולוגיה.

האדם הסמפונות אפיתל (NHBE) תאים נורמליים שימשו כדי להדגים את המתודולוגיה מאויר ולשלוט הגיאומטריה תא קולקטיבית הראשונית כדי להשיג את צורת גליל צורה פריזמה, בהתאמה בסביבה ECM. רב כיוונית הדמיה התוצאות המתקבלות על ידי ניגודיות שלב, כמו גם phalloidin מכתים של צורת גליל (איור 4AB), הצורה פריזמה (איור 4CD) מוצגים. התאים מיושרים כראוי להניב הצורה התלת-ממדית הרצויה בסביבת ECM. לאחר מכן, התאים היו בתרבית ...

אנו מציגים הליך לשליטה אשכול תא ראשוני הצורה מטריצה חוץ-תאית תלת-ממד כדי לקבל צורה דפוס הדיר. מכשיר מעוקב המכיל שני hydrogels שונים הוא מועסק כדי להשיג הדמיה רב כיוונית עבור צורה דפוס רקמות.

שליטה אשכול הראשונית תא 3D היברידית ג'ל קוביה התקן עבור תצורות דפוס הדיר

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

פרוטוקול זה משתמש בשיטה פשוטה לשיפור האמינות של מודל תרבות תאים תלת-ממד ללא שימוש בציוד מיוחד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים לנהל את הניסוי תרבות 3D חוזר על ידי שליטה על מצב התרבות הראשונית בתוך המכשיר מעוקב. לאחר הכנת מסגרת מעוקב פוליקרבונט של חמישה על חמישה מילימטרים, מניחים את המסגרת על מגלשה מקורר מראש ותיבת קרח ולהשתמש פיפטה להוסיף 12 microliters של 1.5% שחומם מראש התעורר מהפנים העליונות של המסגרת מעוקב אל פני השטח התחתון.להפיץ את agarose כדי לקבל משטח שטוח ולאפשר פולימר לרפא. השתמש פינצטה כדי להחליק את המסגרת לקצה הזכוכית ולסובב את המסגרת כך הצד הפתוח פונה כלפי מטה לפני הצבת המסגרת בחזרה על השקופית. לאחר מילוי שני המשטחים הבאים של המסגרת עם יותר agarose, כפי שהודגם רק, טיפת agarose לתוך מיכל מפנים פתוחות כדי ליצור קיר אגרוז בצד הרביעי והחמישי.כדי להגדיר צורת אשכול תאים ראשונית להזריק מטריצה חוץ תאית מתאימה לתרבות התאים של עניין לתוך שטח תרבות קוביית ג'ל היברידית ולהגדיר תבנית מיקרו מפוברק על הקוביה. ואז למקם את הקובייה באינקובטור פחמן דו חמצני במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר המטריצה החוץ-תאית נרפאת, יש להרים בזהירות את תבנית המיקרו כך שהמטריצה לא תתדרדר.כיס בצורת התבנית הרצויה יהיה מפוברק במטריצה החוץ-תאית. כדי לטעון את התאים לרכז את ההשעיה תא ניסיוני לאחר צנטריפוגה במדיום תא הניסוי המתאים להזריק את התאים לכיס בתוך מטריצה חוץ תאית. מניחים את הקובייה לתוך אינקובטור פחמן דו חמצני במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים ליפול לתוך כיס מטריצה חוץ תאית, מילוי החלל שנוצר על ידי עובש מיקרו.בסוף הדגירה, מניחים את הקובייה לתוך באר אחת של צלחת 24 באר ולהוסיף 100 microliters של מדיום תרבות התא המתאים ל הבאר. להזריק מטריצה חוץ תאית נוספת כדי לסגור את הכיס ולהחזיר את הקובייה לאנקובטור במשך 25 דקות. כאשר מטריצה חוץ תאית נרפא טיפה כ 10 microliters של 20 מעלות צלזיוס התעורר על פני השטח העליונים לקוביה כדי לסגור את פני השטח לרפא את הירידה במשך 10 עד 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן מכסים את הקובייה כולה במדיום טרי כדי לקדם לחץ אוסמוטי להקלה על העברת התזונה לתאים בתוך הקובייה. לזיהוי צורה תלת-ממדית לא פולשנית על ידי התבוננות רב-כיוונית, הנח את הלוח על שלב מיקרוסקופ והשג תמונות של כל צד של הקוביה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או ניגודיות פאזה, באמצעות פינצטה כדי לסובב את שירות הקוביה כדי לדמיין אותו בין לכידות. להדמיה אימונופלואורסצננטית על ידי התבוננות רב-כיוונית, ישאף תחילה את העל-טבעי מהקלפיה המכילה את הקובייה ותקן את הקובייה ב-4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף קיבעון, לשטוף את הקובייה פעמיים עם PBS במשך 10 דקות לכל לשטוף. ערערו את הקובייה עם 0.5% טריטון x-100 ו-PBS למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את הקובייה שלוש פעמים PBS במשך 10 דקות לכל לשטוף, לפני חסימת כל מליטה לא ספציפית עם סרום עזים חיץ immunofluorescence במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.ואז להכתים את התאים עם הנוגדן העיקרי המתאים של עניין על פי פרוטוקולי הכתמת נוגדנים סטנדרטיים. ואז תמונה כל ששת הצדדים של הקובייה על לייזר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי כפי שהוכח רק. בניסוי מייצג זה הדמיה רב-כיוונית של קוביות ג'ל היברידיות, המתורבתות בתאי אפיתל אנושיים רגילים, מדגימה את הדור של תרבות תאים גלילית או פריזמה ראשונית בצורת ניגודיות פאזה והדמיה אימונופלואורסצנטית של התרבויות.כאן כתמים חיסוניים של תאי אפיתל אנושיים נורמליים נשלט בתחילה לצורה גלילית בקוביית הג'ל ההיברידית, לאחר הדור של עץ הסופתנות מוצג. הענפים מדגימים את הניצב לציר הגלילי, כפי שנחשף בהדמיה רב-ממדית. חשוב להזריק צפיפות גבוהה של תאים לכיס מטריצה חוץ תאית, כמו צפיפות נמוכה של תאים עלול לגרום להידרדרות של איכות התא לאחר הדגירה.תבנית שיטה זו היא היווצרות חוזרת של תבנית תאית תלת-ממדית עם מדידה כמותית על ידי הדמיה רב-כיוונית כדי לחקור את המנגנון של פיתוח כלים.

