Name: מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: למדו למדוד קצב צריכת חמצן ב־Caenorhabditis elegans חי ללא בידוד מיטוכונדריה. פרוטוקול זה מאפשר הערכת תפקוד מיטוכונדרי מדויקת במחקר גנטי ובריאות תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להכיר את ד ר קווין Bittman להדרכה שלו בהקמת את XFp סוסון ים במעבדה. מכוני הבריאות הלאומיים הענק ש-gm088213 נתמך עבודה זו.

הערה: איור 2 מספק מבט סכמטי של פרוטוקול מלא.
1. צמיחה וסינכרון של האוכלוסייה נמטודות9,10
<ol><li>העברת L4 הזחלים של רקע גנטי הרצוי (למשל, N2 [wild type] ובעלי sel-12) על גבי נמטודות מדיה (NGM) לוחיות גדילה (ראה טבלה 1 למתכון) טרי נזרע עם מדשאה Escherichia coli (OP50)11. להשתמש לפחות שני 100 מ"מ או שלוש צלחות 60 מ מ עבור כל זן. דגירה התולעים בטמפרטורה המתאימה צמיחה (בין 15-25 ° C) במשך 3-4 ימים או עד שהצלחות מרוכז עם מספר רב של ביצים ותולעים gravid.</li>
	<li>לשטוף ביצים עם תולעים מהצלחות, באמצעות כ- 6 מ של מאגר M9 (ראה טבלה 1 למתכון) לכל 100 מ מ צלחת של נמטודות ולהעביר אותם עם זכוכית פיפטות פסטר לתוך צינורות בודדים 15 מ"ל צנטריפוגה עבור כל זן. ספין הצינורות האלה למטה למשך 3 דקות ב- 6,180-g ולשאוב החוצה מאגר M9, שמירה רק בגדר חיות וביצים.</li>
	<li>להוסיף 3-4 מ"ל של פתרון אקונומיקה (ראה טבלה 1 למתכון) כל שפופרת, לסירוגין מערבולת עבור מאגר M9 להוסיף 6 מינימלית למלא כל שפופרת, ספין-6,180 x g עבור 1 דקות, תשאף תגובת שיקוע. חזור על זה לשטוף עם M9 שלוש פעמים ולהעביר בגדר ביצה אל צינור טריים 15 מ"ל המכיל כ- 9 מ של מאגר M9.</li>
	<li>לסנכרן התולעים המקווקו טרי על ידי nutating ב 20 מעלות צלזיוס במשך 16 – 48 ה ספין הצינורות האלה למטה ב 6,180 g x 1.5 דקות ואני אוריד את החיות L1 מסונכרן על לוחות NGM בודדים נזרע טרי עם מדשאה של OP50 (כ 6,000 – 10,000 בעלי. חיים לכל צלחת 100 מ מ) לשמור 20 º C.</li>
	<li>בעלי חיים אלה מגיעים הזחל L4 לאחר ~ 42 h. בשלב זה, להעביר הזחלים L4 באמצעות איסוף פלטינה כדי OP50 נזרע NGM צלחות המכילה 0.5 מ ג / מ ל 5-פטור-2'-deoxyuridine (FUdR) כדי למנוע מהם בהפקת רומא. הערה: ודא כי במסגרת ניסוי כל זני מסונכרנים עבור כמות דומה של זמן. FUdR טיפול sterilizes החיות ומונעת ביצה הנחת על רומא הייצור, אשר עשויה להשפיע על OCR. בעלי חיים אלה סטיריליים ינותחו למחרת (יום 1 למבוגרים בעלי חיים ב- h ~ 66) עבור וזמינותו. FUdR דווח לפגיעה פיזיולוגיה, תוחלת החיים של תולעים מוטציה מסויימת. לכן, זה צריך להילקח בחשבון כאשר התרופה משמשת עבור עיקור12,13,14. תולעים יכולים גם להיות מעוקר בכך ועשתה מוטציות כגון fem-1(hc17) או fem-3(e2006). עם זאת, מוטציות אלה העלולים להשפיע מיטוכונדריאלי פונקציה.</li>
</ol>2. הכנת תרכובות כדי להיות מוזרק, הידרציה של הגששים
