ניתוח של מתחמי שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי בתאים תרבותי אנושי באמצעות כחול מקורי לזיהוי בג'ל ו- Immunoblotting
12 בפברואר 2019
פרוטוקול זה מדגים הניתוח קומפלקסי שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי מאת כחול מקורי לזיהוי בג'ל. כאן מתוארת השיטה להחיל בתרבית תאים אנושיים.
אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד מקורית כחולה מאפשרת ניתוח של קומפלקסים בטקט של מערכת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי. זוהי טכניקה נוחה וזולה שניתן להשתמש בה כדי כיסוי הרכבה של מתחמים שלמים של מערכת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי. כדי להכין את lysates המיטוכונדריאלי, תחילה להשתמש בתתכונת PBS קר כקרח לשטוף בעדינות את התאים פעם אחת.
לגרד את התאים גלולה אותם בארבע מעלות צלזיוס ב 800 G במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף את גלולת התא פעמיים עם PBS קר כקרח צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ב 800 G במשך 10 דקות. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של מעכב פרוטאז 100x ל 20 מיליליטר של PBS.
להשעות מחדש את התאים בתערובת מעכבי פרוטאז PBS לריכוז חלבון סופי של חמישה מיליגרם למיליליטר. כדי להכין 3.3 digitonin מילימולרי PBS עם מעכב פרוטאז, להמיס ארבעה מיליגרם של דיגיטונין במיליליטר אחד של PBS ב 100 מעלות צלזיוס עד לא משקע גלוי. מצננים על קרח מיד ומוסיפים 10 מיקרוליטרים של מעכב פרוטאז 100x למיליליטר אחד של פתרון הדיגיטונין.
לאחר מכן, מוסיפים את תערובת מעכבי פרוטאז דיגיטונין לתאים בריכוז הסופי של 1.65 מילימולר. מערבבים היטב, ודגירה על קרח במשך חמש דקות. לאחר מכן, מוסיפים את תערובת מעכבי הפרוטאז PBS לתאים לנפח הסופי של 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ב 10, 000 G במשך 10 דקות. הסר את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת המיטוכונדריה במאגר המיטוכונדריאלי. הכינו מיליליטר אחד של 10%loreal טריים המודרים בתספור מעכבי PBS.
הוסיפו 10% לוריאלים המיטוכונדריה בריכוז הסופי של 1% דגירה על קרח למשך 15 דקות לפחות. צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ב 20, 000 G במשך 20 דקות. לאסוף את supernatant לתוך צינור חדש ולהוסיף את המאגר מדגם.
כדי להכין את הג'ל ההדרגתי לדף מקורי כחול, מניחים תחילה את יצרנית השיפוע על צלחת ערבוב ומחברים אותה עם צינורות גמישים למשאבה ההיסטנטית. צרף ערכת עירוי עם מחט לאמבטיה. מניחים מערבל מגנטי בתא הפרוקסימלי של יצרנית השיפוע ושוטפים את הצינור במים מזוקקים במהירות המשאבה המרבית למשך 10 דקות.
לאחר מכן, רוקנו את הצינור ואת יצרנית השיפוע. השתמש פיפטה כדי להסיר את כל שאריות מים מזוקקים בתעלה בין התאים של היצרן שיפוע. סגור את התעלה ואת הצינור עם השסתום.
להרכיב שתי צלחות זכוכית במחזיק ולה מניח אותו על הדוכן. באמצעות החור בתחתית מחזיק הג'ל, מניחים את המחט מחובר צינורות בין צלחות הזכוכית. כדי להכין ג'ל 8.3 על 7.3 ס"מ, הכינו תחילה 6% ו-15% ג'ל והמשיכו על הקרח.
מערבבים אותם בעדינות כדי למנוע ביצוע בועות אוויר. לאחר מכן, לטעון את הקצה הפרוקסימלי של תא צינורות מערבל ג'ל הדרגתי עם 2.6 מיליליטר של 6% ג'ל ואת הקצה הדיסטלי עם 2.1 מיליליטר של 15% ג'ל. לאחר מכן, הפעל את המערבב המגנטי ופתח את הצינורות ואת התעלה בין התאים של יצרנית השיפוע.
מיד להפעיל את המשאבה peristaltic לחמישה מיליליטר לדקה. ממלאים את צלחות הזכוכית ומסירים את המחט כשאין ג'ל בצנרת. יש לייסוף בעדינות את הג'ל במים מזוקקים ולשמור את הג'ל בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות.
לשטוף את הצינור מיד על ידי מילוי התאים שיפוע עם מים מזוקקים באמצעות המשאבה peristaltic במהירות המרבית. מוסיפים שישה מיליליטר של המים המזוקקים לשלושה מיליליטר של חיץ ג'ל 3x כדי להפוך חיץ ג'ל 1x. בעזרת נייר סינון, מוציאים בעדינות את המים המזוקקים מפני השטח של הג'ל.
