Name: הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: למדו שיטה מהירה להערכת רעילות תרכובות כימיות בעוברי דגי זברה. הפרוטוקול מאפשר זיהוי השפעות לוואי ושינויים פנוטיפיים עדינים במעבדה בסיסית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

העבודה היה נתמך על ידי מענקים Sigrid Juselius קרן (SP, MP), בקרן התרבות הפינית (AA, MH), האקדמיה של פינלנד (SP, MP), אוריון Farmos קרן (MH), שחפת טמפרה קרן (SP, MH ו-MP) וג ואטוס Erkko קרן (SP ו-MP ). אנו מודים למשתפי-הפעולה האיטלקיים והצרפתיים שלנו, פרופ ' סופורו ופרופ ' וינר, למתן מעכבי אנהיהידרסה בתחום הבטיחות והרעילות למטרות אנטי-TB ופיתוח תרופות נגד סרטן. אנו מודים לאויקקי להמן ולמריאן Kuuslahti על הסיוע הטכני. אנו מודים גם ללינה מנדיסן והאנניאנה פיפו על עזרתם בגידול הדגים ובאיסוף העוברים. בכנות, אנו מודים להארלן בארקר על הערכה קריטית של כתב היד והערות תובנה.

מתקן הליבה דג זברה באוניברסיטת טמפרה יש אישור מוסד שניתנו על ידי הלוח הלאומי ניסוי בעלי חיים (esavi/7975/04.10.05/2016). כל הניסויים באמצעות העוברים דג זברה בוצעו על פי ממשלת מחוזי של פינלנד המזרחית, המחלקה החברתית והבריאות של שירות אזורית טמפרה פרוטוקול השירות האזורי lslh-2007-7254/Ym-23.
1. הקמת מיכלי הזדווגות לילה
<ol><li>מקום 2-5 בוגר זכר דג זברה ו 3-5 נקבה מבוגרת הדגים לתוך מיכלי הזדווגות לילה. (הרבייה מושרה בבוקר על ידי מחזור כהה אוטומטי ואור בלילה).</li>
	<li>להגדיר כמה צלבים כדי להשיג מספיק עוברים להערכת רעילות של יותר משני תרכובות כימיות. להערכת רעילות, כל ריכוז זקוק למינימום של 20 עוברים23.</li>
	<li>כדי להימנע מטיפול בלחצים לבעלי חיים, הניחו לחיות לנוח למשך שבועיים לפני השימוש באותם אנשים לצורך הרבייה.</li>
</ol>2. אוסף העוברים והכנת צלחות לחשיפה לתרכובות כימיות
<ol><li>לאסוף את העוברים, יום למחרת לפני הצהריים, באמצעות מסננת בסדר שינוי ולהעביר אותם על צלחת פטרי המכיל E3 העובר בינוני [5.0 mM הנאקל, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 Mm MgSO4, ו 0.1% w/v מתילן Blue].</li>
	<li>הסרת פסולת באמצעות פיפטה מפלסטיק של פסטר (למשל, מזון ופסולת מוצקה). בחנו כל קבוצה של עוברים תחת הstereomicroscope כדי להסיר את העוברים הבלתי מופרות/מתים (המזוהים באמצעות המראה האטום שלהם).</li>
	<li>לשמור על העוברים ב 28.5 ° c בחממה. לבחון את העוברים, בבוקר שלמחרת, תחת stereomicroscope ולהסיר עוברים בריאים או מתים. כמו כן, החלף את המדיום E3 הישן עם מדיום E3 טרי. הערה: עוברי הדגים מתוחזקים תמיד ב-28.5 ° c בתנאי מעבדה.</li>
	<li>העבר בזהירות 1 העובר לתוך כל טוב של הצלחת 24-באר המכיל מספיק E3 בינוני כדי לכסות את העוברים.</li>
</ol>3. ההכנות של פתרון המניה של תרכובות כימיות והפצה של תרכובת מדוללת בבארות
<ol><li>קחו את הבקבוקונים המכילים תרכובות מעכבי המאוחסנות ב -4 ° c. הערה: בהתאם למאפיינים של התרכובת, אלה מאוחסנים בטמפרטורות שונות.</li>
	<li>שוקלים את התרכובת באמצעות איזון אנליטי שיכול לשקול כמה מיליגרם (mg) של המתחם במדויק.</li>
	<li>הכינו לפחות 250 μL (100 מ"מ) של פתרון מניות עבור כל תרכובת בממס מתאים (למשל, E3 מים או Diמתיל סולפוקסיד (DMSO), מבוסס על מאפייני מסיסות של תרכובות. הערה: ניתן לבצע את השלבים לעיל יום לפני תחילת הניסוי בזמן נוח ומאוחסן ב -4 ° c.</li>
	<li>הפוך את הדילול הסידורי של פתרונות המניה (e. g., 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 300 μM ו-500 μM) באמצעות E3 מים ב 15 שפופרות צנטריפוגה mL. הערה: ריכוזי ומספר הדילול הסדרתי משתנים מתרכובת אחת לתרכובת אחרת, בהתאם לרמת הרעילות שלהם.</li>
	<li>מצלחת 24 היטב המכיל עוברים, להסיר E3 מים מן הבארות באמצעות הפיפטה פסטר ופיפטה 1 mL (המכיל אחד עוברי dpf) שורה אחת בכל פעם.</li>
	<li>פזר 1 מ ל של כל מדלל בכל באר (החל מלמטה ומתקדם לריכוז גבוה יותר) לתוך הבארות של הצלחת 24-באר.</li>
	<li>הגדר קבוצת בקרה מאותה קבוצה של עוברים והוסף את הכמות המתאימה של דילול.</li>
	<li>לייבל 24-לוחות עם שם וריכוז של המתחם ולשמור את הצלחות ב 28.5 ° c בחממה.</li>
</ol>4. אנליזה פנוטימית והדמיה של העוברים באמצעות Stereomicroscope