הערה: במהלך וזמינותו לרוץ, שני שיעורי נשימה הבזליים ו מקסימלי נמטודות נמדדים. נשימה מקסימלי המופעלת את החיות על התוספת של קרבוניל ציאניד-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), ionophore uncoupling זה מפריע קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים ובכך סינתזת ATP על ידי הובלת פרוטונים דרך ממברנה מיטוכונדריאלי, תוך מתן אפשרות שאיבה פרוטונים, אלקטרונים תחבורה וצריכת החמצן להמשיך4,15 חשיפות של סינתזת ATP (איור 1). השלב האחרון וזמינותו מערבת התוספת של אזיד הנתרן (נאן3), מעכבת מתחמי IV ו- V בוכו ', המאפשרת לקבוע שאינו מיטוכונדריאלי נשימה16 (איור 1). ניתן לבצע את הפעולות הבאות יום לפני המרוץ assay בפועל.
<ol><li>להכין מלאי פתרונות של FCCP 1 מ"ל (10 מ מ דימתיל סולפוקסיד [דימתיל סולפוקסיד]: 1000 x ריכוז הסופית assay) נאן3 (400 מ dH2o: 10 x ריכוז הסופית assay) ואת החנות ב-20 ° C. הערה: הפעל עקומת ריכוז כדי למטב את ריכוז FCCP נדרש להפיק תגובה מקסימלי OCR עבור כל כלי וכל הגדרה מעבדה.</li>
	<li>מימה הדיו חיישן על-ידי הוספת µL 200 של dH2O מכל קידוח (ו המאגר המקיף) בצלוחית, להבטיח כי החיישן הגששים טובע dH2O, חנות ללילה בטמפרטורת החדר. הערה: מחסנית יכול להיות שמאל הגששים שקוע עבור עד 72 שעות, אך במקרה לחות מתמשכת, הלוחות צריכים להיות עטוף בסרט פרפין ומאוחסנים ב 4 º C. אם הידרציה לילה אינו אפשרי, כדאי hydrated הדיו חיישן במשך לפחות 4 שעות לפני וזמינותו.</li>
	<li>לבטל את גוף החימום בממשק respirometer ולאחסן את המכשיר בתוך חממה 15 ° C ונישלח נמוך וטמפרטורת בתוך המכשיר כדי למנוע התחממות יתר במהלך וזמינותו להפעיל את החיות. הערה: respirometer הינו מצויד עם אלמנט חימום אבל לא יכול להיות מקורר. בתוך חממה 15 ° C, respirometer יהיה על טמפרטורה יציבה בין 18 – 22 ° C, אשר הוא חום בריא לתחזוקה C. elegans .</li>
</ol>3. סמים equilibration וטעינה של מחסנית
<ol><li>פיפטה החוצה וזורקים את dH2O נהגה מימה החיישן רגשים ולהחליף אותו עם µL 200 של הפתרון calibrant (pH 7.4) כל היטב. לדלל את הפתרון FCCP מניות 100 מיקרומטר FCCP dH2O ולהוסיף 20 µL של הפתרון מדולל הזרקת ליציאה a במחסנית חיישן. הוספת µL 22 של אזיד הנתרן 400 מ ליציאה B של מיכל הדיו סניור.</li>
	<li>להפוך את respirometer על מסך הבית בחר התחל; תבניות העמוד יופיע. בדף ' תבניות ', בחר ריקים או תבנית מעוצבת בעבר; הדף קבוצות יופיעו. בדף ' קבוצות ', בחר הבארות A ו- H הבארות רקע והקצה הבארות 6 הנותרים לקבוצות המתאים, לפי התוכנית הניסיונית.</li>
	<li>ללחוץ על החץ בפינה הימנית התחתונה כדי לעבור אל הדף פרוטוקול. בדף פרוטוקול, להבטיח כי Equilibrate, התאים הבזליים , זריקות 1 ו- 2 הכפתורים שנבחרו. בדף זה, להתאים את מספר קריאות של OCR הבזליים, וכן OCR מקסימלי (לאחר ההזרקה 1 עם FCCP) ואת שאינו מיטוכונדריאלי OCR (לאחר ההזרקה 2 עם אזיד הנתרן). הערה: כל אחת מהמידות לפניו תערובת, רגע צעד ומסגרות הזמן עבור פרמטרים אלה מוצגות בטבלה מס ' 2.</li>
	<li>בחר על החץ בפינה הימנית התחתונה, תופיע הודעה שתדווח כדי לטעון את הצלחת מחסנית חיישן. ודא כי הצלחת מחסנית חיישן נטען בהכיוון נכון, ועקוב אחר ההוראות על המסך בקש תזכורת. Respirometer עכשיו equilibrate את מיכל הדיו. הערה: equilibration הזה מספק מספיק זמן כדי למקם את החיות כדי להיות לבדיקה לתוך ולס המתאימות של צלחת התא.</li>
