ניתוח של מתחמי שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי בתאים תרבותי אנושי באמצעות כחול מקורי לזיהוי בג'ל ו- Immunoblotting

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד מקורית כחולה מאפשרת ניתוח של קומפלקסים בטקט של מערכת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי. זוהי טכניקה נוחה וזולה שניתן להשתמש בה כדי כיסוי הרכבה של מתחמים שלמים של מערכת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי. כדי להכין את lysates המיטוכונדריאלי, תחילה להשתמש בתתכונת PBS קר כקרח לשטוף בעדינות את התאים פעם אחת.

לגרד את התאים גלולה אותם בארבע מעלות צלזיוס ב 800 G במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף את גלולת התא פעמיים עם PBS קר כקרח צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ב 800 G במשך 10 דקות. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של מעכב פרוטאז 100x ל 20 מיליליטר של PBS.

להשעות מחדש את התאים בתערובת מעכבי פרוטאז PBS לריכוז חלבון סופי של חמישה מיליגרם למיליליטר. כדי להכין 3.3 digitonin מילימולרי PBS עם מעכב פרוטאז, להמיס ארבעה מיליגרם של דיגיטונין במיליליטר אחד של PBS ב 100 מעלות צלזיוס עד לא משקע גלוי. מצננים על קרח מיד ומוסיפים 10 מיקרוליטרים של מעכב פרוטאז 100x למיליליטר אחד של פתרון הדיגיטונין.

לאחר מכן, מוסיפים את תערובת מעכבי פרוטאז דיגיטונין לתאים בריכוז הסופי של 1.65 מילימולר. מערבבים היטב, ודגירה על קרח במשך חמש דקות. לאחר מכן, מוסיפים את תערובת מעכבי הפרוטאז PBS לתאים לנפח הסופי של 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ב 10, 000 G במשך 10 דקות. הסר את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת המיטוכונדריה במאגר המיטוכונדריאלי. הכינו מיליליטר אחד של 10%loreal טריים המודרים בתספור מעכבי PBS.

הוסיפו 10% לוריאלים המיטוכונדריה בריכוז הסופי של 1% דגירה על קרח למשך 15 דקות לפחות. צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ב 20, 000 G במשך 20 דקות. לאסוף את supernatant לתוך צינור חדש ולהוסיף את המאגר מדגם.

כדי להכין את הג'ל ההדרגתי לדף מקורי כחול, מניחים תחילה את יצרנית השיפוע על צלחת ערבוב ומחברים אותה עם צינורות גמישים למשאבה ההיסטנטית. צרף ערכת עירוי עם מחט לאמבטיה. מניחים מערבל מגנטי בתא הפרוקסימלי של יצרנית השיפוע ושוטפים את הצינור במים מזוקקים במהירות המשאבה המרבית למשך 10 דקות.

לאחר מכן, רוקנו את הצינור ואת יצרנית השיפוע. השתמש פיפטה כדי להסיר את כל שאריות מים מזוקקים בתעלה בין התאים של היצרן שיפוע. סגור את התעלה ואת הצינור עם השסתום.

להרכיב שתי צלחות זכוכית במחזיק ולה מניח אותו על הדוכן. באמצעות החור בתחתית מחזיק הג'ל, מניחים את המחט מחובר צינורות בין צלחות הזכוכית. כדי להכין ג'ל 8.3 על 7.3 ס"מ, הכינו תחילה 6% ו-15% ג'ל והמשיכו על הקרח.

מערבבים אותם בעדינות כדי למנוע ביצוע בועות אוויר. לאחר מכן, לטעון את הקצה הפרוקסימלי של תא צינורות מערבל ג'ל הדרגתי עם 2.6 מיליליטר של 6% ג'ל ואת הקצה הדיסטלי עם 2.1 מיליליטר של 15% ג'ל. לאחר מכן, הפעל את המערבב המגנטי ופתח את הצינורות ואת התעלה בין התאים של יצרנית השיפוע.

מיד להפעיל את המשאבה peristaltic לחמישה מיליליטר לדקה. ממלאים את צלחות הזכוכית ומסירים את המחט כשאין ג'ל בצנרת. יש לייסוף בעדינות את הג'ל במים מזוקקים ולשמור את הג'ל בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות.

לשטוף את הצינור מיד על ידי מילוי התאים שיפוע עם מים מזוקקים באמצעות המשאבה peristaltic במהירות המרבית. מוסיפים שישה מיליליטר של המים המזוקקים לשלושה מיליליטר של חיץ ג'ל 3x כדי להפוך חיץ ג'ל 1x. בעזרת נייר סינון, מוציאים בעדינות את המים המזוקקים מפני השטח של הג'ל.

לשטוף את פני השטח של הג'ל עם מאגר ג'ל 1x, בעדינות להסיר את המאגר עם נייר המסנן. הכינו 4% ג'ל לערום לפי כתב היד. מערבבים בעדינות כדי למנוע ביצוע בועות אוויר.

לאחר מכן, מניחים את המסרק בין צלחות הזכוכית ויוצקים את ג'ל הערימה מתחת ל מסרק. לטבול את המסרק באופן מלא. תן לג'ל הערימה להתגמש לפחות 30 דקות.

לאחר מכן, להסיר את המסרק ולהשתמש פיפטה לשטוף את בארות עם חיץ ג'ל 1x. כדי לבצע את אלקטרופורזה ג'ל כחול יליד, הראשון, להוסיף את מאגר קתודה כחולה לקלטת ג'ל. השתמש פיפטה לשטוף ולמלא את בארות עם מאגר קתודה כחול.

לאחר מכן, לטעון חמישה עד 30 מיקרוגרם של דגימות חלבון לתוך בארות. ממלאים בעדינות את קלטת הג'ל לפסגה במאגר הקטודה הכחול, ובמיכל עם מאגר האנודה. ראשית, להפעיל את הג'ל במתח קבוע של 40 וולט במשך 15 דקות.

לאחר מכן, להגדיל את המתח ל 80 וולט. מפעילים את הג'ל עד שהצבע מגיע ל-2/3 מאורך הג'ל. החלף את חיץ הקתודה הכחול עם חיץ הקתודה והמשך אלקטרופורזה עד שחזית הצבע תברח מהג'ל.

אחזר את צלחות הזכוכית והעבר את החלבונים לממברנה PVDF על ידי כתמים יבשים למחצה. השתמש במתח קבוע של 25 וולט זרם מוגבל אמפר אחד במשך 30 דקות. הרכבה של קומפלקסים שרשרת הנשימה בתאי נוירובלסטומה אנושית עכבות על טיפול chloramphenicol בהשוואה לתאי הבקרה ללא טיפול.

לעומת זאת, מתחמים המקודדים על ידי הגנים הגרעיניים היו מוסדרים. השפלה של מתחמי זרחון חמצוני נצפתה על מחזורי הפשרת הקפאה מרובים. איכות הג'ל יכולה להשפיע על זיהוי מתחמי הזרחון החמצוני.

כמו כן, הפשטת הממברנה הורידה את יחס האות לרעש. בעת ביצוע ההליך, חשוב לזכור לבצע הכנה פשוטה אלקטרופורזה ג'ל בתנאים קרים כדי לשמר קומפלקסים OXPHOS טקט. בעקבות דף יליד כחול, דף SDS ממד שני ניתן להחיל כדי ללמוד את תת יחידות החלבון של קומפלקסים שרשרת הנשימה.

דף מקורי כחול מאפשר לחוקרים לחקור את ההרכבה של קומפלקסים ואפילו קומפלקסים סופר של מערכת זרחון חמצוני.