<ol><li>בחנו את העוברים תחת stereomicroscope לפרמטרים 24 שעות לאחר החשיפה לתרכובות הכימיות.<ol>
<li>שימו לב לפרמטרים כגון תמותה, בקיעה, פעימות לב, ניצול שק החלמון, פיתוח שלפוחית השתן, תנועת הדג, בצקת בקרום הלב וצורת הגוף23.</li>
		<li>קח את הזחלים חשופים לכל ריכוז של המתחם ולהניח אותם הצידה בצלחת פטרי קטנה המכילה 3% מטאלי מולקולרי גבוהה מתיל תאית באמצעות לווין מתכת. הערה: 3% מתיל תאית (מולקולרי גבוה עם) הוא נוזל צמיגי הדרוש להטבעת הדג בכיוון הנדרש לבדיקה מיקרוסקופית. להגיית הדגים בנוזל זה יש צורך בגשוש מתכת.</li>
		<li>קח את התמונות באמצעות stereomicroscope מחובר למצלמה. שמור את התמונות בתיקייה נפרדת כל יום עד סוף הניסוי.</li>
		<li>הזן את כל התצפיות בטבלה בכל יום או בטבלה מקוונת או בגיליון מודפס.</li>
		<li>אם תרכובות נוירוטוקסינות, 4 עד 5 הזחלים dpf עשוי להראות דפוס שונה לשחות, לעשות שיא של שינויים כאלה או על ידי לכידת קצר (30 s עד 1 דקות) וידאו של הזחלים המציגות דפוס תנועה נורמלית.</li>
		<li>לאחר 5 ימים של חשיפה לתרכובות הכימיות, שים לב לריכוז שבו מחצית העוברים מתים לחישוב הריכוז המקסימלי הקטלני 50 (LC50) של כל כימיקל. הערה: LC50 הוא הריכוז שבו 50% מהעוברים מתים בסוף 5 ימים של חשיפה לתרכובת כימית. השתמש לפחות 20 עוברים לבדיקת רעילות של כל ריכוז של מתחם23.</li>
		<li>בניית עיקול לתמותה של עוברים עבור כל הריכוזים באמצעות תוכנית מתאימה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marketing+authorization+applications+submitted+to+the+European+Medicines+Agency+by+small+and+medium-sized+enterprises%3A+an+analysis+of+major+objections+and+their+impact+on+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes.</a> Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).</li>
<li>Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarg%2C+RC+%22Reproductive+and+Developmental+Toxicology%22">Reproductive and Developmental Toxicology</a>. Gupta, R. C. , Elsevier. Boston, MA, USA. 89-109 (2011).</li>
<li>Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+models+in+developmental+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Systems+Biology+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alternative models in developmental toxicology.</a> Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).</li>
<li>Gao, G., Chen, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-cancer+drug+discovery%3A+update+and+comparisons+in+yeast%2C+Drosophila%2C+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish.</a> Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).</li>
<li>Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+test+chemicals+for+the+ECVAM+international+validation+study+on+in+vitro+embryotoxicity+tests.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).</li>
<li>Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+screening+assay+to+identify+teratogenic+and+embryotoxic+chemicals+using+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo.</a> Reproductive Toxicology. 28 (3), Elmsford, N.Y. 308-320 (2009).</li>
<li>Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+zebrafish+embryo+teratogenicity+assay+and+quantitative+prediction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+B+Developmental+and+Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model.</a> Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).</li>
<li>Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+embryotoxicity+of+two+classes+of+chemicals+in+a+modified+zebrafish+embryotoxicity+test+and+comparison+with+their+in+vivo+potencies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies.</a> Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).</li>