</ol>4. הכנת צלחת התולעת ואת וזמינותו לרוץ
<ol><li>להוסיף 200 µL מאגר M9 לתוך כל הבארות 8 של צלחת התא ולתוך המאגרים הבארות שמסביב.</li>
	<li>לבחור ~ 100 תולעים מהמאמץ כל על גבי לוחות NGM unseeded ואפשר לנוח במשך 2-3 דקות רטוב לסוף של האיסוף פלטינה עם מאגר M9 ולקחת 20 בעלי חיים גיל-מסונכרנות לתוך בארות B-G, עוזב את הבארות רקע A ו- H ריק. הערה: לאחר טעינה אחד. ובכן, חכה כ 2 דקות כדי לאפשר את החיות להתמקם בתחתית הבארות. רצוי גם כך עקומת בתולעת מספר לפעול כדי למטב את המספר תולעת לכל טוב עבור כל כלי וכל הגדרה מעבדה.</li>
	<li>עד עכשיו, respirometer צריכה להיות מכויל, על ידי לחיצה טוב על המסך, הצלחת המכיל מאגר כיול הוצאת ו ניתן להסיר את respirometer, ואילו מחסנית חיישן נשאר בתוך המכשיר. החלף את הצלחת calibrant לצלחת המכילה בעלי חיים. לטעון את הצלחת לסגור את הדלת על ידי להכות את המשך ומאפשרים וזמינותו לפעול.</li>
</ol>5. ניסוי שלאחר הניתוח
<ol><li>לאחר סיום המרוץ assay, ועקוב אחר ההנחיות על המסך להסרת צלחת תא חיישן מחסנית ואת להכניס כונן הבזק ליציאת ה-USB כדי לשמור את הנתונים לרוץ בתבנית של מלחמה. הסר את מיכל הדיו חיישן ולאפשר החיות לתחתית הבארות מסתפק כ 2 דק למקם את הצלחות תא מערכת סטריאו לנתח מיקרוסקופ, לספור את מספר בעלי חיים לכל טוב.</li>
	<li>פתח את תוכנת ניתוח במחשב, פתיחת הכרטיסיה נורמליזציה לנרמל OCR למספר בעלי חיים. החל תוויות המתאימים עבור הקבוצות השונות תחת הכרטיסייה שינוי, לייצא את הקובץ כקובץ פריזמה לצורך ניתוח נוסף. הערה: הממוצע של המדידות חמישה, לפני התוספת של FCCP הוא OCR הבזליים, בעוד הממוצע של המדידות חמישה לאחר FCCP תוספת OCR מקסימלי לבין ממוצע המדידות האחרונות חמש (מינימום של שתי מדידות שצריך לעשות) לאחר תוספת אזיד הנתרן הוא קצב הנשימה הלא-מיטוכונדריאלי. הבדיקה יש לחזור שלוש פעמים כדי לוודא הפארמצבטית.</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger Principles of Biochemistry</a>. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).</li>
<li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li>
<li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca%282%2B%29+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940(2015).</li>
<li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li>
<li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li>
<li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li>
<li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li>
<li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li>
<li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li>
<li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12%2C+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer%27s+disease+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li>
<li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+Ca2%2B+in+the+regulation+of+cellular+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