initial-3d-cell-cluster-control-hybrid-gel-cube-device-for-repeatable

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מציגים פרוטוקולים אנקפסולציה (3D) 3 ממדי של תאים בתוך הידרוג סינתטי. ההליך המתואר אנקפסולציה עבור שתי השיטות הנפוצות של crosslinking (מייקל מסוג בנוסף ואור יזומה מנגנוני רדיקלים חופשיים), כמו גם מספר טכניקות להערכת התנהגות התא כמוס.

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

אנו מדווחים על מכשיר שיטה חדשה ללמוד תאי עוברים. תאים בודדים מסודרים דווקא מערכי microcavity. כליאת 3D שלהם היא צעד לקראת סביבות 3D נתקלו בתנאים פיסיולוגיים מאפשרת התמצאות אברון. על ידי שליטת צורת תא, התקנה זו ממזערת השתנות שדווחה מבחני תקן.

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

הנכסים ומייקרו של המטריצה ​​תאית מכאניים מאוד משפיעים על הגירת 3D של תאים. שיטה במבחנה ללמוד spatiotemporal התנהגות נדידת תאים בסביבות biophysically משתנים, בשתי רמות אוכלוסייה ותא בודדות, מתואר.

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

מאמר זה מציג גישה פשוטה כדי מתן לא רציפה זנים סטטי מעבר צבע על הידרוג קונצנטריים עמוסי התא לווסת תא היישור עבור הנדסת רקמות.

