Overexpressing RNAs Noncoding זמן באמצעות הפעלת גנים CRISPR

ל- RNAs שאינם קידוד יש לעתים קרובות צורות מרובות. במחקרי דיכוי יתר במבחנה, לעתים קרובות קשה ללמוד את כל אלה isoforms לידי ביטוי. טכניקה זו מאפשרת למשתמשים להפיק ביטוי ישירות מן הגנום ולאפשר לתאים לבטא את isoforms אנדוגני עבור RNA מסוים שאינו קידוד.

טכניקה רבת עוצמה זו מאפשרת למשתמש לכוון באופן ספציפי את הביטוי של כל גן בגנום בנאמנות ובדיוק. על ידי תכנון RNAs מדריך לגנים ספציפיים, אחד הוא מסוגל להשתמש במכונות שידוך גנים אנדוגני לבטא את isoforms הטבעי בתא נתון. הדגמת ההליך תהיה רוברט רנקין, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.

כדי לעצב את רצף RNA המדריך אשר ממוקם בתוך 100 זוגות בסיס של אתר ההתחלה שעתוק, להשתמש במסדי נתונים גנטיים כגון BLAT כדי לוודא כי RNA המדריך הוא ייחודי לגן של עניין. אחסן את המדריך RNA ואת פלסמיד Cas9 מנוטרל בארבע מעלות צלזיוס. פסים החוצה E.coli על צלחת אגר מרק לוריא עם אמפיצילין ולגדל את החיידקים לילה ב 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, לבחור מושבה ולגדל את החיידקים בחמישה מיליליטר של LB עם אמפיצילין לילה, במרץ לנער את הצינור באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. למחרת, להוסיף שני מיליליטר של חיידקים ל 200 מיליליטר של LB עם אמפיצילין בבקבוק שני ליטר, במרץ לנער את הבקבוק לילה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. לסובב את החיידקים ב 3, 724 פעמים g במשך 20 דקות ולהמשיך לטיהור DNA.

כדי ליצור את dCas9 המכיל lentivirus, המעיל הראשון 100 מיליליטר רקמת תכלת מנות עם חמישה מיליליטר של 0.01% פולי-L-ליזין צלחת חמישה מיליון תאי HEK293T לכל מנה ב 10 מיליליטר של מלא של דולבקו שונה נשרים בינוני, לאחר מכן להכין דגימות transfection DNA על ידי ערבוב 10 מיקרוגרם של וקטור RNA מדריך המכיל LTR או וקטור Cas9 מושבת המכיל LTR עם פלסמידים המכילים רכיבים של וירוסים. מוסיפים מים לנפח כולל של 450 מיקרוליטרים ומסננים את התערובת דרך קצה מסנן 0.2 מיקרון המחובר למזרק. לאחר מכן, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של 2.5-דיכלוריד סידן טוחן לכל דגימת transfection של ה-DNA ומערבבים בעדינות.

מסננים את תערובת הסידן-DNA דרך קצה מסנן 0.2 מיקרון המחובר למזרק. פיפטה 500 מיקרוליטרים של HBS 2X לתוך צינור פוליסטירן חמישה מיליליטר. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של תערובת הסידן-DNA dropwise ומערבולת בעדינות.

דגירה בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות. הוסיפו מיליליטר אחד של מתלי ה-DNA-סידן HBS לכל צלחת תרבות רקמות המכילה HEK293T והדגירה אותם באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. ביום השלישי, לאט להסיר ולהשליך את התקשורת מן הכלים.

בזהירות לשטוף את התאים עם PBS פעם אחת. הוסף שישה מיליליטר של DMEM מלא בתוספת HEPES 20 מילימולרים ו 10 מילימולר נתרן butyrate. ואז להתבגר בתאים באינקובטור 5%פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד שש שעות.

לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם PBS פעם אחת ולהוסיף חמישה מיליליטר של DMEM מלא עם HEPES 20 מילימולרי לתאי HEK293T. אין לארוב את התאים באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. ביום הרביעי, לאסוף את HEK293T תא supernatants ולסנן את supernatant המכיל את הנגיף.