נשימה מיטוכונדריאלי הוא מחוון תובנה של פונקציה מיטוכונדריאלי; לכן, היכולת למדוד את שיעור צריכת החמצן במערכת הביולוגית, בין אם במבחנה או ויוו הוא חשוב מאוד. Respirometers חש רמות החמצן באמצעות חומר זרחני מבוססי פורפירין זה לקבל מתרצה באמצעות חמצן או באמצעות חיישני חמצן amperometric המסתמכים על הדור של פרופורציונלי הנוכחי חשמלי חמצן בלחץ... קלארק אלקטרודה נופל לתוך הקטגוריה השנייה, שימש בהרחבה בספרות, במיוחד במהלך ניתוח נשימה C. elegans. עם זאת, הצורך גודל דגימה גדולה וחוסר היכולת להעריך מדגם אחד או יותר בכל פעם ע...

אדנוזין טריפוספט (ATP), המקור העיקרי של אנרגיה תאית, מיוצר בתוך המיטוכונדריה על ידי אנזימים בשרשרת האלקטרונים תחבורה (וכו ') הממוקם בתוך הקרומית מיטוכונדריאלי הפנימי. פירובט, מטבוליט מפתח מנוצל לייצור ATP מיטוכונדריאלי, מיובא לתוך מאטריקס מיטוכונדריאלי איפה decarboxylated לייצר אצטיל קואנזים A (CoA). לאחר מכן, אצטיל CoA מזין את מעגל קרבס וכתוצאה מכך הדור של nicotinamide אדנין dinucleotide (NADH), מולקולה נשא אלקטרונים מפתח. כמו אלקטרונים NADH מועברים למנהל חמצן דרך ועוד, פרוטונים לבנות בחלל intermembrane מיטוכונדריאלי, דבר המתבטא הדור הצבע אלקטרוכימי על פני הקרום. אלה פרוטונים יזרום אז מן המרחב intermembrane מעבר הדרגתי אלקטרוכימי הזה בחזרה לתוך המטריקס מיטוכונדריאלי דרך הנקבובית פרוטון של ATP סינתאז, נהיגה הסיבוב שלה, הסינתזה של ATP1 (איור 1).
הפונקציה מיטוכונדריאלי אינה מוגבלת ייצור אנרגיה, אבל הוא גם מכריע הומאוסטזיס סידן, מינים חמצן תגובתי (ROS) ניקוי של אפופטוזיס, אנושות מיצוב תפקידם בריאות organismal2. הפונקציה מיטוכונדריאלי יכול להיות מוערך באמצעות מגוון של מבחני, כולל אך לא מוגבל ניתוחים המודדים מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית רמות ATP ו- ROS, ריכוזי סידן מיטוכונדריאלי. עם זאת, אלה מבחני לספק תמונה אחת של פונקציה מיטוכונדריאלי, ולכן אולי לא מספקת תצוגה מקיפה של בריאות מיטוכונדריאלי. מאז צריכת חמצן בעת יצירת ATP הוא מסתמך על מספר עצום של תגובות רציפים, היא מגישה כסמן מעולה של פונקציה מיטוכונדריאלי. מעניין, וריאציות שיעורי צריכת חמצן נצפו כתוצאה בתפקוד מיטוכונדריאלי3,4,5.
שיעורי צריכת חמצן (OCR) של החיים דוגמאות ניתן למדוד באמצעות טכניקות ניתן לחלק לשתי קבוצות: amperometric חיישני חמצן, חומר זרחני מבוססי פורפירין זה יכול לכלותה חמצן6. חיישני חמצן Amperometric נעשה שימוש נרחב מודדים OCR ב בתרבית תאים, רקמות, וב -דגם מערכות, כגון C. elegans. עם זאת, חומר זרחני מבוססי פורפירין המכיל respirometers יש את היתרונות הבאים: (1) שהם מאפשרים השוואה לצד השני של שני מדגמים שהפקידים, (2) הם דורשים גודל מדגם קטן יותר (למשל, תולעים 20 לכל טוב לעומת ~ 2, 000−5, 000 תולעים קאמרית)7, ו- (3) ניתן לתכנת את respirometer לעשות ארבע זריקות מורכבים שונים-רצוי פעמים לאורך כל רץ ניסיוני, ומבטל את הצורך עבור יישום ידני.
פרוטוקול זה, הם שלבים המעורבים בשימוש של פורפירין מבוססות חיישן חמצן respirometer מודדים OCR ב- חיים, שלמים C. elegans מתואר. אמנם יש פרוטוקול בכתב לשימוש בפורמט גדול, תפוקה גבוהה respirometer8, פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש עם מכשיר ידידותי, נגיש וקטן בהיקף תקציב נוסף. פרוטוקול זה שימושי במיוחד להערכת ההבדל ב- OCR בין שני זנים, שבו לא נדרש ההקרנה תפוקה גבוהה, השימוש בו יהיה מוגזם.