לשטוף את פני השטח של הג'ל עם מאגר ג'ל 1x, בעדינות להסיר את המאגר עם נייר המסנן. הכינו 4% ג'ל לערום לפי כתב היד. מערבבים בעדינות כדי למנוע ביצוע בועות אוויר.
לאחר מכן, מניחים את המסרק בין צלחות הזכוכית ויוצקים את ג'ל הערימה מתחת ל מסרק. לטבול את המסרק באופן מלא. תן לג'ל הערימה להתגמש לפחות 30 דקות.
לאחר מכן, להסיר את המסרק ולהשתמש פיפטה לשטוף את בארות עם חיץ ג'ל 1x. כדי לבצע את אלקטרופורזה ג'ל כחול יליד, הראשון, להוסיף את מאגר קתודה כחולה לקלטת ג'ל. השתמש פיפטה לשטוף ולמלא את בארות עם מאגר קתודה כחול.
לאחר מכן, לטעון חמישה עד 30 מיקרוגרם של דגימות חלבון לתוך בארות. ממלאים בעדינות את קלטת הג'ל לפסגה במאגר הקטודה הכחול, ובמיכל עם מאגר האנודה. ראשית, להפעיל את הג'ל במתח קבוע של 40 וולט במשך 15 דקות.
לאחר מכן, להגדיל את המתח ל 80 וולט. מפעילים את הג'ל עד שהצבע מגיע ל-2/3 מאורך הג'ל. החלף את חיץ הקתודה הכחול עם חיץ הקתודה והמשך אלקטרופורזה עד שחזית הצבע תברח מהג'ל.
אחזר את צלחות הזכוכית והעבר את החלבונים לממברנה PVDF על ידי כתמים יבשים למחצה. השתמש במתח קבוע של 25 וולט זרם מוגבל אמפר אחד במשך 30 דקות. הרכבה של קומפלקסים שרשרת הנשימה בתאי נוירובלסטומה אנושית עכבות על טיפול chloramphenicol בהשוואה לתאי הבקרה ללא טיפול.
לעומת זאת, מתחמים המקודדים על ידי הגנים הגרעיניים היו מוסדרים. השפלה של מתחמי זרחון חמצוני נצפתה על מחזורי הפשרת הקפאה מרובים. איכות הג'ל יכולה להשפיע על זיהוי מתחמי הזרחון החמצוני.
כמו כן, הפשטת הממברנה הורידה את יחס האות לרעש. בעת ביצוע ההליך, חשוב לזכור לבצע הכנה פשוטה אלקטרופורזה ג'ל בתנאים קרים כדי לשמר קומפלקסים OXPHOS טקט. בעקבות דף יליד כחול, דף SDS ממד שני ניתן להחיל כדי ללמוד את תת יחידות החלבון של קומפלקסים שרשרת הנשימה.
דף מקורי כחול מאפשר לחוקרים לחקור את ההרכבה של קומפלקסים ואפילו קומפלקסים סופר של מערכת זרחון חמצוני.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג שיטה לניתוח קומפלקסים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד במצב טבעי כחול (BN-PAGE). הטכניקה מיושמת על תאי אדם מתורגבים כדי להעריך את הרכבתם של קומפלקסי הפספורילציה החמצונית המיטוכונדריאלית.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המחקר
- ביולוגיה של מיטוכונדריה
- חמצון זרימתי (Oxidative phosphorylation)
- טכניקות של אלקטרופורזה
רקע
- קומפלקסים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית חיוניים לייצור ATP.
- הבנת ההרכבה והתפקוד שלהם היא מפתח במחקרי מטבוליזם תאי.
- Blue native PAGE היא טכניקה שימושית לניתוח קומפלקסי חלבונים שלמים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד בשיטת Blue native
- תאי נוירובלסטומה אנושיים
- טכניקות של שקיעת חלבונים והעברה לממברנה
תוצאות עיקריות
- טיפול ב-Chloramphenicol עיכב את ההרכבה של קומפלקסים של שרשרת הנשימה.
- נצפתה רגולציה למעלה (Up-regulation) של קומפלקסים המקודדים בגרעין בתאים שעברו טיפול.
- מחזורי הקפאה-הפשרה מרובים השפיעו על הפירוק של קומפלקסים של פוספורילציה חמצונית.
מסקנות
- מחקר זה מדגים את היתרונות של BN-PAGE לניתוח קומפלקסים מיטוכונדריאליים.
