Name: זיהוי של הקולטנים Orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים Zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למדו פרוטוקולים לאימונוהיסטוכימיה לזיהוי קולטני Orexin ואנדוקאנאבינואידים בדגי זברה בוגרים. השיטות כוללות אימונופלואורסצנציה ואימונופרוקסידאז לניתוח שינויים בקולטנים בתנאי השמנה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה נתמך על ידי Fondi Ricerca די Ateneo (FRA) 2015-2016, אוניברסיטת סאנניו.

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

הכנה לדוגמא
הכנת הדוגמה היא השלב הקריטי הראשון ב-IHC. פרוטוקול אמין מאפשר תחזוקה של מורפולוגיה של תאים, ארכיטקטורת רקמות ואנטיגניות. שלב זה מחייב איסוף רקמות נכון, קיבוע והסדר22,23. המטרה של קיבעון היא לשמר את הרקמה ולהפחית את הפעולה של אנזימים רקמות או מיקרואורגניזמים. בפרט, שלב הקיבוע משמר רכיבים סלולאריים ומbiomolecules, מונע העברת המרכיבים הסלולריים (כגון אנטיגנים ואנזימים), מייצב חומרים סלולאריים מפני השפעו...

אימונוהיסטוכימיה (ihc) היא טכניקה קלאסית הוקמה היטב בשימוש כדי לזהות רכיבים סלולריים או רקמות (אנטיגנים) על ידי הנוגדן אנטיגן אינטראקציה1,2. ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הלוקליזציה וההפצה של biomolecules היעד בתוך הרקמה. IHC משתמשת בתגובות אימונולוגיים וכימיים כדי לזהות אנטיגנים בסעיפים רקמות3. הסמנים העיקריים המשמשים להדמיה של אינטראקציות אנטיגן-נוגדן כוללים צבעי פלורסנט (immunofluorescence) ו-המצע האנזים התגובות צבע (פרוקסידאז), שניהם מצוענים ל נוגדנים4. באמצעות תצפית מיקרוסקופית ניתן לקבוע את הלוקליזציה של רקמת התווית, אשר בקירוב מתאים ללוקליזציה של אנטיגן היעד ברקמה.
שתי שיטות קיימות עבור התגובות פלורסנט או כרומוגניים כדי לזהות חלבון: שיטת איתור ישירה, שבה הנוגדן העיקרי הספציפי מתויג ישירות; ואת השיטה לזיהוי עקיף, שבו הנוגדן העיקרי הוא בלתי מצומת בעוד הנוגדן המשני נושאת את התווית5,6,7. לשיטה העקיפה יש כמה יתרונות, שהוא בעיקר הגברה האותות שלה. כמו-כן, בניגוד לטכניקות מולקולאריות אחרות של מולקולות וסלולר, ניתן לדמיין את ההפצה, הלוקליזציה והביטוי של שני חלבונים או יותר המתבטאים בתוך תאים ורקמות7. בחירת שיטת האיתור המשמשת בשימוש תלויה בפרטים הניסיוניים.
עד כה, IHC משמשת רבות במחקר בסיסי ככלי רב עוצמה וחיוני כדי להבין את ההפצה והלוקליזציה של סמנים ביולוגיים ואת הפרופיל הכללי של חלבונים שונים ברקמות ביולוגיות מאדם לחסרי חוליות8, מיכל בן 10 , מיכל עשור , 11. הטכניקה מסייעת להציג מפה של ביטוי החלבון במספר רב של אברי בעלי חיים רגילים ושונים וסוגי רקמות שונות, המראים אפשרות כלפי מטה או מעלה ביטוי הנגרם על-ידי שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים. IHC היא טכניקה רגישה מאוד הדורשת דיוק ובחירה נכונה של שיטות להשגת תוצאות אופטימליות12. קודם כל, גורמים שונים רבים כגון קיבעון, לחצות את הפעילות, לאחזור אנטיגן, ורגישות של נוגדנים יכול להוביל שווא חיובי שווא אותות שליליים13. בחירת הנוגדנים היא אחד השלבים החשובים ביותר ב-IHC והיא תלויה במגוון האנטיגן ובזיקה לחלבון ולמינים הנמצאים תחת חקירה7.