<li>Lessman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29%3A+a+vertebrate+model+for+high-throughput+screening+of+chemical+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research.+Part+C%2C+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).</li>
<li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li>
<li>Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+embryotoxicity+using+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model.</a> Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).</li>
<li>Rodrigues, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+synthesis%2C+and+evaluation+of+hydroxamic+acid+derivatives+as+promising+agents+for+the+management+of+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).</li>
<li>Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+in+drug+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model in drug safety assessment.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).</li>
<li>Stainier, D. Y., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+system+to+study+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model system to study cardiovascular development.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).</li>
<li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroimidazole-based+inhibitors+DTP338+and+DTP348+are+safe+for+zebrafish+embryos+and+efficiently+inhibit+the+activity+of+human+CA+IX+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).</li>
<li>Rami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-targeting+carbonic+anhydrase+IX+inhibitors+by+a+new+series+of+nitroimidazole-sulfonamides%2Fsulfamides%2Fsulfamates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).</li>
<li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research--advantages+and+current+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations.</a> Toxicologic Pathology. , Suppl 31. 62-87 (2003).</li>
<li>Teraoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cytochrome+P450+1A+is+required+for+circulation+failure+and+edema+by+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).</li>
<li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li>
<li>Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+an+emerging+model+system+for+human+disease+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).</li>
<li>Gourmelon, A., Delrue, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+in+Support+of+Internationally+Harmonised+OECD+Test+Guidelines+for+Assessing+the+Safety+of+Chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).</li>
<li>Aspatwar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-CA-specific+inhibitor+dithiocarbamate+Fc14-584B%3A+a+novel+antimycobacterial+agent+with+potential+to+treat+drug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).</li>
<li>Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorinated+benzenesulfonamide+anticancer+inhibitors+of+carbonic+anhydrase+IX+exhibit+lower+toxic+effects+on+zebrafish+embryonic+development+than+ethoxzolamide%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide.</a> Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+genes+controlling+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Fishing for genes controlling development.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).</li>
<li>Bambino, K., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+Toxicology+and+Environmental+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in Toxicology and Environmental Health.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).</li>
<li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+pharmacological+tool%3A+the+how%2C+why+and+when%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).</li>
</ol>

