מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

נשימה מיטוכונדריאלי חיוני להישרדות organismal; לכן, קצב צריכת החמצן היא מדד מצוין של בריאות מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש respirometer זמינים מסחרית כדי למדוד הבזליים, שיעורי צריכת חמצן מירבית חיים, שלמים, ולא תאי בחופשיות Caenorhabditis elegans.

תפקוד המיטוכונדריאלי הוא קריטי הונוסטזיס הסלולר קצב צריכת החמצן הוא אינדיקטור מכריע של בריאות המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות לניתוח קצב צריכת החמצן ב- C.elegans. פרוטוקול זה עושה שימוש חי, C.elegans נייד מתן מדידה משפטית של פונקציה המיטוכונדרית.

לרומם את הצורך לבודד מיטוכונדריה, צעד שעלול להשפיע על שלמותה. כדי להתחיל, להעביר זחלים L4 של רקעים גנטיים הרצויים על מדשאה זרע טרי של Escherichia coli על מדיה צמיחה nematode או צלחות NGM. השתמש לפחות שתי צלחות 100 מ"מ או שלוש 60 מ"מ עבור כל זן.

הדגירה את התולעים בטמפרטורת הצמיחה המתאימה במשך שלושה עד ארבעה ימים, או עד צלחות מרוכזים עם מספר רב של ביצים ותולעים gravid. לשטוף את הביצים והתולעים את הצלחות באמצעות כ 6 מיליליטר של חיץ M9 לכל צלחת 100 מילימטר של nematodes. באמצעות פיפטות מרעה זכוכית, להעביר את הביצים והתולעים לתוך צינורות צנטריפוגה בודדים 15 מיליליטר עבור כל זן.

לסובב צינורות תזות למטה במשך שלוש דקות ב 6, 180 גרם. לאחר צנטריפוגה, שאף את חיץ M9 שמירה רק את החיה ואת גלולת הביצה. מוסיפים שלושה עד ארבעה מיליליטר של תותב אקונומיקה לכל צינור ומערבולת לסירוגין במשך שש דקות.

לאחר מכן, להוסיף מאגר M9 כדי למלא כל צינור ולסובב ב 6, 180 גרם לדקה אחת. שאפו את העל-טבעי וחזרו על שטיפה זו עם ה-M9, שלוש פעמים. לאחר הכביסה, להעביר את גלולת הביצה לצינור טרי 15 מיליליטר המכיל כתשעה מיליליטר של חיץ M9.

סנכרנו את התולעים הטריות על ידי אגוזים ב-20 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 48 שעות. לאחר סיבוב צינורות אלה למטה ב 6, 180 גרם במשך 1.5 דקות, לשים את בעלי החיים מסונכרנים L-1 למטה על מדשאה זרע טרי של OP50 על לוחות NGM בודדים. שמור את הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס עד החיות להגיע לשלב הזחל L-4 לאחר כ 42 שעות.

בשלב זה, השתמש בבחירה פלטינה כדי להעביר את הזחלים L4 ל- OP50 צלחות NGM זרעים המכילים 0.5 מיליגרם למיליליטר של FUdR כדי למנוע את ייצור צאצאים. לחות מחסנית החיישן על ידי הוספת 200 microliters של מים מזוקקים לכל באר על הצלחת, להבטיח כי בדיקות החיישן שקועים. אחסן את הצלחות לילה בטמפרטורת החדר.

כבה את גוף החימום בממשק מד הנשימה. אחסון המכונה בתוך חממה של 15 מעלות צלזיוס מוריד את טמפרטורת הליבה בתוך המכונה ומונע מבעלי החיים התחממות יתר במהלך ההקפאה. לאחר הדגירה הלילית, פיפטה החוצה להשליך את המים מזוקקים המשמשים לחות בדיקות החיישן, ולהחליף אותו עם 200 microliters של הפתרון כיול בכל באר.

לדלל את פתרון המניות FCCP ל 100 FCCP מיקרומולר במים מזוקקים. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטרים של הפתרון המדולל ליציאת הזרקה A במחסנית החיישן. הוסף 22 מיקרוליטר של 400 מילימולאר נתרן אזידים ליציאת הזרקה B של מחסנית החיישן.

עכשיו, תדליק את מד הנשימה. במסך הבית, בחר התחל ודפי התבנית יופיעו. בדף התבניות, בחר ריק" או תבנית שעוצבה בעבר.