לאחרונה, יש לנו אופטימיזציה של הטכניקה ihc כדי לזהות חברים של orexin/היפושנון מערכות אנדוקנאיאיד בתוך רקמת מבוגרים דג זברה. אנו מתמקדים בעיקר על קיבוע, רקמה הטבעה באמצעות שתי גישות שונות, הפרדה והרכבה (אשר יכול להשפיע על החלטה ופרטים במהלך ניתוח מיקרוסקופיים), חסימה (כדי למנוע תוצאות חיוביות שווא ולהפחית את הרקע)14. מאפיינים חשובים אחרים הם הנוגדנים מפרט ובסלקטיביות והשכולים של פרוטוקולים IHC בודדים. המפתח למתן ספציפיות נוגדן הוא השימוש של פקדים שליליים (כולל לא נוגדנים הראשי או רקמות כי ידוע לא לבטא את החלבונים היעד), כמו גם פקדים חיוביים (כולל רקמות כי ידוע לבטא את החלבונים היעד)15 . בחירת נוגדנים עבור ihc מבוססת על בסיס המינים שלהם-ספציפיות (הסבירות שבה הם מגיבים עם אנטיגן של עניין) ואת אנטיגן-נוגדן מערכות זיהוי מחייב המשמש4,5,6 ,7. במקרה של פרוקסידאז, הצבע של התגובה נקבע על ידי הבחירה של כרומוגן התלול, בדרך כלל diaminobenzidine (חום)16. מצד שני, אנימשתמש בנוגדנים בעלי מצועם עם פלואורופראור כדי להמחיש ביטוי חלבון במקטעים של רקמות קפואות ומאפשר ניתוח קל של חלבונים מרובים ביחס למערכת האיתור הרומוגנית מיכל 5 , 7. לאחר מכן
בטכניקת פרוקסידאז, הנוגדן המשני הוא מעלה באוב כדי biotin, מולקולה מקשר מסוגל לגייס מולקולה עיתונאי כרומוגניים [avidin-biotin קומפלקס (ABC)], המוביל הגברה של האות מכתים. עם שיטת העיתונאי ABC, האנזים peroxidase מגיב עם 3, 3 '-diaminobenzidine (בתוספת), הפקת כתמים בצבע חום אינטנסיבי שבו האנזים נקשר הנוגדן המשני, אשר ניתן לנתח עם מיקרוסקופ אור רגיל. כתמים ABC, בשל הזיקה הגבוהה של אבידין עבור biotin, מייצרת תגובה מהירה ואופטימלית, עם כמה נוגדנים משניים המחוברים לאתר של הנוגדן העיקרי הפעילות. שיטת זיהוי כרומוגניים זו מאפשרת ניתוח הדסיטומטלי של האות, המספקת נתונים חצי כמותיים המבוססים על התאמה של רמות האות החום עם ביטוי חלבון רמות18.
עם שיטות immunofluorescence גילוי סימולטני של חלבונים מרובים אפשרי בשל היכולת של fluorochromes שונים כדי לפלוט אור באורכי גל ייחודיים, אבל חשוב לבחור fluorochromes בזהירות כדי למזער חפיפה ספקטרלית 5. יתר על כן, השימוש בנוגדנים העיקריים במינים מארחים שונים ממזער את הקשיים הנוגעים לפעילות החוצה. במקרה זה, כל מיני-נוגדן משני ספציפי מזהה רק סוג אחד של נוגדן ראשוני. כתבים פלואורסצנט הם מולקולות אורגניות קטנות, כולל נגזרים מסחריים, כגון אלקסה פלואו צבעים.
מודלים רבים של בעלי חיים משמשים להבנת מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים מסוימים. עד כה, הוא הוקם כי מסלולים מטבולית רבים נשמרים במהלך האבולוציה. לכן, מחקרי IHC במודלים של אורגניזמים כגון מצדגים יכולים לספק תובנה לבראשית ולתחזוקה של מצבים פתולוגיים ובלתי פתולוגיים17. זוהי מטרת דו ח זה כדי להמחיש פרוטוקולים ihc כי ניתן לבצע על רקמת דג זברה למבוגרים ולהשתמש כדי לקבל תמונות מפורטות של הפצה ולוקליזציה של oxa, OX-2r, ו CB1R ברמות היקפיים והמרכזי. דווח גם הם פרוטוקולים עבור יישום של שתי שיטות הגדולות IHC עקיף ברקמות היקפיים והמרכזית של דג מבוגר. מתוארים היא שיטה עקיפה, אשר מאפשרת הגברה האות במקרים שבהם נוגדן משני מצומת לצבוע פלורסנט (שיטת החיסונית) או כתב אנזים (פרוקסידאז שיטה). הן כרומוגניים והן שיטות זיהוי פלורסנט בעלי יתרונות וחסרונות. מדווח בפרוטוקול זה הוא השימוש ב-IHC, בעיקר במערכת החיסונית, מדגם בעלי חיים הנפוץ ביותר ללימוד מערכות ההתפתחותיות בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים.