המחברים לא דיווחו על ניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

במבחן רעילות מחוץ לבית באמצעות תאים מתורבתים יכול לזהות הישרדות מחקרים מורפולוגיים של התאים מתן מידע מוגבל על רעילות הנגרמת על ידי מתחם הבדיקה. היתרון של הקרנת רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי דג זברה הוא גילוי מהיר של שינויים המושרה בכימיקלים פנוטיפקס בעלי חיים שלמים במהלך התפתחות עובריים באורגניזם מודל רלוונטי. כ 70% של חלבונים-קידוד הגנים האנושיים יש אורתולוגים עמיתיהם הגנום דג זברה25. מסלולים גנטיים שליטה התמרה האות ופיתוח הם שנשמרים במידה רבה בין בני אדם ו-דג זברה<sup class="xr...

פיתוח הסמים הוא תהליך יקר. לפני מתחם כימי יחיד אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) והסוכנות האירופית תרופות (EMA) כמה אלפי תרכובות מוקרנים בעלות של מעל 1,000,000,000 דולר1. במהלך הפיתוח הקדם-קליני, החלק הגדול ביותר של עלות זו נדרש עבור בדיקת החיות2. כדי להגביל את העלויות, חוקרים בתחום פיתוח התרופה זקוקים למודלים חלופיים להקרנה בטיחות של תרכובות כימיות3. לכן, בשלב המוקדם של התפתחות התרופה, זה יהיה מאוד מועיל להשתמש בשיטה שיכולה להעריך במהירות את הבטיחות והרעילות של תרכובות במודל מתאים. ישנם מספר פרוטוקולים ששימשו להקרנה רעילות של תרכובות כימיות מעורבים בעלי חיים ומודלים של תרבות התא, אבל אין פרוטוקול אחד כי הוא מאומת והוא בשימוש משותף4,5. פרוטוקולים קיימים באמצעות דג זברה להשתנות באורך ושימשו על ידי חוקרים בודדים אשר העריכו את רעילות לפי דרישת הנוחות שלהם6,7,8,9, מיכל עשור , מיכל בן 11 , . שתיים עשרה
בעבר האחרון, דג דג זברה התפתחה כמודל נוח להערכת רעילות של תרכובות כימיות במהלך התפתחות עובריים6,7. לדג יש יתרונות רבים ומובנים להערכת תרכובות כימיות13. אפילו ניסויים בקנה מידה גדול הם קלה, כמו נקבה דג זברה יכול להטיל אצוות של 200-300 ביצים, אשר לפתח במהירות ex vivo, לא צריך האכלה חיצונית עד שבוע והם שקופים. את התרכובות ניתן להוסיף ישירות לתוך המים, שם הם יכולים (בהתאם לאופי המתחם) לפזר דרך chorion, ואחרי הבקיעה, דרך העור, זימים והפה של הזחלים. הניסויים אינם דורשים כמויות שפע של תרכובות כימיות14 בשל הגודל הקטן של העובר. פיתוח העוברים ומבטאים את רוב החלבונים הדרושים כדי להשיג את התוצאה ההתפתחותית נורמלית. לכן, עובר דג הוא מודל רגיש כדי להעריך אם תרופה פוטנציאלית יכול להפריע לתפקוד של חלבון או מולקולה איתות כי הוא משמעותי בפיתוח. האיברים של דג דג זברה להיות פונקציונלי בין 2-5 dpf15, ותרכובות רעילים במהלך תקופה זו רגיש של ההתפתחות העובריים לגרום למומים פנוטילים בזחלים דג זברה. שינויים אלה גמישות פנוטיפית ניתן לזהות בקלות באמצעות מיקרוסקופ פשוט ללא טכניקות פולשני11. עוברי הדגים משמשים רבות במחקר רעילות בגלל המורכבות הביולוגית הרבה יותר שלהם בהשוואה לסינון סמים מחוץ לתחום באמצעות מודלים של תרבות התאים16,17.  כמו בעלי חוליות, האיפור הגנטי הפיזיולוגי של דג דג זברה הוא דומה לבני אדם ולכן רעלים של תרכובות כימיות דומים בין דג זברה ובני אדם8,18,19, מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , 22. zebrafish הוא, לפיכך, כלי חשוב בשלב מוקדם של גילוי סמים להערכת רעילות ובטיחות של תרכובות כימיות.
במאמר הנוכחי, אנו מספקים תיאור מפורט של השיטה המשמשת להערכת הבטיחות והרעילות של תרכובות המעכב (CA) מעכב פחמניים באמצעות 1-5 היום הפריה הפוסט (dpf) דג זברה העוברים על ידי חוקר יחיד. הפרוטוקול כולל חשיפת עוברי דגים בריכוזים שונים של תרכובות מעכבי כימיים ללמוד את התמותה ואת השינויים פנוטיפקס במהלך ההתפתחות העוברית. בסוף החשיפה לתרכובות כימיות, מינון LC50 של הכימיקל נקבע. השיטה מאפשרת לאדם לבצע הקרנה יעילה של 1-5 תרכובות בדיקה ולוקח כ 8-10 h בהתאם לניסיון של האדם עם השיטה (איור 1). כל אחד מהצעדים הנדרשים להערכת רעילות התרכובות מתואר באיור 2. הערכת רעילות של מעכבי CA דורש 8 ימים, כולל הגדרת זוגות ההזדווגות (יום 1); איסוף העוברים ממיכלי הרבייה, ניקוי והעברתו לאינקובטור 28.5 ° c (יום 2); התפלגות העוברים לבארות של הצלחת 24-באר ותוספת של תרכובות המעכב מדולל CA (יום 3); הניתוח פנוטימית והדמיה של הזחלים (יום 4-8), וקביעת מינון LC50 (day8).  שיטה זו מהירה ויעילה, מחייבת כמות קטנה של תרכובת כימית ורק מתקנים בסיסיים של המעבדה.

