Name: השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: למדו שיטה חדשנית לבידוד טיפות שומן מכבד עכברים באמצעות ערכת בידוד מסחרית לרשתיתיתית. הפרוטוקול מאפשר בידוד סימולטני של אברונים מרובים ומקדם מחקר בביולוגיית טיפות שומן ובמחלות כבד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים במכון לחקר סרטן משפחת אברמסון. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים הבאים: R01 NIH/NIAAA AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, רוברט ווד ג'ונסון קרן, הרולד עמוס רפואי פיתוח פרס הפקולטה, 7158, IDOM הרפובליקה הדמוקרטית של קונגו טייס פרס P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (ג'יי). עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי NIH P30-DK050306 ולהעניק במתקניה הליבה (פתולוגיה מולקולרית, הדמיה הליבה בביולוגיה מולקולרית/ג'ין הביטוי ליבה, תא תרבות הליבה) וטייס התוכנית. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

כל הניסויים נערכו על ספסל מעבדה עם ציוד מגן אישי המתאים עבור אבטחה רמה 1, כולל חלוק מעבדה, כפפות בטיחות משקפי מגן. הניסויים בוצעו לפי הפרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת פנסילבניה. נעשה כל מאמץ כדי למזער את אי נוחות בעלי חיים, בעלי החיים היו בכבוד אנושי.
1. LD בידוד באמצעות ערכת בידוד בחדר המיון
<ol><li>
הכנה הערה: הכמויות המפורטות מתאימים יחיד 1 g העכבר כבד.<ol>
<li>הכן 10 מ ל x 1 חילוץ מול מאגר (IE מאגר, הערכה בידוד ER) על ידי דילול 2 מ של מאגר IE x 5 עם 8 מ ל מים הנדסה גנטית. מגניב המאגר על-ידי הצבתו על קרח.</li>
		<li>הכן 100 מ של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על ידי דילול 10 מ"ל של 10 x PBS ב 90 מיליליטר מים הנדסה גנטית. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.</li>
		<li>הכן 10 מ"ל של האתר-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl p. 5% פוליאתילן גליקול (PGPE) על ידי µL 500 המדללת של PGPE ב 9.5 מ ל מים הנדסה גנטית. השתמש מזרק 1 מ"ל למדוד את PGPE כפי שהוא צמיגה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.</li>
		<li>מגניב לכל הצינורות על ידי הצבת אותם על קרח: 1.7 mL microcentrifuge צינורות, צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, 50 מ ל צנטריפוגה במהירות גבוהה צינורות, צינורות ultracentrifuge מ"ל 13.</li>
		<li>מגניב כל הנדרש צנטריפוגות 4 ° c: microcentrifuge, צנטריפוגה בקיבולת גבוהה עבור 15 מ"ל צינורות, צנטריפוגה במהירות גבוהה עבור צינורות 50 מ ל, ultracentrifuge.</li>
		<li>לחטא מלקחיים, חיתוך מספריים על-ידי autoclaving.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת הרקמה
	<ol>
<li>המתת חסד את העכבר על-ידי הצבתו בחדר מלא 100% CO2 עבור 10 דקות אישור המתת חסד על-ידי ביצוע נקע בצוואר הרחם.</li>
		<li>שימוש סטרילי מלקחיים ומספריים חיתוך, לחתוך את שכבות העור והשריר של הבטן על הציר הקדמי/אחוריים כדי לחשוף את הכבד.</li>
		<li>חותכים את הרצועות מתחבר הכבד הסרעפת ואת המעי. להשתמש מלקחיים למשוך המעי מן הכבד, לכיוון האחורי, כדי לחשוף את הרצועות.</li>
		<li>לחתוך בין הכבד קשת הצלעות הגבי, נע והשתרשה עמוק בלבה את ישבנה עד הכבד משוחרר.</li>
		<li>להעביר את הכבד קר 5 ס צלחת פטרי עם 10 מ"ל של PBS קר 1 x.</li>
		<li>לשטוף את הכבד 2 x על פלטפורמה נדנדה ב- 10 מ"ל של PBS קר 1 x עבור 5 דקות ב 4 ° C ב- 5 ס מ פטרי. יוצקים את 1 x PBS לאחר כביסה הסופי.</li>
		<li>להשתמש בלהב כירורגי סטרילי גודל 10 (ראה הטבלה של חומרים) כדי קוביות הכבד לחתיכות 3-5 מ מ ב- 5 ס מ פטרי (איור 1 א').</li>
		<li>לשטוף את הכבד קצוץ 2 x עם 10 מ"ל של PBS קר 1 x עבור 5 דקות ב 4 ° C ב- 5 ס מ פטרי. הערה: בידוד ליזוזום, להעביר 0.5 גר' כבד מהמגן 45 מ ל נקי, בצע את ההוראות שסופקו על ידי החילוץ ליזוזום קיט (ראה את הטבלה של חומרים).</li>
		<li>Decant 1 x PBS ולהעביר את חתיכות כבד קצוץ קר 45 מ ל דאונס מהמגן. ודא שכל החלקים נלך לתחתית מהמגן.</li>
		<li>הוסף mL 7 קר 1 x מאגר IE (מתוך ערכת בידוד ER), homogenize על הקרח על ידי הזזת את שהעקב לאורך 20 x. ודא כי איחדו מגיע לתחתית מהמגן במהלך כל קו.</li>
		<li>להעביר את homogenate (איור 1B) שפופרת צנטרפוגה קר 15 מ"ל.</li>
		<li>לשטוף את מהמגן עם 1 מ"ל של קר 1 x מאגר IE (מתוך ערכת בידוד ER), להוסיף את זה לשאר homogenate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בידוד LD
	<ol>
<li>להסיר גרעינים על ידי צריך שתוציאו את homogenate ומפרידה בקיבולת גבוהה ב x 1000 g 10 דקות ב 4 ° C (איור 1C).</li>
		<li>להעביר את תגובת שיקוע postnuclear (מערכת העצבים ההיקפית) שפופרת צנטרפוגה חדש, קר 50 מ. כדי למנוע אובדן LD, ודא כי כל השומנים התאספו בחלק העליון של הצינור 15 מ"ל הוא resuspended לפני העברת את מערכת העצבים ההיקפית.</li>
		<li>לקחת את µL 100 aliquot של מערכת העצבים ההיקפית לניתוח טוהר ולמקם אותו בצינור microcentrifuge mL 1.7 קר. תתעלם מזה. על הקרח.</li>
