הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

הליכי בדיקת הרעילות יוכחו על ידי ד"ר אשוק אפטרוואר, חוקר בכיר מהמעבדה שלי. הפרוטוקול שלנו מזהה השפעות מחוץ ליעד ומזהה השפעות רעילות עדינות של כימיקלים בשלב מוקדם של הגילוי שעלולים להחמיץ בתרבות התאים או במודלים אחרים של בעלי חיים. היתרונות העיקריים של הטכניקה שלנו הם: היא מהירה ויעילה, דורשת כמות קטנה מאוד של כימיקלים, ואת המתקנים הבסיסיים במעבדה.

בדיקת רעילות תעזור לנו להחליט על הריכוז לחקר יעילותו נגד מיקובקטריום שגורם לשחפת ולחישוב פרה-קליני נוסף. שיטה זו משתמשת בתובנות על השפעות מחוץ ליעד של כימיקלים, ולכן שיטה זו יכולה לשמש בכל תחום של מחקר שבו הרעילות של כימיקלים היא בעלת חשיבות עליונה. שיטה זו היא פשוטה מאוד והוא יכול להתבצע על ידי כל אחד ללא ניסיון קודם.

אנשים ללא ניסיון צריכים לתכנן את הניסוי בזהירות ולהשתמש רק במתחם אחד. שיטה זו מספקת השפעות רעילות של הכימיקלים בצורה של שינויים פנוטיפיים בעוברים המתפתחים של דגי הזברה ומכאן הבטיחות של התרכובות שנבדקו. כדי להתחיל, למקם שניים עד חמישה זכרים בוגרים זברה-דג ושלוש עד חמש נקבות בוגרות זברה לתוך מיכלי הזדווגות לילה.

בבוקר, להדליק את האור כמו הרבייה נגרמת על ידי מחזור האור החשוך האוטומטי הבא. כדי להימנע מטיפול בלחץ לבעלי החיים, אפשר לבעלי החיים לנוח במשך שבועיים לפני השימוש באותם אנשים לרבייה. למחרת בצהריים, לאסוף את העוברים באמצעות מסננת רשת בסדר, ולהעביר אותם על צלחת פטרי המכילה בינוני עובר E3.

מניחים את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לבחון כל קבוצה של עוברים. לזהות את המראה אטום ולהסיר אותם כמו עוברים מופרים או מתים. שמור את העוברים ב 28.5 מעלות צלזיוס באינקובטור לילה.

למחרת בבוקר, לבדוק את העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאו ולהסיר כל עוברים לא בריאים או מתים. בזהירות להשתמש פיפטה פסטר להעביר עובר אחד לתוך כל באר של צלחת 24 גם. ודא שכל באר מכילה מספיק מדיום E3 כדי לכסות את העוברים.

מוציאים את הבקבוקונים המכילים תרכובות מעכבות המאוחסנות ב 4 מעלות צלזיוס במקרר. השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול את הכמות המתאימה של המתחם, ולהכין 250 microliters של 100 מילימולר פתרון מלאי עבור כל תרכובת במדיום E3 או ממס מתאים אחר. לאחר מכן, השתמש במדיום E3 כדי לבצע דילול סדרתי של פתרונות המלאי בהתבסס על רמות רעילות בצינורות צנטריפוגה 15 מיליליטר.

מן בארות כי כל אחד מכיל עובר DPF אחד, להשתמש פיפטה פסטר פיפט 1 מיליליטר פיפט כדי להסיר את המים E3 שורה אחת בכל פעם. מיד להפיץ 1 מיליליטר של כל diluent של פתרונות המניות לתוך בארות של 24 צלחת גם החל מלוטה ועובר ריכוז גבוה יותר. עבור קבוצות הבקרה, הוסף מים E3 או ממס רלוונטי אחר.

תווית 24 צלחות גם עם השם והריכוז של המתחם ולשמור את הצלחות ב 28.5 מעלות צלזיוס באינקובטור. יש לדאוג כי מדללים של הכימיקלים בארות לא התאדה באינקובטור על ידי איטום הצדדים של 24 צלחת היטב. עשרים וארבע שעות לאחר החשיפה של תרכובות כימיות, להשתמש פיפטה פסטר להעביר את הזחלים חשופים לכל ריכוז של המתחם בצלחת פטרי קטנה המכילה 3% משקל מולקולרי גבוה מתיל תאית.

עם גשוש מתכת, תניח אותו הצידה. מניחים את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ סטריאו המחובר למצלמה. לצלם את התמונות ולשמור את התמונות בתיקיה נפרדת בכל יום עד סוף הניסוי.

הזן את כל התצפיות בטבלה בכל יום בטבלה מקוונת או בגיליון מודפס. עבור חשיפה לתרכובת נוירוטוקסית, ארבעת עד חמישה זחלי DPF עשויים להראות דפוס שחייה לא תקין. במקרה זה, לעשות תיעוד של שינויים כאלה על ידי לכידת קצר 30 שניות לדקה אחת וידאו של הזחלים.

לאחר חמישה ימים של חשיפה לתרכובות הכימיות, שימו לב לריכוז שבו מחצית מהעוברים מתים כריכוז הקטלני החצי מקסימלי של 50 מכל כימיקל. לבנות עקומה לתמותה של עוברים עבור כל הריכוזים באמצעות תוכנית מתאימה. בפרוטוקול זה, החלק הקריטי של הערכת הרעילות הוא בדיקת ריכוזים שונים של תרכובת כימית אחת או יותר בניסוי אחד.

עבור תרכובות לגרום כל פגמים פנוטיפיים בזחלים, הפגמים נרשמו כל 24 שעות על פני תקופה של יום עד חמישה ימים לאחר החשיפה לכימיקל. העוברים שטופלו במעכבי בטא CA בריכוזים של 250 מיקרומולרים ו-125 מיקרומולרים מציגים פגמים פנוטיפיים שונים בהשוואה לבקרה. לדוגמה, עוברים שלא נהדפו אפילו ביום 3, מבנה גוף מעוקל, שם חלמון לא מרוסן ובצקת פריקארדיאלית, והיעדר פתיתי אוטולית בזחלים בחמישה ימים לאחר הטיפול.

במחקר אחר, העוברים שטופלו במעכבי CA הראו היעדר שקי אוטולית ושלפוחית השתן. הניסויים זיהו תרכובת ייצוגית פחמתית anhydrase 9, אשר גרמה לשינויים פנוטיפיים מינימליים או לא במהלך ההתפתחות העוברית ב 500 micromolar. המתחם הראה ריכוז LC50 גבוה.

עם זאת, בהשוואה לשליטה, אותה תרכובת ב 300 micromolar נמצאה להיות נוירוטוקסית ומושרה אטקסיה בזחלים לאחר חמישה ימים של חשיפה. איכות טובה של עוברים חשובים להקרנת רעילות של כימיקלים. להשגת עוברים באיכות טובה, השתמשו בזוג צעיר של דגי זברה בוגרים לרבייה.

התרכובות המתגלות כבטוחות יכולות להיות מאופיינות עוד יותר על ידי ביצוע ניסויים רלוונטיים במבחנה ובוויו. בתחום פיתוח תרופות אנטי-טוברקולוזיס, טכניקה זו סייעה להקים ניסויים נוספים עבור עיכוב in vivo של marinum mycobacterium בעוברים זברה. הפרוטוקול כרוך בשימוש בכימיקלים שעשויים להיות רעילים לבני אדם.

אנשים המעורבים בניסויים צריכים לנקוט בזהירות נאותה בעת הטיפול בכימיקלים.