<table><tbody><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>Nunc</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Balance (סולם שקילה)</td> <td>KERN</td><td>PLJ3000-2CM</td><td></td></tr><tr><td>איזון (סולם שקילה)</td> <td>Mettler Toledo</td><td>AB104-S/PH</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>JT. Baker</td><td>RS421910024</td><td></td></tr><tr><td>Disecting Probe</td><td>Thermo Scientific</td><td>17-467-604&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>סיגמא אולדריץ', גרמניה</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות בז 15 מ"ל</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>מתיל צלולוז במשקל מולקולרי גבוה</td><td>סיגמא אולדריץ', גרמניה</td><td>M0262&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>חממה לזחלי דג זברה</td><td>Termaks</td><td>B8000</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Merck</td><td>1.04936.0500</td><td></td></tr><tr><td>מתיל כחול</td><td>סיגמא אולדריץ', גרמניה</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>סיגמא אולדריץ', גרמניה</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Starlab</td><td>S1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR כימיקלים</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>פרפין Histoplast IM</td><td>Thermo Scientific</td><td>8331</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה פסטר&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>Thermo Scientific</td><td>101R20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>לוחות פטרי</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה (1 מ"ל ו-200 &mu; L)</td> <td>תרמו סיינטיפיק</td><td>4641230N, 4641210N&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>תרמו מדעי</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>סטריומיקרוסקופ/מצלמה</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C/Axiocam בקבוקונים צבעוניים 105 (</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל)</td><td>Fisherbrand</td><td>11569914</td><td></td></tr><tr><td>זני Zebrafish AB ZIRC</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp; ZL1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים zebrafish