<table><tbody><tr><td>100 מ"מ, 60 מ"מ צלחות פטרי</td><td>Kord-Valmark Labware מוצרים</td><td>2900, 2901</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>גלוב סיינטיפיק</td><td>6285</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 ופעמים; 22 מ"מ כיסוי</td><td>גלובוס סיינטיפיק</td><td>1404-10</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>בקטו פפטון</td><td>BD, בקטו</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>בקטו טריפטון</td><td>BD, בקטו</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרי בקטו</td><td>BD, בקטו</td><td>212705</td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה</td>, סידן <td>כלוריד דיהידרט גנרי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td><td>Abcam</td><td>ab120081</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C314-500</td><td></td></tr><tr><td>מים נטולי יונים (dH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>C987Y85</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר זכוכית</td><td>Krackeler Scientific</td><td>6-72050-900</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט הפטהידראט (MgSO4&middot; 7H2O)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי (K2HPO4)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים (Na2HPO4)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>סוסון ים XFp אנלייזר</td> סוסון <td>ים זריז</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XFp FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2002</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

הפונקציה מיטוכונדריאלי האופטימלי הוא קריטי עבור פעילות תאית בריאה, במיוחד בתאי בעלי אנרגיה גבוהה דרישות כמו אלה במערכת העצבים, שרירים. בקנה אחד עם זה, תפקוד מיטוכונדריאלי היה קשור עם מספר עצום של מחלות ניווניות והתיישנות באופן כללי. Caenorhabditis elegans כבר מערכת מודל רב עוצמה עבור שחקרתי המורכבות הרבה של הפונקציה מיטוכונדריאלי. נשימה מיטוכונדריאלי הוא סימן חזק של פונקציה מיטוכונדריאלי, respirometers פיתחה לאחרונה מציעים פלטפורמה המדינה-of-the-art כדי למדוד את הנשימה בתאים. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים שיטה לנתח חיים, שלמים C. elegans. פרוטוקול זה משתרע על פני תקופה של ~ 7 ימים, כולל שלבי (1) גדל וסינכרון של C. elegans, (2) הכנת תרכובות כדי להיות מוזרק, הידרציה של הגששים, equilibration וטעינה של מחסנית סמים (3), (4) הכנת assay תולעת צלחת assay לרוץ ו ניתוח נתונים לאחר הניסוי (5).

באמצעות הפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך, OCR של חיות פראי סוג ו מוטנטים שונים sel-12 שלושה זנים היו נחושים. sel-12 מקודד את ortholog C. elegans presenilin17. מוטציות בגן presenilin האנושי הם המפגע גנטי הנפוצים ביותר הקשורים להתפתחות מחלת אלצהיימר משפחתית18. המחקרים שלנו הראו רמות סידן גבוהות מיטוכונדריאלי sel - 12 חיות לעומת חיות פראי סוג3. מאז dysregulation סידן יכול לגרום פונקציה מיטוכ...