		<li>כדי להסיר את המיטוכונדריה, centrifuge המדגם מערכת העצבים ההיקפית, לא aliquot, קירור ומפרידה במהירות גבוהה ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.<ol>
<li>אופציונלי: LD גולמי (המשטרתי) מבודד (עם ציטוזול וזיהום קרום התא), לאסוף את השכבה העליונה השומנים בעזרת פיפטה מזכוכית ולהעביר אותו צינור microcentrifuge 1.7 מ. המשך סעיף 1.4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להעביר את תגובת שיקוע postmitochondrial (PMS) צינור ultracentrifuge. כדי למנוע אובדן LD, ודא כי כל השומנים התאספו בחלק העליון הוא resuspended לפני העברת את תסמונת קדם וסתית.</li>
		<li>לקחת את µL 100 aliquot המחזור לניתוח טוהר ולמקם אותו בצינור microcentrifuge mL 1.7 קר. תתעלם מזה. על הקרח.</li>
		<li>למלא עם צינור ultracentrifuge עד הקצה, לזכותו קר 1 x מאגר IE כדי למנוע את הצינור קורסת במהלך ultracentrifugation.</li>
		<li>לאזן את הדגימות, centrifuge אותם ב ultracentrifuge ב 100,000 x g עבור 60 דקות ב 4 ° C (איור 1D).</li>
		<li>כדי להסיר את שכבת LD, להטות את הצינור בזווית של 45 מעלות ולהשתמש פיפטה מזכוכית של האחות. העברה בגדר צינור microcentrifuge mL 1.7 קר. הערה: בגדר מכיל ER מבודד. השתמש את השבר הזה במורד הזרם לבידוד ER.</li>
		<li>לאסוף 100 µL של פוסט-ER תגובת שיקוע (פי) מתחת לשכבת ליפיד לניתוח טוהר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD כביסה
	<ol>
<li>להוסיף 1 x PBS השבר LD שליקט צינור microcentrifuge 1.7, את הנפח הכולל של 1.3 מ.</li>
		<li>מערבולת המדגם.</li>
		<li>צנטריפוגה ב microcentrifuge בשיא המהירות עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה כל שאריות תאים. חממו את הצינור בעדינות בידיים כדי לעזור resuspend את השכבה LD. להעביר את תגובת שיקוע, כולל שהשכבה השומנים, צינור microcentrifuge 1.7 מ.</li>
		<li>חזור על צעדים 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, עד בגדר אינה גלויה.</li>
		<li>להוסיף 1 x PBS LD ללא גלולה supernatant לאמצעי הסופי של 1.5 מ. לשטוף את השבר השומנים על ידי צנטריפוגה ב microcentrifuge בשיא המהירות עבור 5 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>הסר 1 מ"ל של PBS x 1 (מתחת לשכבת השומנים) עם פיפטה מזכוכית מבלי להפריע השכבה השומנים.</li>
		<li>חזור על שלבים 1.4.5 ו 1.4.6 4 x x-5, עד מגניב 1 x באופן חזותי שקוף עם אין עכירות.</li>
		<li>להסיר את כל PBS 1 x מתחת לשכבת השומנים, באמצעות פיפטה של זכוכית (איור 1E).</li>
		<li>השתמש את התוצאה, שבריר LD טהור, לניתוח במורד הזרם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LD כימות חלבונים על ידי assay חומצה bicinchoninic הערה: אין להשתמש assay חומצה bicinchoninic (BCA) אם מורפולוגיה LD הוא לפנות לבדיקה.<ol>
<li>Resuspend את תעודת הזהות של 500 μL של 5% PGPE.</li>
		<li>מרתיחים את הדגימות למשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, מערבולת, דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות להתקרר.</li>
		<li>חזור על שלב 1.5.2 x 2 נוספים.</li>
		<li>Sonicate הדגימות במשך חמש דקות עם בן 30 + s/ביטול מחזור, בעוצמה בינונית.</li>
		<li>לנרמל את הדוגמאות על ידי מדידת ריכוז חלבון כל טוהר ניתוח דוגמאות, השבר LD מאת BCA וזמינותו.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. LD בידוד באמצעות סוכרוז דחיסות צבע
<ol><li>
הכנה
	<ol>
<li>להפוך 200 מ ל TE מאגר (10 מ מ טריס-HCl [pH 7.4], 1 מ"מ EDTA [pH 8.0]). מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.</li>
		<li>להפוך 100 מ של 60% (w/v) סוכרוז פתרון במאגר טה על ידי המסת 60 גר' סוכרוז במאגר טה, להביא את עוצמת הקול הסופי 100 מ. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.</li>
		<li>להפוך 6 מ של 40% (w/v) סוכרוז פתרון על-ידי הוספת מ 4 ל 60% סוכרוז 2 מ של מאגר טה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.</li>
		<li>להפוך 6 מ של 25% (w/v) סוכרוז פתרון על-ידי הוספת 2.5 מ של 60% סוכרוז 3.5 מ של מאגר טה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.</li>
		<li>להפוך 4 מיליליטר 10% (w/v) סוכרוז הפתרון על-ידי הוספת מ 0.7 ל 60% סוכרוז mL 3.3 מאגר טה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.</li>
		<li>להפוך 10 מ"ל של פתרון מעכב פרוטאז פוספטאז על-ידי הוספת טבליה אחת של מעכבי פרוטאז והן פוספטאז 10 מ"ל טה המאגר.</li>
		<li>להכין מאגר homogenate רקמות על-ידי הוספת 4 מיליליטר פתרון מעכב פרוטאז פוספטאז 50 מ של 60% סוכרוז פתרון מניות. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.</li>
		<li>להכין מאגר כיסוי על-ידי הוספת 2 מ של פתרון מעכב פרוטאז פוספטאז 50 מ של מאגר טה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.</li>
		<li>הכן 100 מ של 1 x PBS על ידי דילול 10 מ"ל של 10 x PBS ב 90 מיליליטר מים הנדסה גנטית. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.</li>