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

הדג הוא אורגניזם בשימוש נרחב בעלי חוליות מודל עבור המחלה והפניטיפ מבוססי גילוי סמים. הדגים מייצרים צאצאים רבים, יש עוברים שקופים ופיתוח חיצוני מהיר. עוברי הדגים מסוגלים, לפיכך, לשמש גם להערכה מהירה של רעילות של תרופות יקרות וזמינות בכמויות קטנות. במאמר הנוכחי, שיטה להקרנה יעילה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות העוברים הפריה יום 1-5 לאחר הימים מתואר. העוברים מנוטרים על ידי הstereomicroscope כדי לחקור את הפגמים פנוטיפקס הנגרמים על ידי החשיפה לריכוזים שונים של תרכובות. ריכוזים קטלניים חצי מקסימלית (LC50) של תרכובות נקבעות גם. המחקר הנוכחי נדרש 3-6 מ"ג של תרכובת מעכב, ואת הניסוי כולו לוקח כ 8-10 h להסתיים על ידי אדם במעבדה שיש מתקנים בסיסיים. הפרוטוקול הנוכחי מתאים לבדיקת כל תרכובת לזיהוי השפעות רעילות בלתי נסבלת או מחוץ למטרה של התרכובת בשלב המוקדם של גילוי הסמים ולגילוי אפקטים רעילים עדינים שעלולים להחמיץ בתרבות התאית או בדגמי בעלי חיים אחרים. השיטה מפחיתה עיכובים פרוצדורליים ועלויות של פיתוח סמים.

החלק הקריטי של הערכת רעילות הוא בדיקת ריכוזים שונים של תרכובות כימיות אחד או מספר בניסוי אחד. בתחילת, בחר את תרכובות להערכת רעילות, מספר ריכוזי לבדוק כל תרכובת, ובהתאם, לעשות תרשים (איור 3). השתמשנו בצבע ייחודי לכל תרכובת כדי לארגן את הדגימות (איור 3). השימוש סמן עמידים ממס ותיוג בתחתית או בצדדים של לוחיות חשוב כדי למנוע בלבול מאוחר יותר.  אם תרכובות לגרום לפגמים פנוטיתים של הזחלים חשופים ריכוזים שונים של מעכבי, פגמים נרשמים כל 2...

עוברי דג משמשים להערכת הרעילות של תרכובות כימיות. הם מפתחים מבחוץ ורגישים לכימיקלים, ומאפשרים זיהוי של שינויי פנופאיות עדינים. הניסוי דורש רק כמות קטנה של תרכובת, אשר מתווסף ישירות לצלחת המכילה עוברים, מה שהופך את מערכת הבדיקה יעילה וחסכונית.

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

הליכי בדיקת הרעילות יוכחו על ידי ד"ר אשוק אפטרוואר, חוקר בכיר מהמעבדה שלי. הפרוטוקול שלנו מזהה השפעות מחוץ ליעד ומזהה השפעות רעילות עדינות של כימיקלים בשלב מוקדם של הגילוי שעלולים להחמיץ בתרבות התאים או במודלים אחרים של בעלי חיים. היתרונות העיקריים של הטכניקה שלנו הם: היא מהירה ויעילה, דורשת כמות קטנה מאוד של כימיקלים, ואת המתקנים הבסיסיים במעבדה.בדיקת רעילות תעזור לנו להחליט על הריכוז לחקר יעילותו נגד מיקובקטריום שגורם לשחפת ולחישוב פרה-קליני נוסף. שיטה זו משתמשת בתובנות על השפעות מחוץ ליעד של כימיקלים, ולכן שיטה זו יכולה לשמש בכל תחום של מחקר שבו הרעילות של כימיקלים היא בעלת חשיבות עליונה. שיטה זו היא פשוטה מאוד והוא יכול להתבצע על ידי כל אחד ללא ניסיון קודם.אנשים ללא ניסיון צריכים לתכנן את הניסוי בזהירות ולהשתמש רק במתחם אחד. שיטה זו מספקת השפעות רעילות של הכימיקלים בצורה של שינויים פנוטיפיים בעוברים המתפתחים של דגי הזברה ומכאן הבטיחות של התרכובות שנבדקו. כדי להתחיל, למקם שניים עד חמישה זכרים בוגרים זברה-דג ושלוש עד חמש נקבות בוגרות זברה לתוך מיכלי הזדווגות לילה.בבוקר, להדליק את האור כמו הרבייה נגרמת על ידי מחזור האור החשוך האוטומטי הבא. כדי להימנע מטיפול בלחץ לבעלי החיים, אפשר לבעלי החיים לנוח במשך שבועיים לפני השימוש באותם אנשים לרבייה. למחרת בצהריים, לאסוף את העוברים באמצעות

rapid-evaluation-toxicity-chemical-compounds-using-zebrafish

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

במאמר זה, עוברים של דגי זברה משמשים לבדיקת רעילות כימית. רעילות כימית מתואמת עם קריאות פנוטיפ. פרוטוקול הדגימה מציג גישה מתודולוגית לביצוע בדיקת רעילות כימית.