נשימה מיטוכונדריאלי חיוני להישרדות organismal; לכן, קצב צריכת החמצן היא מדד מצוין של בריאות מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש respirometer זמינים מסחרית כדי למדוד הבזליים, שיעורי צריכת חמצן מירבית חיים, שלמים, ולא תאי בחופשיות Caenorhabditis elegans.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

תפקוד המיטוכונדריאלי הוא קריטי הונוסטזיס הסלולר קצב צריכת החמצן הוא אינדיקטור מכריע של בריאות המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות לניתוח קצב צריכת החמצן ב- C.elegans. פרוטוקול זה עושה שימוש חי, C.elegans נייד מתן מדידה משפטית של פונקציה המיטוכונדרית.לרומם את הצורך לבודד מיטוכונדריה, צעד שעלול להשפיע על שלמותה. כדי להתחיל, להעביר זחלים L4 של רקעים גנטיים הרצויים על מדשאה זרע טרי של Escherichia coli על מדיה צמיחה nematode או צלחות NGM. השתמש לפחות שתי צלחות 100 מ"מ או שלוש 60 מ"מ עבור כל זן.הדגירה את התולעים בטמפרטורת הצמיחה המתאימה במשך שלושה עד ארבעה ימים, או עד צלחות מרוכזים עם מספר רב של ביצים ותולעים gravid. לשטוף את הביצים והתולעים את הצלחות באמצעות כ 6 מיליליטר של חיץ M9 לכל צלחת 100 מילימטר של nematodes. באמצעות פיפטות מרעה זכוכית, להעביר את הביצים והתולעים לתוך צינורות צנטריפוגה בודדים 15 מיליליטר עבור כל זן.לסובב צינורות תזות למטה במשך שלוש דקות ב 6, 180 גרם. לאחר צנטריפוגה, שאף את חיץ M9 שמירה רק את החיה ואת גלולת הביצה. מוסיפים שלושה עד ארבעה מיליליטר של תותב אקונומיקה לכל צינור ומערבולת לסירוגין במשך שש דקות.לאחר מכן, להוסיף מאגר M9 כדי למלא כל צינור ולסובב ב 6, 180 גרם לדקה אחת. שאפו את העל-טבעי וחזרו על שטיפה זו עם ה-M9, שלוש פעמים. לאחר הכביסה, להעביר את גלולת הביצה לצינור טרי 15 מיליליטר המכיל כתשעה מיליליטר של חיץ M9.סנכרנו את התולעים הטריות על ידי אגוזים ב-20 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 48 שעות. לאחר סיבוב צינורות אלה למטה ב 6, 180 גרם במשך 1.5 דקות, לשים את בעלי החיים מסונכרנים L-1 למטה על מדשאה זרע טרי של OP50 על לוחות NGM בודדים. שמור את הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס עד החיות להגיע לשלב הזחל L-4 לאחר כ 42 שעות.בשלב זה, השתמש בבחירה פלטינה כדי להעביר את הזחלים L4 ל- OP50 צלחות NGM זרעים המכילים 0.5 מיליגרם למיליליטר של FUdR כדי למנוע את ייצור צאצאים. לחות מחסנית החיישן על ידי הוספת 200 microliters של מים מזוקקים לכל באר על הצלחת, להבטיח כי בדיקות החיישן שקועים. אחסן את הצלחות לילה בטמפרטורת החדר.כבה את גוף החימום בממשק מד הנשימה. אחסון המכונה בתוך חממה של 15 מעלות צלזיוס מוריד את טמפרטורת הליבה בתוך המכונה ומונע מבעלי החיים התחממות יתר במהלך ההקפאה. לאחר הדגירה הלילית, פיפטה החוצה להשליך את המים מזוקקים המשמשים לחות בדיקות החיישן, ולהחליף אותו עם 200 microliters של הפתרון כיול בכל באר.לדלל את פתרון המניות FCCP ל 100 FCCP מיקרומולר במים מזוקקים. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטרים של הפתרון המדולל ליציאת הזרקה A במחסנית החיישן. הוסף 22 מיקרוליטר של 400 מילימולאר נתרן אזידים ליציאת הזרקה B של מחסנית החיישן.עכשיו, תדליק את מד הנשימה. במסך הבית, בחר התחל ודפי התבנית יופיעו. בדף התבניות, בחר ריק" או תבנית שעוצבה בעבר.