		<li>הכינו 10 מ"ל של 5% PGPE על ידי µL 500 המדללת של PGPE ב 9.5 מ ל מים הנדסה גנטית. השתמש מזרק 1 מ"ל למדוד את PGPE כפי שהוא צמיגה. מגניב זה על-ידי הצבתו על קרח.</li>
		<li>מגניב הצינורות צנטריפוגה הבאות על-ידי הצבתם על הקרח: 1.7 mL microcentrifuge צינורות, צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל, 50 מ ל צנטריפוגה במהירות גבוהה צינורות, צינורות ultracentrifuge מ"ל 13.</li>
		<li>מגניב של צנטריפוגות נדרשים 4 ° c: microcentrifuge, צנטריפוגה בקיבולת גבוהה (עבור צינורות 15 מ"ל), צנטריפוגה במהירות גבוהה (עבור צינורות 50 מ ל), של ultracentrifuge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת הרקמה
	<ol>
<li>השתמש 1.2.1–1.2.9 צעדים כדי להתכונן הרקמה המגון.</li>
		<li>להוסיף 7 מ של מאגר homogenate רקמות קר, homogenize זה על קרח. על-ידי הזזת את שהעקב לאורך 20 x. במהלך הסטרוקס חמישה, ודא שאיחדו מגיע לתחתית מהמגן.</li>
		<li>להעביר את homogenate שפופרת צנטרפוגה קר 15 מ"ל.</li>
		<li>לשטוף את מהמגן עם 1 מ"ל של רקמות קר homogenate מאגר, להעביר אותו הצינור צנטריפוגה השתמשו בעבר 15 מ"ל.</li>
		<li>להביא את עוצמת הקול של homogenate עד 10 מ"ל עם רקמת homogenate מאגר.</li>
		<li>Centrifuge המדגם ומפרידה בקיבולת גבוהה ב x 1000 g 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>העברה 8 מ של תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה 50 מ.</li>
		<li>העברת µL 100 של תגובת שיקוע הנותרים כדוגמה מערכת העצבים ההיקפית לניתוח טוהר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
סוכרוז הדרגתי
	<ol>
<li>להטות את הצינור צנטריפוגה 50 מ ל המכיל mL 8 של מערכת העצבים ההיקפית בזווית של 45°. להוסיף בזהירות 6 מ של 40% סוכרוז פתרון, המבטיח שני השלבים להישאר נפרדים.</li>
		<li>באופן דומה, לאט להוסיף 6 מ של 25% סוכרוז פתרון; לאחר מכן, הוסף 4 מיליליטר 10% סוכרוז הפתרון; לבסוף, להוסיף 8 מ של שכבת-העל של המאגר.</li>
		<li>Centrifuge המדגם ומפרידה במהירות גבוהה ב x 30,000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
		<li>להעביר את השכבה העליונה המכיל את LDs לרכבת התחתית microcentrifuge 1.7 מ.</li>
		<li>לרחצה LD, בצע את השלבים בסעיף 1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).</li>
<li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).</li>
<li>Correnti, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+C2+ceramide+activate+fatty+acid+oxidation+in+human+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12923(2018).</li>
<li>Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+ceramide+synthase+6+in+mouse+and+human+alcoholic+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis.</a> FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).</li>
<li>Carr, R. M., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+lipid+droplet+proteins+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin+Staining+Distinguishes+Between+Steatosis+and+Nonalcoholic%5BTitle%5D)+AND+%22Steatohepatitis+in+Adults+and+Children.+Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic.</a> Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).</li>
<li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+TIP47+improves+hepatic+steatosis+and+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).</li>
<li>Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+perilipin+2+prevents+hepatic+steatosis%2C+glucose+intolerance+and+ceramide+accumulation+in+alcohol-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice.</a> PLoS One. 9 (5), e97118(2014).</li>
<li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+constitutive+lipid+droplet+protein+PLIN2+regulates+autophagy+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver.</a> Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).</li>
<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).</li>
<li>Liu, K., Czaja, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid+stores+and+metabolism+by+lipophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).</li>
<li>Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cellular+lipid+droplets%3A+two+purification+techniques+starting+from+yeast+cells+and+human+placentas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e509814(2014).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).</li>
<li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologically+and+Functionally+Distinct+Lipid+Droplet+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations.</a> Scientific Reports. 6, 29539(2016).</li>
</ol>