דף הקבוצות יופיע. בדף הקבוצות, בחר בארות A ו- H כ בארות הרקע, והקצה את שש הבארות הנותרות לקבוצות מתאימות בהתאם לתוכנית הניסוי. גש לדף הפרוטוקול על-ידי לחיצה על החץ בפינה השמאלית התחתונה, וודא שהלחצן 'שיווי משקל', 'בזל' ו'זריקות 1 ו-2' נבחר.

התאימו את מספר הקריאות של זיהוי תווים אופטי (OCR) הבסיסי, כמו גם את מספר זיהוי התווים האופטי (OCR) המרבי ואת זיהוי התווים האופטי (OCR) שאינו מיטוכונדריאלי. בחר את החץ בפינה השמאלית התחתונה. תופיע בקשה לטעינת לוחית מחסנית החיישן.

ודא כי לוחית מחסנית החיישן נטענת בכיוון הנכון, בהתאם להוראות במסך שורת התזכורת. ההפוגה עכשיו לצייד את המחסנית. הוסף 200 microliters של מאגר M9 לתוך כל אחת משמונה בארות המאגרים שמסביב של לוח התא.

בחרו כ-100 תולעים מכל זן על לוחות NGM לא חתוך, ואפשרו לנוח במשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר מכן, הרטיבו את קצה פיק הפלטינה עם חיץ M9 ובחרו בעלי חיים מסונכרנים בני 20 שנה לתוך בארות B עד G, והשאירו את בארות הרקע A ו- H ריקות. עכשיו, לחץ על אישור על תוכנת מד ההנשמה כדי להוציא את הלוח המכיל מאגר כיול.

הסר את הלוחית מלחץ הנשימה והשאיר את מחסנית החיישן בתוך המכשיר. החלף את הצלחת הכיול עם הצלחת המכילה את בעלי החיים. לטעון צלחות ולסגור את הדלת על ידי להכות להמשיך ולאפשר את ההטעיה לרוץ.

לאחר השלמת ההקרנה, בצע את ההנחיות על המסך כדי להסיר את לוחית התא ומחסנית החיישן. הכנס כונן הבזק ליציאת ה- USB כדי לשמור את תבנית הפעלת המלחמה בנתונים. מוציאים את מחסנית החיישנים ומאפשרים לבעלי החיים להתיישב בתחתית הבאר למשך כשתי דקות.

מניחים את לוחות התאים תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו ולספור את מספר בעלי החיים ל הבאר. פתח את תוכנת הניתוח, ואחריה את לשונית הנורמליזציה, כדי לנרמל את שיעורי צריכת החמצן למספר בעלי חיים. החל את הרמות המתאימות עבור הקבוצות השונות תחת הכרטיסיה שינוי, וייצא את הקובץ כקובץ פריזמה לניתוח נוסף.

הממוצע של חמש המדידות הראשונות הוא זיהוי תווים אופטי (OCR) הבסיסי. הממוצע של חמש המדידות לאחר הוספת FCCP הוא זיהוי תווים אופטי (OCR) המקסימלי. לבסוף, הממוצע של חמש המדידות האחרונות לאחר תוספת נתרן אזיד הוא שיעור הנשימה הלא מיטוכונדריאלי.

מאז dysregulation סידן יכול לגרום לתפקוד המיטוכונדריאלי השתנה, OCR הן במוטנטים sel-12 ובעלי חיים מסוג בר נמדדו כדי לבחון את ההשפעה של מוטציות sel-12 על תפקוד המיטוכונדריאלי ובריאות. בעלי חיים מסוג בר הראו באופן עקבי שיעורי זיהוי תווים אופטי (OCR) הבסיסיים מתחת לחמישה פיקומולים לדקה, לכל תולעת. בעוד כל שלושת הזנים של מוטציות סל-12 הראו OCR מוגבה באופן משמעותי, של כ 7 picomoles לדקה, לכל תולעת.

עם התוספת של FCCP, חלה עלייה OCR של סוג פראי, כמו גם מוטציות סל-12, כצפוי. חיות בר הראו זיהוי תווים אופטי (OCR) מרבי של כ-7 פיקמולים לדקה, לכל תולעת. בעוד שלמוטנטים מס' 12 היה זיהוי תווים אופטי (OCR) של כ-10 פיקומולים לדקה, לכל תולעת.

השתמשו בבעלי חיים חיים, ניזונים היטב ואסינכרוניים בהקשה זו, והימנעו מהעברת ביצים או פקות לתוך בארות אסי. יתר על כן, הטמפרטורה הפנימית של המכשיר לא יעלה על 25 מעלות צלזיוס. אקונומיקה, FCCP, FUdR ונתרן אזיד הם רעילים.

לכן, יש לדאוג ללבוש כפפות מגן במהלך הכנת פתרונות מלאי וטעינת סמים.