<table><tbody><tr><td>אנטי CB1</td><td>Abcam</td><td>ab23703</td><td></td></tr><tr><td>אנטי OX-2R</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-8074</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-OXA</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc8070</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex</td><td>Merck</td><td>1,085,620,050</td><td></td></tr><tr><td>ארנב ביוטיניל אנטי עז</td><td>וקטור מעבדה</td><td>BA-5000</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystem</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית</td><td>Leica Biosystem</td><td>DFC320</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית למיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>חמור אנטי עז Alexa fluor 488-מצומד משני נוגדנים</td><td>תרמו פישר</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>חמור אנטי עז אלקסה פלואור 594 נוגדנים משניים מצומדים</td><td>תרמו פישר</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>חמור אנטי ארנב אלקסה פלואור 488 נוגדנים משניים מצומדים</td><td>תרמו פישר</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>חמור אנטי ארנב אלקסה פלואור 594 נוגדנים משניים מצומדים</td><td>תרמו פישר</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>VWR</td><td>20,821,330</td><td></td></tr><tr><td>תרכובת חתך קפוא</td><td>Leica Biosystem</td><td>FSC 22 מדיה</td><td></td>חתך קפוא</tr><tr><td>H2O2</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>31642</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20,252,290</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB</td><td>וקטור מעבדה</td><td>SK4105</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica Biosystem</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystem</td><td>RM2125RT</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>סרום ארנב רגיל</td><td>Vector lab</td><td>S-5000</td><td></td></tr><tr><td>שעוות פרפין</td><td>Carlo Erba</td><td>46793801</td><td></td></tr><tr><td>Paraphormaldeyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט דיהידראט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka אנליטי</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>VectaStain עלית ABC ערכת</td><td>וקטור מעבדה</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>קסילן טהור</td><td>קרלו ארבה</td><td>392603</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של הקולטנים orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה מאוד רגיש וספציפי מעורב בזיהוי של אנטיגנים היעד בסעיפים רקמה עם נוגדנים עם תוויות. זהו תהליך רב-שלבים שבו האופטימיזציה של כל שלב חיונית להשגת האות הספציפי האופטימלי. באמצעות IHC, ניתן לזהות את ההפצה והלוקליזציה של סמנים ספציפיים ולחשוף מידע על שימור אבולוציוני. יתר על כן, IHC מאפשר הבנה של ביטוי והפצה של שינויי הסמנים בתנאים פתולוגיים, כגון השמנה. IHC, בעיקר את הטכניקה החיסונית, ניתן להשתמש בדגים מבוגרים כדי לזהות את הארגון והפצה של מולקולות שימור של phylogenetically, אבל פרוטוקול IHC סטנדרטי אינו מהווה הליך מגנטי. Orexin ו אנדוקאנאיאיד הם שתי מערכות שמרו במיוחד מעורבים בשליטה של צריכת מזון פתולוגיה השמנה. שדווחו כאן הם פרוטוקולים המשמשים להשגת מידע על orexin פפטיד (OXA), קולטן orexin (OX-2R), ו קולטן קנביאיד (CB1R) לוקליזציה והפצה בבטן ובמוח של נורמלי המושרה דיאטה שמנים (DIO) מבוגרים דגים מודלים. כמו כן תיאר הן שיטות לפרוקסידאז וכפולה החיסונית, כמו גם הכנת ריאגנטים, קיבעון, פרפין-הטבעה, והקפאה של רקמת דג זברה והכנה עבור הפעילות האנדוגניים בשלב והרקע כתמים מנגד. מערכת הפרמטרים המלאה מתקבלת מניסויים קודמים של IHC, שדרכם הראינו כיצד מערכת חיסונית יכולה לסייע בהבנת ה-OXs, OX-2R והפצת CB1R, לוקליזציה ושימור ביטוי בדגי מבוגר רקמות. התמונות המתקבלות עם עוצמת אות ספציפית מאוד הובילה לאישור כי דג זברה מתאימים מודלים בעלי חיים עבור מחקרים אימונוהיסטוכימיה של הפצה, לוקליזציה, ושימור אבולוציוני של סמנים ספציפיים ב מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. הפרוטוקולים המוצגים כאן מומלצים לניסויי IHC בדגי מבוגרים.