ד ר קאר מקבל תמיכה במחקר תרופות ליירט.

ביולוגיה LD הכבד יותר ויותר להיות מזוהה הרגולטור קריטי של hepatocellular הפיזיולוגיה על בריאות ומחלה. כמו organelles בתום-לב, LDs הם דינמיים, אינטראקציה עם מבנים אחרים התאית, להכיל בתוך אותם רכיבים ביו-אקטיביים מעורב הומאוסטזיס השומנים והן גלוקוז. מעבר הצבע סוכרוז באופן שגרתי משמש לבידוד LD ומאפשרת החוקרים ללמוד את מבנה LD, אבל זה דורש מהם לבצע מאגרים רבים. הראו כי השימוש של ערכת זמינים מסחרית של בידוד בחדר המיון הוא כלי נוסף שיכול לשמש לא רק LD בידוד אבל טנדם בידוד של ER ו ליזוזום, המאפשר תצוגה מקיפה יותר של דינמיקה סלו...

LDs הם ביו organelles נמצא את ציטוזול של התאים האיקריוטיים, כמה תאים prokaryotic1,2,3. ליבת LD מורכב ליפידים נייטרלי כמו האסטרים כולסטרול טריגליצרידים (TG). הם גם מכילים סרמידים, מעורב הסלולר איתות המסלולים4,5ביואקטיביות שומנים. LDs מוקף של טפט פוספוליפיד, מצופה עם חלבונים, כולל את perilipin חלבונים perilipin 2 (PLIN2) ו- 3 (PLIN3)1,5,6. גם בהווה הם אנזימים lipogenic, lipases וקרום חלבונים סחר אשר קושרו מספר מחלות הכבד steatotic, כולל מחלת כבד שומני, מחלת כבד אלכוהולית של הפטיטיס C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs נחשבים טופס של הממברנה החיצונית של המיון ולהכיל TG לאחרונה מסונתז הטרייה ER-derived חומצות שומן בחינם11. עם זאת, נותר לא ידוע אם ליפידים במאגר באד, להישאר מחובר, או הדליות ה ER6,11, שהופך את ניתוקה של תעודות זהות ללא מיון טכנית מאתגר. חומצות שומן בחינם מנחים של תעודות זהות על-ידי הפעולה של פני השטח lipases כדי לספק ייצור אנרגיה או קרום סינתזה. בנוסף, LDs יכול להיות מושפל ויה lipophagy בתור מנגנון רגולטורי וכדי לייצר חומצות שומן בחינם12.
מלבד ER lysosomes, ישנם אחרים organelles — כגון המיטוכונדריה, endosomes, peroxisomes וקרום פלזמה — זה נמצאים בתוך האגודה קרוב של LDs11. פוליגמיה חזק זה מקשה לבצע מיצוי טהור של LD. עם זאת, צפיפות נמוכה מולדת של ליפידים נייטרלי ניתן לקחת לנצל באמצעות צנטריפוגה5.
באופן מסורתי, LDs היו מבודדים באמצעות סוכרוז דחיסות צבע1,5,13. עם זאת, שיטות אלה לא תוכננו כדי לבודד organelles אחרים. בנוסף, הם דורשים את הכנת ריאגנטים גוזלת זמן. פרוטוקול זה מסתגל של בידוד בחדר המיון זמינים מסחרית קיט (ראה את הטבלה של חומרים) כדי לאפשר בידוד LD. אנו משתמשים המאגר שאיבה שסופק על-ידי ערכת, הוספת שלב בידוד LD. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש גם עבור מיון ובידוד lysosomal באמצעות הדגימות אותו, ומאפשר תמונה מקיפה יותר של מחזור החיים של תעודות זהות. לאימות שיטה חדשה, אנחנו assay LD התשואה, מורפולוגיה, לגודל ו טוהר. אנו משווים את התוצאות המובאות לאלו שהושגו עם פרוטוקול נפוץ ניצול הדרגתי סוכרוז לבידוד LD.
השתמשנו של 10 עד 12-בת, 20 גרם הנשי C57BL/6 העכבר התענה עבור 16 h (הסרת מזון בשעה חמש בערב במשך תקופה של בידוד LD 9.00 A.M.) עם גישה חופשית למים. התשואה טיפוסי של TG 0.6 מ ג/גרם כבד, LD חלבון, זה הכבד 0.25 mg/g. זה מספק מספיק חומר immunoblots ~ 10 מאת דף מרחביות. הפרוטוקול להלן הפרטים ריאגנטים בשימוש, פרוטוקול מתאים כבד יחיד 1 g. פרוטוקול בידוד הדרגתיות סוכרוז מותאמת של סאטו14 ו וו15.