כדי להתחיל את ספירת החלקיקים הנגיפיים, תחילה לדלל את תרכיז לשטוף מערכת P24 ELISA על ידי הוספת 19 חלקים של מים מזוקקים, deionized. לאחר מכן, לדלל את השליטה החיובית ערכה זו ל 200 ננוגרם למיליליטר באמצעות RPMI 1640 כמו diluent ולעשות דילול עבור עקומה סטנדרטית צינורות 1.5 מיליליטר על פי טבלת דילול P24 ELISA. כדי למדוד את ריכוז הנגיף בתוך הדגימות להוסיף את דילול המדגם ל בארות המיועדות של צלחת 96 באר, החל 1:1000 דילול ולשנות את הנפח לפי הצורך על מנת להיות בטווח של העקומה הסטנדרטית.

לאחר מכן לדלל את הדגימות עם טריטון X-100 לריכוז סופי של 0.5%, ולהוסיף 200 microliters של כל מדגם ו RPMI 1640 ל בארות המיועדות. לאטום את הצלחת ולהדיגר אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לשטוף את הצלחת עם 300 microliters לכל באר של חיץ לשטוף 1X שש פעמים.

הסר כל נוזל עודף על ידי היפוך הצלחת והקשה עליו על מגבת נייר. לאחר מכן להוסיף 100 microliters של נוגדן גלאי מהערכה לכל בארות למעט המצע ריק. לאטום את הצלחת ו דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

לשטוף את הצלחת ולאחר מכן להסיר כל נוזל עודף על ידי היפוך הצלחת הקשה על מגבת נייר. על מנת למדוד את הנוגדן גלאי, לדלל את חזרת סטרפטבידין peroxidase ב 1:100 דילול עם DILUENT SA-HRP. מערבבים את SA-HRP מדולל ביסודיות ולהוסיף 100 microliters לכל בארות למעט ריק.

לאטום ולהדרור את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת עם חיץ לשטוף 1X ולהברז משם כל נוזל עודף. זרוק טבליה אחת אורתו-פנילנדיאמין ב 11 מיליליטר של דילואנט המצע כדי להפוך את פתרון מצע מספיק עבור צלחת אחת.

Vortex פתרון OPD במרץ כדי להמיס אותו לחלוטין ולהגן עליו מפני אור. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון מצע OPD לכל בארות כולל הריק. באמצעות ספקטרופוטומטר, יש לקרוא את הספיגה ב-450 ננומטר באופן מיידי.

חזור על 10 פעמים במרווחים של שנייה אחת וקח את המדידה הממוצעת. Resuspend ותרבות Jurkat T-תאים בבקבוק T75 עם צפיפות של מיליון תאים בחמישה מיליליטר של מדיה סרום מופחת עם פוליברן. לאחר מכן הוסיפו מדיה המותנה ב-HEK293T המכילה מיליון חלקיקים נגיפיים המכילים dCas9.

דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. שלושה ימים לאחר ההדבקה, לסובב את התאים ב 233 זמן g במשך חמש דקות ו resuspend אותם 10 מיליליטר של DMEM מלא בתוספת puromycin. תרבו את התאים בבקבוקי T75 ודגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

כל יום שלישי לתקופה של תשעה ימים, לסובב את התאים ב 233 פעמים g במשך חמש דקות ולהחליף את המדיה עם DMEM מלא בתוספת puromycin. ספור את התאים באמצעות מד חמוציט או מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן, על צלחת 96 באר עם רקמה שטופלה בתרבות הרקמה, להוסיף 10, 000 תאים ב 100 microliters של DMEM מלא בתוספת puromycin ב ובכר הראשונה.

בצע דילול סדרתי של 1:1 של התוכן של הבארות הבאות עם DMEM מלא בתוספת puromycin. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. הרחב את תאי שיבוט לשתי צלחות 24 בארות, ולאחר מכן צלחת שני מיליון תאים לכל באר של צלחת שש באר עבור שלושה שיבוטים.