נתוני הנציג עבור הפרוקסידאז הצביעת מוצגים באיור 1 ובאיור 2. אימונוהיסטוככימיים ניתוח של התפלגות שור-A ו-OX-2R בבטן של דגי מבוגרים הראו אתרי לוקליזציה שונים של OX-A ו-OX-2R ואת העליות שלהם ביטוי בתאי המעיים של ה-DIO. כתמים חומים עזים עבור שור-A נצפתה בתאים של המעי האמצעי והקדמי (איור 1A, A1). הביטוי החיסוני של שור-A נתן אותות ברורים בהשוואת המעיים השונים, היורדת מהקדמית לכיוון המעי האמצעי (איור 1b</str...

הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור האפיון אימונוהיסטוכימיה ולוקליזציה של מזון orexin, וקולטנים orexin, ו קולטנים אנדוקאנביאיד בבטן ובמוחות של השמנה רגילה דיאטה המושרה (DIO) בוגרים דג זברה מודלים באמצעות שיטות אימונוimmunoperixidase וכפולות.

זיהוי של הקולטנים Orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים Zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

כיום, immunohistochemistry משמש בתדירות הולכת וגוברת כדי לזהות את נוכחותם של סמנים מולקולריים ספציפיים ואת השינויים שלהם במקרה של פתולוגיות, נותן שורש לאפשרות לבצע ניתוח כמותי. אימונוהיסטוכימיה, בעיקר טכניקת immunofluorescence, משמשת בזחל ובמודל החיה של דג הזברה הבוגר, אך מעט מאוד ידוע על פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי טוב עבור דגי זברה. כאן אנו מתארים וממחישים פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לחקור את השימור האבולוציוני של חלבונים חשובים בזברה-דגי זברה בוגרים.פרוטוקול טוב לאימונוהיסטוכימיה בדג זברה בוגר יכול לעזור ביסוד התועלת של מודל זה של בעלי חיים כדי לחקור את הביטוי המורפולוגי ואת ההפצה של ביומולקולות שמורות מאוד. שיטה זו יכולה גם לעזור לנתח שינויים אפשריים של ביומולקולס אלה עקב תנאים פתולוגיים בקורלציה לפיזיולוגיה האנושית. הדגימה של ההליך תהיה ד"ר לאה טוניסי, דוקטורנטית מהמעבדה שלי.כדי להתחיל בהליך זה, להעביר את בלוקים רקמה קפואה מוכן קריוסטט במינוס 20 מעלות צלזיוס. חותכים את הבלוק בחלקים קורונטל או קשת של 10 מיקרומטר. לאחר מכן, לאסוף את הרקמות בחלקים סדרתיים חלופיים על מגלשות זכוכית דבק מתאים immunohistochemistry, ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס עד מוכן להמשיך.ראשית, השתמש בעט עמיד בממס כדי לתאר את אזור הרקמה בשקופית. שוטפים את החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד באמצעות חיץ פוספט 0.1 טוחן. לאחר מכן, יש להמיס 0.3 מיליליטר של טריטון X-100 ב-100 מיליליטר של מאגר פוספט 0.1 טוחן כדי להכין את טריטון X-100 0.3%, להמיס 0.1% סרום חמור רגיל במאגר פוספט המכיל 0.3% טריטון X-100 להכנת פתרון החסימה.הדגירה את החלקים עם הפתרון של סרום חמור נורמלי מומס חיץ permeabilization PB-טריטון X-100 0.3% במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל קרום התא ולחסום את אתרי הכריכה שאינם ספציפיים. ראשית, לשטוף את החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם חיץ פוספט 0.1-טוחן. מוסיפים את תערובת הנוגדנים הראשוניים המדוללים ב- PB-T, ומדגרים את החלקים לילה בקופסה לחה בטמפרטורת החדר.ביום שאחרי, לשטוף את החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם חיץ פוספט 0.1-טוחן. חלקי דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים בתערובת מתאימה של נוגדנים משניים מדולל PB-T. כדי להתחיל, לשטוף את החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם חיץ פוספט 0.1-טוחן.להמיס 1.5 microliters של DAPI בשלושה מיליליטר של מאגר פוספט כדי להכין את DAPI צבע גרעיני. תנטרל את החלקים בצבע. לאחר מכן, השתמש במדיום הרכבה כדי מכסה את השקופיות כדי לייצב את הרקמה ואת הכתם לשימוש ארוך טווח.