<table><tbody><tr><td>BioExpress מערבולת מיקסר</td><td>GeneMate</td><td>S-3200-1</td><td>מערבולת מיקסר</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 54242 R</td><td>Eppendorf</td><td>54242 R</td><td>קירור דלפק מיקרוצנטריפוגה רוטור: FA-45-24-11</td></tr><tr><td>צנטריפוגה Sorvall RC6 +</td> <td>Thermo Scientific</td><td>RC6 +</td> <td>צנטריפוגה במהירות גבוהה בקירור רוטור: F21S-8x50y</td></tr><tr><td>צנטריפוגה Sorvall Legend RT +</td> <td>Thermo Scientific</td><td>Legend RT+</td><td>Coold High Capacity צנטריפוגה רוטור: דלי 75006445: 75006441</td></tr><tr><td>cOmplete מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>04 693 116 001</td><td>טבליות מעכב פרוטאז</td></tr><tr><td>Diagenode Bioruptur UCD-200</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td>מערכת סוניקציה</td></tr><tr><td>מטחנת רקמות Dounce (45 מ"ל)</td> <td>Wheaton</td><td>357546</td><td>השתמש בעלי</td></tr> <tr><td>רופפיםמיצוי מי מלח עם פוספט (1x)</td> <td>קורנינג</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד רשתית אנדופלזמית</td> של <td>Dulbecco Sigma Aldrich</td><td>ER0100</td><td>לערכת ER מיצוי: מכיל: מאגר מיצוי איזוטוני 5X 100 מ"ל מאגר מיצוי היפוטוני 10 מ"ל סידן כלורי, תמיסה של 2.5 מ' 5 מ"ל OptiPrep שיפוע צפיפות בינוני 100 מ"ל מחט קהה עם אף 1 ea.</td></tr><tr><td>מקור אור חיצוני לעירור פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>Leica EL6000</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758</td><td>חומצה הידרוכלורית</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>תוכנת ניתוח תמונה</td></tr><tr><td>הפוכה מווסתת ניגודיות מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>Leica DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>ערכת העשרת ליזוזום לרקמות ותאים מתורבתים</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>89839</td><td>לבידוד ליזוזום</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מצלמה</td><td></td><td>Qimaging QICAM מהיר 1394</td><td></td></tr><tr><td>אופטימה XL-100K אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן-קולטר</td><td>XL-100K</td><td>אולטרה-צנטריפוגה רוטור: SW41Ti</td></tr><tr><td>פסטר פיפטס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-042817</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 5 ס"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04 906 845 001</td><td>טבליות מעכב פוספטאז</td></tr><tr><td>להב כירורגי סטרילי #10</td><td>Pioneer</td><td>S2646</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S5-500</td><td>טריגליצרידים גבישי / מוסמך ACS</td></tr><tr><td>ערכת ליקוויקולור</td><td>Stanbio&nbsp;</td><td>2200-225</td><td>ערכת טריגליצרידים קולורימטריים</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>עבור מאגר TE</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151-100</td><td>5%, פוליאתילן גליקול p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-אתר פניל, מגיב ליזה חלבון</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>עבור מאגר TE</td></tr></tbody></table>