צלחת שלוש בארות אחרות עם תאי Jurkat שאינם מתומרים כמו פקדים. לבסוף, צלחת התאים לתוך בקבוק T75 ולשים את התאים באינקובטור תרבות התא לילה. כדי להתחיל PCR כמותי כדי למדוד ביטוי גנים, תחילה לסנתז DNA משלים על ידי הוספת מיקרוגרם אחד של RNA, ארבעה microliters של מאגר סינתזה cDNA, ומיקרוליטר אחד של תעתיק הפוך ל 250 צינורות microliter, ולאחר מכן להוסיף מים לנפח הסופי של 20 microliters.

לאחר מכן, השתמש במחזור תרמי ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות וב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להשבית את התמלול ההפוך. לדלל את cDNA עם 60 microliters של מים לאחר הסינתזה. הפעל תגובות שרשרת פולימראז עבור צינורות המכילים 0.5 microliters של כל פריימר קדימה ואחורי בריכוז הסופי של 10 micromolar, חמישה microliters של ירוק SYBR, וארבעה microliters של cDNA.

לבסוף בחר בתאי Jurkat-dCas9 ב- DMEM בתוספת Hygromycin B במשך 10 ימים. סובב את התאים ושנה את המדיה כל שלושה ימים. לטהר RNAse ולהמשיך RT-qPCR.

במחקר זה, רצפי gRNA שהיו במרחק של 10 עד 100 זוגות בסיסים מאתר ההתחלה של שעתוק שימשו להכוונת המתחם המופעל על ידי Cas9 אל הארבה התמלולית של IFNG-AS1, RNA ארוך שאינו קידוד הקשור למחלות מעי דלקתיות. כדי לאפשר את הבחירה של תאים כפולים שהתווספו, נעשה שימוש במערכת דו-פלסמיד כדי להתגנות משפרי dCas9 או gRNAse לתאים. כאן חלבוני MS2 משפרים את לחץ-יתר של IFNG-AS1.

ביטוי Cas9 אושר עבור שני השיבוטים. פריימרים נגד HPRT1 שימשו לאישור נוכחות של RNA בתאים שאינם מתמרים. ביטוי mRNA אושר על ידי השמטת התמלול ההפוך מתגובת cDNA.

ניתן לזהות שלוש גרסאות splice של IFNG-AS1 עם ערכות פריימר ספציפיות לתעתיק או ערכת פריימר כנגד כל תעתיקי IFNG-AS1 הידועים. כל עקומות הפלואורסצנטיות היו אקספוננציאליות כאשר גן משק הבית HPRT1 הגיע לשלב המעריכי בתוך חצי מחזור בין שליטה לתאי ביטוי של IFNG-AS1 gRNA. פריימרים כנגד כל התמלילים הידועים של IFNG-AS1 היו הבולטים ביותר בין הניסויים, עם מדידות של גידולים של פי 20 בביטוי IFNG-AS1.

עם זאת, התמליל השלישי של IFNG-AS1 הראה עלייה משמעותית של פי חמישה עד עשרה ברמות IFNG-AS1. כדי להדחיק באופן פעיל את הגן הרצוי, העיצוב של המדריך RNA בשלב 2.1 הוא קריטי להצלחת הפרוטוקול. בנוסף, ייצור של חלקיקים נגיפיים איכותיים יבטיח ביטוי חזק של רכיבי הפרוטוקול שלך.

לאחר שהגן הרצוי מדוכא יתר על כן, ניתן לבצע מחקרים תפקודיים כדי לחקור את מנגנוני הגנים. בדוגמה שלנו, בחרנו להסתכל על ייצור ציטוקין בעקבות לחץ יתר של הגן שלנו של עניין. טכניקה זו פותחה בתחילה על ידי קבוצת גריסבאך בשנת 2013 והוחלה בהרחבה והורחבה על ידי קבוצות אחרות.

התרגשנו ליישם טכניקה זו על RNAs ארוכים שאינם מקודדים על מנת לחקור את הפונקציות הספציפיות שלהם. lentiviruses פגום שכפול צריך להיות מטופל במעבדה שאושרה לעבודה ויראלית. בנוסף, קווי תאים אנושיים וחיידקי E.coli נחשבים biohazardous.

לבסוף, פלסמיד DNA רקומביננטי צריך להיות מטופל על ידי צוות מיומן.