דגימות פלואורסצנטיות ניתן לאחסן בחושך בארבע מעלות צלזיוס. חזור על פרוטוקול immunofluorescence, וגם להשמיט את הנוגדן העיקרי או המשני, או להחליף את הנוגדן העיקרי או המשני עם מאגר פוספט כדי להכין את השליטה השלילית. לאחר מכן, חזרו על פרוטוקול הכשל החיסוני וספגו מראש כל נוגדן ראשוני עם עודף של הפפטיד היחסי.חזור על פרוטוקול immunofluorescence על פרוסות של מוח העכבר כדי להכין את השליטה החיובית. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בשלב ממונע X-Y-Z, מצלמה דיגיטלית, ותוצר רכישה וניתוח, להתבונן ולנתח את החלקים הכשלים במערכת החיסון. להשיג תמונות דיגיטליות עם 5x, 20x, ו 40x מטרות.לצלם תמונות של כל מקטע בהגדלה נמוכה בכל אחד מהערוצים הזמינים כדי להלחין מונטאז' בהגדלה נמוכה. מנרמלים את תמונות הפלואורסצנטיות לניגודיות ולשכבות-על מרביות. בכל תחום העניין, לאסוף סידורי Z-ערימות של תמונות דרך שישה מישורים מוקד עם מדרגות מוקד של אחד עד 1.8 מיקרומטר.בצע אוסף זה עבור כל ערוץ בנפרד. לאחר מכן, השתמש בתוכנת דימות deconvolution כדי deconvolvolve תמונות על ידי יישום של 10 איטראציות, ול לכווץ את התמונות טוריות במישור Z לתוך תמונת הקרנה מקסימלית אחת. השתמש בתוכנה מתאימה לעריכת תמונות כדי לכוונן את המיקרוגרפים לאור וניגודיות.ניתוח אימונוהיסטוכימי של התפלגות OX-A ו- OX-2R במעיים של דגי זברה בוגרים מראה אתרי לוקליזציה שונים של OX-A ו- OX-2R ועליות הביטוי שלהם בתאי המעי של דגי זברה של DIO. כתמים חומים עזים עבור OX-A נצפתה בתאי המעי המדיאלי והתורי. הדיכוי החיסוני של OX-A נותן אותות ברורים בתאי המעיים השונים, פוחת מהקם הקדמי לכיוון המעי המדיאלי.תוצאות דומות נצפו עבור OX-2R immunoexpression במעי של DIO ושליטה דיאטה זברה. אות OX-A מוגבר בדג זברה למבוגרים DIO מלווה בלחץ יתר של OX-2R בתאי מעיים אחרים. ניתוח מדויק של תמונות immunofluorescent מראה את הגידול של OX-2R / CB1R colocalization במעיים של דג זברה בוגר DIO בהשוואה לת דיאטה שליטה זברה.מצב דומה נצפה באזורי מוח שונים, כגון הטלנצפלון הגבי, ההיפותלמוס, הטיקאטום האופטי, הטורוס Lateralis, וגרעין מפוזר של האונה הנחותה. על ידי כשל חיסוני כפול עם אורקסין-A ו- CB1R קולוקליזציה, הוא ציין כי חלה עלייה של colocalization בנוירונים orexinergic של ההיפותלמוס, מלווה בעלייה של אות פלורסנט orexin-A. תוצאות אלה מראות כיצד שפעת חיסונית כפולה יכולה לסייע בזיהוי ביטוי חלבון שנוסף מבחינה פיזיולוגית, קולוקליזציה של חלבוני יעד ושינויי ההפצה ו/או הביטוי שלהם בתנאים פתולוגיים שונים.באמצעות immunofluorescence, אנו יכולים להבין טוב יותר את codistribution ו דו דיכוי של ביומולקולים, האינטראקציות האפשריות שלהם, ואנחנו יכולים גם לקבל תמונה גלויה של השינויים שלהם במקרה של פתולוגיות שונות. יתר על כן, ההתפלגות הנוירואנטומית של ביטוי אנזים מטבולי או קולטנים עשויה לחשוף עוד יותר את התפקיד של איתות חלבון בתוך רקמות. העבודה הטכנית הנוכחית הציגה את גישת האימונופלואורסצנטיות כדי לחקור שתי מערכת שמורות מאוד, אורקסין ו אנדוקנבינואידים, באמצעות מודל זברה-דג בוגר.באמצעות פרוטוקול זה המתואר כאן בפעם הראשונה במוחו של דג זברה בוגר, ההתפלגות האנטומית ודיכוי משותף של קולטני orexin-2 ואת קולטני אנדוקנבינואיד-CB1 לא נקבע. אנו ממליצים על הפרוטוקולים המתוארים כאן לניסויים אימונוהיסטוכימיים ולזהות הפצה מרחבית וארגון של קולטנים בפפטידים בזברות בוגרות כדי להבין טוב יותר את תפקודיהם.