מעבר צבע למתח שבב עבור מגרה בהתנהגויות הסלולר של הידרוג עמוסי תא

אנו מתארים תהליך רציף להיווצרות בתיווך אור ודפוס ביוכימי לאחר מכן של מטריצות הידרוג'ל סינתטיות ליישומי תרבית תאים תלת מימדיים. מודגמת בנייה ושינוי של הידרוג'לים עם כימיה של פוטו-קליק תואם ציטו. בנוסף, מוצגות טכניקות קלות לכימות והתבוננות בדפוסים וקביעת כדאיות התאים בתוך הידרוג'לים אלה.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

ליגתאי מטריקס ניתן להיות בתבנית על הידרואקרילאמיד הידרו כדי לאפשר את התרבות של תאים גזע האדם העובריים במושבות מוגבלים על מצעים תואמי. שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מיקרוסקופ כוח המתיחה ביוכימיה ביוכימית לבחון את הגומלין בין הגיאומטריה רקמה, כוחות שנוצר התא, ואת מפרט הגורל.

הקמת הגיאומטריה של האדם תא גזע עובריים המושבות על מצעים תואמי כדי לשלוט במכניקה ברמת רקמות

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתאים זעירים ברזולוציה של תא בודד באמצעות הידבקות מתוכנתת DNA. פרוטוקול זה משתמש בפלטפורמת פוטוליטוגרפיה על הספסל כדי ליצור דפוסים של אוליגונוקלאוטידים DNA על שקופית זכוכית ולאחר מכן תוויות קרום התא עם אוליגונוקלאוטידים משלימים זמינים מסחרית. הכלאה של אוליגוס גורמת הידבקות תאים מתוכנתים.

דפוס פשוט, זול ומודולרי של תאים המשתמשים ב- DNA

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פלטפורמה ניסיונית להערכת ההשפעות של רמזים מכניים וביוכימיים על תגובות כימותרפיות של תאי גליובלסטומה שמקורם בחולה בתרביות מטריצה-מימטיות תלת-ממדיות באמצעות התקן תאורת UV מותאם אישית המאפשר פוטו-קרוסלינקינג בתפוקה גבוהה של הידרוג'לים עם תכונות מכניות הניתנות לכוונון.

מערכי הידרוג'ל מאפשרים תפוקה מוגברת לסינון השפעות של רכיבי מטריצה וטיפולים במודלים תלת-ממדיים של גידולים

באופן מסורתי, תרבית תאים מבוצעת על מצעים מישוריים המחקים בצורה גרועה את הסביבה הטבעית של תאים in vivo. כאן אנו מתארים שיטה לייצור מצעי תרביות תאים עם גיאומטריות מעוגלות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית וחלבונים חוץ-תאיים מיקרו-פטרייתיים, המאפשרת חקירה שיטתית של חישה תאית של רמזים חוץ-תאיים אלה.

יצירת מיקרו-סביבה תאית רב-תכליתית על-ידי UV-Photopatterning של מצעי תרביות תאים תלת-ממדיים

ספרואידים של תאים נחשבו למודל פוטנציאלי אחד בתחום היישומים הביולוגיים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לייצור מדרגי של ספרואידים של תאים באמצעות התקן הרכבה אקוסטית תלת-ממדית, המספק שיטה יעילה לייצור חזק ומהיר של ספרואידים אחידים של תאים.

התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדי לייצור המוני של ספרואידים סלולריים

פרוטוקול להערכה כמותית של נדידת תאים תלת מימדיים בתוך ולתוך הממשק של הידרוג'לים גרגירים מוצג כאן.

כימות נדידת תאים תלת מימדית בתוך ובתוך ביו-חומרים הידרוג'ל גרגירים

למד שיטה לשליטה בצורת אשכולות תאים תלת-ממדיים באמצעות מכשיר קובייתי עם הידרוג'לים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה רב-כיוונית ויצירת דפוסים חוזרת בחקר הנדסת רקמות.

שליטה אשכול הראשונית תא 3D היברידית ג'ל קוביה התקן עבור תצורות דפוס הדיר

גלה סרטונים נוספים