דף הקבוצות יופיע. בדף הקבוצות, בחר בארות A ו- H כ בארות הרקע, והקצה את שש הבארות הנותרות לקבוצות מתאימות בהתאם לתוכנית הניסוי. גש לדף הפרוטוקול על-ידי לחיצה על החץ בפינה השמאלית התחתונה, וודא שהלחצן 'שיווי משקל', 'בזל' ו'זריקות 1 ו-2' נבחר.התאימו את מספר הקריאות של זיהוי תווים אופטי (OCR) הבסיסי, כמו גם את מספר זיהוי התווים האופטי (OCR) המרבי ואת זיהוי התווים האופטי (OCR) שאינו מיטוכונדריאלי. בחר את החץ בפינה השמאלית התחתונה. תופיע בקשה לטעינת לוחית מחסנית החיישן.ודא כי לוחית מחסנית החיישן נטענת בכיוון הנכון, בהתאם להוראות במסך שורת התזכורת. ההפוגה עכשיו לצייד את המחסנית. הוסף 200 microliters של מאגר M9 לתוך כל אחת משמונה בארות המאגרים שמסביב של לוח התא.בחרו כ-100 תולעים מכל זן על לוחות NGM לא חתוך, ואפשרו לנוח במשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר מכן, הרטיבו את קצה פיק הפלטינה עם חיץ M9 ובחרו בעלי חיים מסונכרנים בני 20 שנה לתוך בארות B עד G, והשאירו את בארות הרקע A ו- H ריקות. עכשיו, לחץ על אישור על תוכנת מד ההנשמה כדי להוציא את הלוח המכיל מאגר כיול.הסר את הלוחית מלחץ הנשימה והשאיר את מחסנית החיישן בתוך המכשיר. החלף את הצלחת הכיול עם הצלחת המכילה את בעלי החיים. לטעון צלחות ולסגור את הדלת על ידי להכות להמשיך ולאפשר את ההטעיה לרוץ.לאחר השלמת ההקרנה, בצע את ההנחיות על המסך כדי להסיר את לוחית התא ומחסנית החיישן. הכנס כונן הבזק ליציאת ה- USB כדי לשמור את תבנית הפעלת המלחמה בנתונים. מוציאים את מחסנית החיישנים ומאפשרים לבעלי החיים להתיישב בתחתית הבאר למשך כשתי דקות.מניחים את לוחות התאים תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו ולספור את מספר בעלי החיים ל הבאר. פתח את תוכנת הניתוח, ואחריה את לשונית הנורמליזציה, כדי לנרמל את שיעורי צריכת החמצן למספר בעלי חיים. החל את הרמות המתאימות עבור הקבוצות השונות תחת הכרטיסיה שינוי, וייצא את הקובץ כקובץ פריזמה לניתוח נוסף.הממוצע של חמש המדידות הראשונות הוא זיהוי תווים אופטי (OCR) הבסיסי. הממוצע של חמש המדידות לאחר הוספת FCCP הוא זיהוי תווים אופטי (OCR) המקסימלי. לבסוף, הממוצע של חמש המדידות האחרונות לאחר תוספת נתרן אזיד הוא שיעור הנשימה הלא מיטוכונדריאלי.מאז dysregulation סידן יכול לגרום לתפקוד המיטוכונדריאלי השתנה, OCR הן במוטנטים sel-12 ובעלי חיים מסוג בר נמדדו כדי לבחון את ההשפעה של מוטציות sel-12 על תפקוד המיטוכונדריאלי ובריאות. בעלי חיים מסוג בר הראו באופן עקבי שיעורי זיהוי תווים אופטי (OCR) הבסיסיים מתחת לחמישה פיקומולים לדקה, לכל תולעת. בעוד כל שלושת הזנים של מוטציות סל-12 הראו OCR מוגבה באופן משמעותי, של כ 7 picomoles לדקה, לכל תולעת.עם התוספת של FCCP, חלה עלייה OCR של סוג פראי, כמו גם מוטציות סל-12, כצפוי. חיות בר הראו זיהוי תווים אופטי (OCR) מרבי של כ-7 פיקמולים לדקה, לכל תולעת. בעוד שלמוטנטים מס' 12 היה זיהוי תווים אופטי (OCR) של כ-10 פיקומולים לדקה, לכל תולעת.השתמשו בבעלי חיים חיים, ניזונים היטב ואסינכרוניים בהקשה זו, והימנעו מהעברת ביצים או פקות לתוך בארות אסי. יתר על כן, הטמפרטורה הפנימית של המכשיר לא יעלה על 25 מעלות צלזיוס. אקונומיקה, FCCP, FUdR ונתרן אזיד הם רעילים.לכן, יש לדאוג ללבוש כפפות מגן במהלך הכנת פתרונות מלאי וטעינת סמים.

measurement-oxygen-consumption-rates-intact-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

נייר עמדה זה מפרט כיצד להשתמש רציפה הזרימה לתאי חוסר חמצן כדי ליצור אווירה עם ריכוזים מוגדרים של...

יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על<em&gt; ג elegans</em

בסרטון זה אנו מראים שיטה ליצירת אוכלוסייה מסונכרנת התפתחותית של C. elegans בוגרים סטריליים. הפרוטוקול לדוגמה מסנכרן תולעים כדי לחקור את שיעורי צריכת החמצן בבעלי חיים חיים.

סנכרון נמטודות: שיטה להשגת אוכלוסיות של תולעים בשלבי התפתחות זהים

C. elegans הוא מודל שימושי לחקר ההשפעות של אתנול על ההתנהגות. אנו מציגים בדיקת התנהגותית שמכמתת את ההשפעות של אתנול על מהירות התנועה של תולעים זוחלות; ניתן למדוד עם הבדיקה הזו גם את הרגישות הראשונית וגם את התפתחות הסובלנות התפקודית החריפה לאתנול.

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

C. elegans הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי לחקר מסלולי העברת אותות המעורבים בעמידות לעקה חמצונית. כאן אנו מספקים פרוטוקול למדידת עמידות לעקה חמצונית של בעלי חיים C. elegans בשלב נוזלי, באמצעות מספר חומרים מחמצנים ב-96 לוחות בארות.

מדידת התנגדות סטרס חמצוני של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; בצלחות microtiter 96-היטב

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

מדידת שינויים בשערי מטבולית הוא מרכזי להבנת ההתקדמות של הזדקנות ומחלות שונות. כאן, אנו מציגים טכניקה חדשנית כדי למדוד את צריכת החמצן כל הראש באופן הדוק יותר דומה המדינה פיזיולוגיים, עשויים לסייע בגילוי תרופות חדישות לשנות פעילות מיטוכונדריאלי.

מדידת ופרשנות חמצן קצב הצריכה כולה לטוס הראש מקטעים

מחקר זה מציג פרוטוקולים עבור שתי גישות ניתוח פעילות לוקומוטור חצי אוטומטי ב C. elegans קומפלקס I מחלות גז-1(fc21) תולעים, כלומר, ZebraLab (בדיקת תפוקה בינונית) ו- WormScan (בדיקה בעלת תפוקה גבוהה) ומספקים ניתוח השוואתי בין מגוון רחב של שיטות מחקר לכימות התנהגות נמטודה ותפקוד עצבי שרירי משולב.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

Caenorhabditis elegans משמשים כמערכת מודל מצוינת עם שיטות חזקות ובעלות נמוכה לסקר את תוחלת החיים, תוחלת החיים והחוסן ללחץ.

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

ספירומטריה קולומטרית אידיאלית למדידת קצב חילוף החומרים של אורגניזמים קטנים. כאשר הותאם עבור Drosophila melanogaster במחקר הנוכחי, צריכת O2 שנמדדה הייתה בטווח שדווח עבור סוג בר D. melanogaster על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 לכל זבוב על ידי מוטנטים של ASK שהם קטנים יותר ופעילים פחות, הייתה נמוכה משמעותית מזו של ה-wildtype .

מדידת צריכת O2 בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית

פרוטוקול זה מתאר בדיקה לכימות קצב ההזנה של Caenorhabditis elegans בהתבסס על מדידת פינוי החיידקים בתרבית נוזלית.

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

למדו למדוד קצב צריכת חמצן ב־Caenorhabditis elegans חי ללא בידוד מיטוכונדריה. פרוטוקול זה מאפשר הערכת תפקוד מיטוכונדרי מדויקת במחקר גנטי ובריאות תאית.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

גלה סרטונים נוספים