השומנים מהירה droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

השומנים טיפות (LDs) הם ביו organelles נמצא בתוך ציטוזול את האיקריוטיים, כמה תאים prokaryotic. LDs מורכבים ליפידים ניטרלי עטוף ידי טפט של פוספוליפידים וחלבונים. שומנים LD הכבד, כגון סרמידים חלבונים הם מעורבים כמה מחלות הגורמות steatosis כבדית. למרות שיטות קודמות הוקמו לבידוד LD, הן דורשות זמן הכנה של ריאגנטים, שלא תוכננו עבור בידודו של תאים subcellular מרובים. אנחנו ביקשו להקים פרוטוקול חדש כדי לאפשר את ניתוקה של LDs רשתית תוך-פלזמית (ER), lysosomes של כבד עכבר אחת.
זה עוד רחוק, ריאגנטים כל שימוש בפרוטוקול המובאים כאן הם זמינים מסחרית ודורשים הכנה ריאגנט מינימלי מבלי להתפשר על טוהר LD. כאן אנו מציגים נתונים השוואת פרוטוקול חדש זה לפרוטוקול הדרגתיות סוכרוז סטנדרטי, הוכחת טוהר דומות, מורפולוגיה, ועם תשואה. בנוסף, נוכל לבודד ER ו- lysosomes שימוש באותה דגימת זרע, מתן נתונים היסטוריים תובנה היווצרות, שטף תאיים של שומנים וחלבונים הקשורים שלהם.

יש לבצע את הבידוד LD עם הקיט מיון על עכברים כ-30 ואנו והשוו את התוצאות עם אלה בעקבות פרוטוקול בידוד סוכרוז על 40 עכברים. הממצאים שדווחה אופייניות עבור פרוטוקולים. עכברים היו התענה בין לילה עם גישה חופשית למים, להגברת LD. LD בידוד באמצעות הדרגה סוכרוז היה לפעול במקביל עם ערכת ER LD בידוד פרוטוקול. דוגמאות של מערכת העצבים ההיקפית, PMS, לכל, CLDs ו- LDs שנאספו ברחבי ערכת ER LD בידוד פרוטוקול. עקב מגבלת זרימת העבודה של פרוטוקול בידוד סוכרוז, נאספו רק מערכת העצבים ההיקפית, LD המבודד.
<p cl...

פרוטוקול זה יוצר שיטה של השומנים droplet בידוד והיטהרות מן העכבר כבדים, באמצעות ערכת בידוד ומבוססת רשתית תוך-פלזמית.

השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

מחקר לביולוגיה של טיפת השומנים נפגע על ידי קושי של טיהור. בנוסף, לימוד שטף השומנים התאי דורש טיהור בו זמנית של organelles מרובים, ולא פרוטוקולים פשוטים היו זמינים כיום. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא להפוך טיהור טיפת השומנים לנגיש יותר.שינינו ערכה מסחרית זמינה כדי לבודד בו זמנית טיפות שומנים, רטיקולום אנדופלסמי, ו lysosomes מדגם אחד. הצטברות טיפת שומנים בכבד נוטה שמנים ואלכוהוליים חולים למחלות כבד מתקדמות. זה העביר את התצוגה של טיפות השומנים מתאים אחסון אינרטיים לאברונים דינמיים חשובים ביולוגית.כדי להתחיל, להשתמש ממטרים סטריליים ומספריים ניתוח לחתוך את העור ואת שכבות השרירים של הבטן של העכבר המתת לחץ על הציר האחורי-anterior, חשיפת הכבד. חותכים את הרצועות המחברות את הכבד למעי. באמצעות מדפים, למשוך את המעי מן הכבד, לכיוון האחורי.חותכים את הרצועה המחברת את הכבד לסרעפת. לאחר מכן, לחתוך בין הכבד ואת בית החזה הגבי, נע מן החלק האחורי האחורי, עד הכבד משוחרר. מעבירים את הכבד לצלחת פטרי קרה של חמישה סנטימטרים עם 10 מיליליטר של PBS קר 1x, ולשטוף את הכבד פעמיים על פלטפורמת נדנדה ב 10 מיליליטר של PBS 1x קר במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הכביסה הסופית, יוצקים את 1x PBS, ולהשתמש בלהב כירורגי סטרילי בגודל 10 כדי לקוביות את הכבד לחתיכות של שלושה עד חמישה מילימטר בתוך המנה. לאחר מכן, לשטוף את הכבד קצוץ פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS 1x קר במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. Decant PBS 1x, ולהעביר את חתיכות כבד קצוץ קר 45 מיליליטר Dounce homogenizer, להבטיח את כל החלקים נמצאים בתחתית.הוסף שבעה מיליליטר של מאגר IE 1x קר. הומוגניזציה על הקרח על ידי הזזת העלי למעלה ולמטה 20 פעמים, לוודא כי העלי הולך לתחתית homogenizer במהלך כל שבץ. מעבירים את ההומוגנטי לצינור צנטריפוגה קר של 15 מיליליטר.לשטוף את homogenizer עם מיליליטר אחד של חיץ IE 1x קר, ולהוסיף אותו לשאר הומוגנית. כדי להסיר גרעינים, צנטריפוגה הומוגנית בצנטריפוגה בקיבולת גבוהה ב 1, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ודא כי כל שומנים שנאספו בחלק העליון של הצינור 15 מיליליטר הוא resuspended כדי למנוע אובדן LD.מוודאים שהכדור הגרעיני בתחתית הצינור אינו מפריע, מעבירים את העל-טבעי הפוסט-גרעיני המכיל שומנים לצינור צנטריפוגה קר טרי של 50 מיליליטר. להעביר aliquot 100 מיקרוליטר של העל-טבעי שלאחר הגרעין לצינור מיקרוצנטריפוגה קר 1.7 מיליליטר על הקרח לניתוח טוהר מאוחר יותר. כדי להסיר מיטוכונדריה, צנטריפוגה מדגם על טבעי פוסט גרעיני בצנטריפוגה במהירות גבוהה בקירור ב 12, 000 פעמים g במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.ודא כי כל השומנים שנאספו בחלק העליון של הצינור הוא resuspended כדי למנוע אובדן LD, ולאחר מכן להעביר את העל טבעי שלאחר המיטוכונדריה לצינור אולטרהצנטריפוגה 13 מיליליטר. העבר aliquot 100 מיקרוליטר של על טבעי שלאחר המיטוכונדריה לצינור מיקרוצנטריפוגה קר 1.7 מיליליטר על קרח לניתוח טוהר מאוחר יותר. מלאו את הצינור האולטרה-מרכזי עם על-טבעי פוסט-מיטוכונדריאלי עד אפס מקום עם חיץ IE קר של 1x, כדי למנוע ממנו להתמוטט במהלך אולטרה-צנטריפוגה.לאזן את הדגימות, ולאחר מכן צנטריפוגה אולטרהצנטריפוגה ב 100, 000 פעמים g במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי להסיר את שכבת ה- LD, הטה את הצינור בזווית של 45 מעלות ושופע עם פיפטה מזכוכית. לאחר העברת גלולה לצינור מיקרוצנטריפוגה קר 1.7 מיליליטר, לאסוף 100 microliters של על טבעי שלאחר ER מתחת לשכבת השומנים לניתוח טוהר.כדי לסלק כל פסולת תא, צנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה במהירות שיא במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לחמם את הצינור בעדינות עם הידיים כדי לעזור resuspend שכבת LD, ולהעביר את supernatant, כולל שכבת השומנים, לצינור microcentrifuge חדש 1.7 מיליליטר. חזור על מדרגות כביסה אלה, חימום הצינור פעמיים עד שלוש פעמים, עד גלולה כבר לא גלוי.לאחר מכן, כדי לשטוף את גלולה ללא גלולה LD supernatant, להוסיף 1x PBS לנפח הסופי של 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה במהירות שיא במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר מיליליטר אחד של 1x PBS, אשר מתחת לשכבת השומנים, מבלי להפריע שכבת השומנים. חזור על שטיפת LD ארבע עד חמש פעמים, עד PBS 1x הוא שקוף ויזואלית ללא מערבולת.לאחר מכן, השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר את כל PBS 1x מתחת לשכבת השומנים, ולהשתמש שבר LD טהור וכתוצאה מכך לניתוח במורד הזרם. כאשר נציג 20x פלואורסצנט ותמונות LD brightfield נלקחו הן בידוד LD ערכת ER ושיטות בידוד LD סוכרוז, הם חשפו רמות דומות של חומר חלקיקי, מה שמרמז על טיהורים דומים באמצעות שני פרוטוקולים שונים. לאחר הטיהור נמדדו רמות הטריגליצרידים והחלבון של LD באמצעות בדיקות קוליורימטריות, והנתונים מנורמלו למשקל הכבד, מה שמראה שכאשר החומר ההתחלתי מנורמל, תפוקת הטריגליצרידים והחלבון של LD הייתה דומה באמצעות ערכת ה- ER ושיטת הסוכרוז.קטרים LD היו לכמת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, מראה כי בידוד LD ערכת ER ובידוד LD סוכרוז הניב LDs בגדלים דומים. כדי להעריך את טוהר LD, דגימות הוערכו על ידי immunoblotting, מראה כי LDs נגזר בידוד LD ערכת ER ואת פרוטוקול שיפוע סוכרוז שניהם היו טוהר שווה. PLIN2, סמן LD, זוהה בכל הדגימות למעט בידוד LD ערכת ER PER ו- PNS של סוכרוז.ניתוח טוהר של שבר ER באמצעות immunoblots מראה כי הם היו ללא סמן LD PLIN2 אבל היו רמות משמעותיות של חלבון ER SEC61A. טוהר של שבר lysosomal לאחר טיהור נוסף של lysosomes באמצעות ערכת העשרה lysosome הוערך גם. גילוי הוא כרגע היישום השימושי ביותר של הפרוטוקול שלנו.אנו מבצעים ליפידומיים באברונים מטוהרים, והראה ליפוטוקסינים מוגברים במיוחד טיפות השומנים במחלת כבד אלכוהולית.