- הוא מדגיש את חשיבות התנאים בשמירה על השלמות של קומפלקסי ה-OXPHOS.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכת ההרכבה והיציבות של קומפלקסי הפספורילציה החמצונית (OXPHOS) המיטוכונדריאלית היא קריטית לתיקוף מטרות במחקר על מחלות מטבוליות ונוירופרמקולוגיה. electrophoresis בג'ל נטיבי כחול (BN-PAGE) מאפשרת הערכה ישירה של קומפלקסי חלבונים שלמים, ומספקת תובנה מכניסטית לגבי תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי המושרה על ידי תרכובות או תגובות הסתגלות. דבר זה תומך בהפחתת סיכונים בשלבים מוקדמים על ידי קישור מעורבות המטרה (target engagement) לתפוקת OXPHOS תפקודית במודלים של תאי אנוש הרלוונטיים למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות פיתרון מצבי ההרכבה של קומפלקסים של OXPHOS כדי להבהיר את מנגנון הפעולה.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות ויזואליזציה ישירה של שלמות הקומפלקס תחת הפרעה תרכובתית או גנטית.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי הבחנה בין השפעות של קומפלקסים המקודדים ב-DNA מיטוכונדריאלי לעומת כאלו המקודדים בגרעין, ובכך מספק מידע על מידת הביטחון במטרה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: הכנה של ליזאטים מיטוכונדריאליים סטנדרטיים להפרדה אלקטרופורטית הדירה של קומפלקסוֹי OXPHOS.
- תוצר כמותי: יצירת פסי קומפלקסים ניתנים להבחנה המאפשרים השוואה חצי-כמותית בין תנאי טיפול שונים.
- תועלת הפלטפורמה: ביסוס שיטה בעלת יכולת הרחבה ובעלות נמוכה להערכה שגרתית של הרכבת קומפלקסים מיטוכונדריאליים במסלולי סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: חל על תאי אדם בתרבית, ומאפשר מידול טרנסלציונלי של הפרעות מיטוכונדריאליות ונוירוטוקסיות.
- המשכיות מנגונית: מגשר בין ממצאי גילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי אישור השפעות מתווכות מטרה על הרכבת ה-OXPHOS.
- החלטות מותאמות סיכון: מזהה דגרדציה מורכבת הנובעת מארטפקטים של טיפול בדגימות (למשל, הקפאה-הפשרה), ובכך משפר את אמינות הנתונים עבור קריטריוני go/no-go.
שילוב תהליכי עבודה ושרשראות עיבוד
שיטת BN-PAGE משתלבת ברצף הגילוי, החל מאישוש ראשוני של המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה, כאשר הערכת הנזק המיטוכונדריאלי מנחה את קידומה של התרכובת.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי פתרון הרכבת קומפלקסי OXPHOS כדי להבהיר השפעות ברמת המסלול של מודולטורים.
- סינון (Screening): מאפשר הכנת מיטוכונדריה המוכנה לבדיקה עם שמירה על שלמות הקומפלקסים לצורך סינון תרכובות.
- אנליזה: מספק הפרדה אלקטרופורטית וזיהוי באמצעות אימונובלוט של קומפלקסי OXPHOS כקריאה פונקציונלית לניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית באמצעות שימוש בתאים ממקור אנושי, ותומך במעקב מכניסטי המותאם לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה מודולרית וניתנת לשימוש חוזר לניתוח קומפלקסים מיטוכונדריאליים במגוון פרויקטים ותחומים טיפוליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון תחזיתי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות במנגנון הפעולה המיטוכונדריאלי.
- ערך תפעולי: מציע שיטה סטנדרטית, זולה וניתנת לשחזור לניתוח קומפלקסים של OXPHOS.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של ליאביליות מיטוכונדריאלית, ובכך מפחית את סיכון הנשירה בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתיעוד ותיעדוף מותאם סיכון על ידי הבחנה בין השפעות מיטוכונדריאליות ממוקדות מטרה (on-target) לבין שיבוש קומפלקסים שאינו ממוקד מטרה (off-target) או כזה הנובע מארטיפקטים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד מיטוכונדריה ובטכניקות של אלקטרופורזה טבעית (native electrophoresis).
- תלוי בגישה לציוד ג'ל גרדיאנט, צנטריפוגות בטמפרטורה נמוכה ותשתיות עבור אימונו-בלוטינג (immunoblotting).
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים בין צוותים כדי להבטיח עקביות בשימור ובזיהוי של קומפלקסים.
- חייב להתחשב במגבלות הטיפול בדגימות, כולל הימנעות ממספר מחזורי הקפאה-הפשרה שעלולים להוביל לפירוק של קומפלקסי OXPHOS.
- נשען על שמירה של תנאי קור לאורך כל תהליך ההכנה והאלקטרופורזה כדי לשמר את מבני הקומפלקסים השלמים.