מסך רעילות כימית מבוסס עוברים: הערכת השפעות על התפתחות עוברים של דגי זברה

דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

חשיפת teratogens עלולה לגרום למומים מולדים. דג זברה היא שימושי לקביעת פוטנציאל טרטוגניות של כימיקלים. אנו להדגים את התועלת של דג זברה על ידי חשיפה עוברת לרמות שונות של ניטריט וגם בזמנים שונים של חשיפה. אנו מראים כי ניטריט יכול להיות רעיל ולגרום ליקויים התפתחותיים חמורים.

דג הזברה כמודל להעריך את הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט

דג הזברה נוצל לאחרונה כמודל לאימות משנים פוטנציאליים של קרינה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים המפורטים לשימוש בעוברים של דגי זברה לניסויי סינון מבוססי קרינה וכמה גישות תצפיתיות להערכת ההשפעה של טיפולים וקרינה שונים.

זחלי דגי זברה כמודל להערכת רדיוסנסיטיזרים או מגינים פוטנציאליים

אנו מתארים את זרימת העבודה וניתוח הנתונים של מערכת סינון להערכת רעילות של תרכובות כימיות בהתבסס על תגובת הבהלה של רטט עובר דג הזברה. המערכת מתעדת את תנועותיהם של עוברי דגי זברה בחשיפה לגירוי רטט ומאפשרת הערכה משולבת של רעילות/קטלניות כללית ורעילות עצבית-שרירית.

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה

פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.

בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם

אנו מציגים גישה חדשנית לכמת לוקליזציה nanoparticle ב vasculature של גידולים xenografted אנושי באמצעות דינמי, בזמן אמת הדמיה intravital במודל העובר העופות.

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

Twin-to-התאום תסמונת עירוי ורצף התאום polycythemia אנמיה שתי בעיות הרסניות ברפואה הלידה. הפרעות שני להתרחש רק תאומים monochorionic והתוצאה מזרימת דם לא מאוזן anastomoses דרך כלי הדם בשליה. אנו מספקים פרוטוקול פשוט להעריך נכונה את הימצאותם של כלי הדם באמצעות הזרקת anastomoses לצבוע בצבע של כלי השליה לאחר הלידה.

הערכה מדויקת ופשוטה Anastomoses כלי הדם בשליה Monochorionic באמצעות דיי צבעוני

דג הזברה מהווה מודל חשוב ללמוד את מנגנוני התחדשות לב אצל בעלי חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אינדוקציה של אוטם לב דג הזברה למבוגרים באמצעות cryoinjury. שיטה זו גורמת מוות של תאים מסיבית של 20% קיר החדר, בדומה לזו שנצפתה אוטמים יונקים.

אינדוקציה של אוטם שריר הלב ב דג הזברה למבוגרים באמצעות Cryoinjury

שיטת ספירת CD4, α-הבדיקה, מתואר אשר עושה שימוש הרוק כולו לספק מהיר ומדויק ספירת CD4. את α-הבדיקה עולה פרוטות ומונע את הצורך טכניים, חומרים כימיים אימונים יקרים כגון נוגדנים חד שבטיים, מכשור, קירור, הובלה של דגימות, וכן איסוף וטיפול של דם.

Α-מבחן: ראפיד נייד ללא ספירת CD4 באמצעות הרוק שלם

למדו שיטה מהירה להערכת רעילות תרכובות כימיות בעוברי דגי זברה. הפרוטוקול מאפשר זיהוי השפעות לוואי ושינויים פנוטיפיים עדינים במעבדה בסיסית.

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

גלה סרטונים נוספים