rapid-lipid-droplet-isolation-protocol-using-well-established

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית היווצרות הסינפסה החיסונית בתאי הרג טבעי (NK) על שכבה דו-שכבתית שומנית נתמכת (SLB). ה-SLB מסומן תחילה עם ליגנד קולטן של תא NK המתויג כפלואורופור, ולאחר מכן דגירה עם תאי NK. לאחר מכן, התאים מוכתמים עבור אקטין פולימרי גרגירים ליטיים חיוביים perforin. גישה זו מאפשרת הדמיה של היווצרות סינפסות באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED).

הדמיה ברזולוציית על של היווצרות סינפסה אימונולוגית של תאי NK על דו-שכבה ליפידית נתמכת

בנייה מחדש של חלבונים בממברנה פונקציונליים ליפוזומים ענקים של הרכב מוגדר היא גישה רב עוצמה בשילוב עם electrophysiology תיקון מהדק. עם זאת, ייצור liposome ענק קונבנציונלי עשוי להיות בקנה אחד עם יציבות חלבון. אנו מתארים פרוטוקולים לייצור ליפוזומים ענקים משומנים טהורים או ליפוזומים קטן המכיל תעלות יונים.

הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

שתי טכניקות לבידוד טיפות שומנים סלולריות מ1) תאי שמרים ו2) שליות אדם מוצגות. במרכזו של שני ההליכים הוא צנטריפוגה שיפוע הצפיפות, שבו השכבה הצפה וכתוצאה מכך המכילה טיפות ניתן דמיינו בקלות על ידי העין, שחולצה, ולכמת על ידי ניתוח כתם מערבי לטוהר.

בידוד של טיפות שומנים נייד: שתי טכניקות טיהור החל מתאי שמרים ושליות אדם

מייקרו RNA לשחק תפקיד רגולטורים חשוב והם מתעוררים כמו מטרות טיפוליות חדשניות למחלות אנושיות שונות. הוכח כי miRNAs נישאים ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה. פיתחנו שיטה פשוטה לבודד HDL מטוהרים במהירות מתאים לניתוח מירנה מפלסמה אנושית.

שיטה מהירה ופשוטה עבור בידוד גבוה באמצעות-לשים של מירנה מן ליפופרוטאין בצפיפות הגבוה מאוד מטוהר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזהות אירועי היתוך אחד, בתיווך מלכודת בין ליפוזומים bilayers נתמך ערוצי microfluidic באמצעות TIRFM המקוטב, עם רגישות מולקולה בודדת ~ 15 ברזולוצית זמן msec. ליפידים ושחרור מטען מסיס ניתן לאתר בו זמנית. Liposome גודל, diffusivity שומנים, ואת הנקבוביות היתוך מאפיינים נמדדים.

מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והכימות של רנ"א קטן של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה.

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות

טיפות ליפידים הם אברונים חשובים עבור שכפול של מספר פתוגנים, כולל וירוס הפטיטיס C (HCV). אנו מתארים שיטה לבודד טיפות השומנים עבור ספקטרומטריית מסה כמותית של חלבונים הקשורים; ניתן להשתמש בו תחת מגוון של תנאים, כגון זיהום וירוס, לחץ סביבתי, או טיפול תרופתי.

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

פרוטוקול מהיר ויעיל מוצג לבידוד של טיפות שומנים plastoglobule הקשורים אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים. הכנה מוצלחת של פלסטוגלובולים מבודדים היא צעד ראשון מכריע שקדם למחקרים מולקולריים מפורטים כגון ניתוחים פרוטאומיים וליפידומיים.

בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים אחרים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר ומיקרומטר.

בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר

ליפופגיה היא צורה סלקטיבית של אוטופגיה הכוללת פירוק של טיפות שומנים. תפקוד לקוי בתהליך זה קשור להתפתחות סרטן. עם זאת, המנגנונים המדויקים עדיין לא מובנים במלואם. פרוטוקול זה מתאר גישות הדמיה כמותית כדי להבין טוב יותר את יחסי הגומלין בין אוטופגיה, מטבוליזם של שומנים והתקדמות סרטן.

חקר הוויסות של קטבוליזם טיפות שומנים באמצעות ליפופגיה

למדו שיטה חדשנית לבידוד טיפות שומן מכבד עכברים באמצעות ערכת בידוד מסחרית לרשתיתיתית. הפרוטוקול מאפשר בידוד סימולטני של אברונים מרובים ומקדם מחקר בביולוגיית טיפות שומן ובמחלות כבד.

השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון

גלה סרטונים נוספים