identification-orexin-endocannabinoid-receptors-adult-zebrafish-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחקירת לוקליזציה משותפת של קולטני אורקסין וקנבינואידים ברקמת מוח של דגי זברה בוגרים הנגרמים על ידי השמנת יתר נורמלית ודיאטה (DIO) באמצעות אימונופלואורסנציה.

זיהוי של לוקליזציה משותפת של אורקסין וקולטן קנבינואידים בדגי זברה שמנים הנגרמים על ידי דיאטה

הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

מתקן דג זברה המתאים לגידול ומחקר in vivo בנוי בצורה קלה ומשתלמת. התחזוקה מינימלית. מתקן זה אידיאלי למעורבות סטודנטים ולמחקר עצמאי.

הקמת מתקן דג הזברה בנייה קלה למשתלם ו

מתוארת טכניקה חדשה לאיתור קולטנים אנדוגניים בשפע נמוך הקיימים בעוברי דג הזברה. קראנו לו AFLIP מכיוון שהוא מורכב מתיוג זיקה של הקולטן על ידי הליגנד שלו המקושר למשקעים חיסוניים.

איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תמונות על ידי שילוב הכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה של חלקים עובריים של דגי זברה. הכלאה באתרו בוצעה לפני הקפאה, ואחריה הכתמת נוגדנים. כדאי לזהות את דפוסי הביטוי של שני גנים בדגי זברה אם יש מיעוט נוגדנים.

ב Situ הכלאה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה בעוברי דגי זברה Cryosectioned

דגי זברה המכוונים לאלקטרופילים ומחמצנים תגובתיים (Z-REX) היא שיטה מבוססת ביולוגיה כימית לחקר איתות תגובתי של מולקולות קטנות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על דגים חיים בשלבי התפתחות שונים. כאן, אנו משלבים בדיקות סטנדרטיות בדגי זברה עם Z-REX לניתוח מסלולי איתות.

ניטור תגובות איתות ממוקדות בדגי זברה זחלים - Z-REX חושף מנגנונים מדויקים של תרופות אלקטרופיליות ומטבוליטים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבחינת פעילות עצבית באזורי מוח של דגי זברה טרנסגניים המבטאים מדדי סידן GCaMP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ב Vivo הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של פעילות עצבית הנגרמת על ידי גירוי חושי בדג זברה זחל מרוסן חלקית

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

למדו פרוטוקולים לאימונוהיסטוכימיה לזיהוי קולטני Orexin ואנדוקאנאבינואידים בדגי זברה בוגרים. השיטות כוללות אימונופלואורסצנציה ואימונופרוקסידאז לניתוח שינויים בקולטנים בתנאי השמנה.

זיהוי של הקולטנים Orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים Zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות

גלה סרטונים נוספים