Name: שימוש בפני הפנים הללו Immunofluorescence כתמים כדי להתבונן בתאי כלי דם אנדותל ישירות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: למד שיטת צביעת immunofluorescence לצפייה ישירה בתאי אנדותל של עורקי עכברים. הטכניקה מאפשרת ניתוח פנוטיפ תאי ומולקולרי בתנאי לחץ גזירה שונים, ומסייעת בחקר מנגנוני התפתחות טרשת עורקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה נתמך על ידי הקרן הלאומית המדע הטבעי של סין (גרנט No. 81670451, 81770430), התוכנית העולה סטאר של שנגחאי (גרנט 171403000), והוועדה לטכנולוגיה מדע של הממשלה העירונית של שנגחאי (גרנט לא. 14441903002, 15411963700).

כל ניסויי החיות נערכו בהתאם לפרוטוקולים הניסיוניים שאושרו על-ידי הוועדה למשאבי בעלי חיים של אוניברסיטת ג'יאו טונג שאנגחאי.
1. perfusion של העורקים של העכבר
<ol><li>בקצרה, להפחית 12-שבוע בן C57BL/6 עכברים עם זריקות תוך הצפק של נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג משקל גוף). אשר בעדינות את הזנב מההרדמה. הערה: אם לא נצפתה תנועה, החיה מורדם במידה מספקת כדי להתחיל בניסויים.</li>
	<li>להקליט את כפות העכבר לערימת מגבות נייר עם קלטות דבק.</li>
	<li>להחזיק את העור של העכבר עם מלקחיים ולחתוך את העור עם זוג מספריים מהבטן אל החלק העליון של בית החזה.</li>
	<li>פתח את חלל הבטן מתחת לצלעות עם זוג מספריים חדים.</li>
	<li>הרם את עצם החזה עם מלקחיים וחתוך את הסרעפת; אז, לחתוך את הצלעות כדי לחשוף את חלל החזה.</li>
	<li>, תחתוך את הוריד-כרוב מעל הכבד. עם מספריים</li>
	<li>מבשם הלחץ (100 mmHg) עץ העורקים עבור 5 דקות עם מלוחים רגיל מקורר המכיל 40 יחידות/mL הפרין דרך החדר השמאלי עד הריאות והכבד להיות חיוור. לאחר מכן, מבשם עם מקורר 4% פאראפורמלדהיד ב פוספט מאגור מלוחים (PBS, pH 7.4) עבור 3 דקות.</li>
	<li>הסירו את כל השרירים, האיברים. והשומן עד שהעורקים ייחשפו</li>
	<li>הניחו את העכבר תחת מיקרוסקופ מבתר.</li>
</ol>2. חיתוך ופתיחה longitudinally של העורקים
<ol><li>לחשוף את העורקים בבירור תחת מיקרוסקופ מבתר ולהסיר את רקמות החיבור לאורך העורקים נקי ככל האפשר, עם מלקחיים עדינים זוג מספריים עדינים (איור 1).</li>
	<li>לנתח את העורקים הבית החזה מהלב אל הגזע הקלבאני עם זוג מספריים עדינים ולשים את העורקים לתוך הצלחת התרבות 6 ס מ תאים עם PBS. לחתוך לפתוח את העורקים longitudinally, לאורך העקומה הפחותה, ולאורך העקומה יותר עד מקטע ישר מתקיים. לחתוך לפתוח את שלושת הענפים של קשת אבי העורקים, כולל המנות, שמאל העורק המשותף והעורק השמאלי של ריחי עם מיקרו מספריים, כפי שמוצג באיור 2.</li>
</ol>3. טיפול מקדים וכתמים של העורקים
<ol><li>לחדור את העורקים עם 0.1% polyoxyethylene האתר של החברה ב PBS עבור 10 דקות ולחסום אותו עם 10% סרום עז רגיל מלוחים באגירה טריס (TBS) המכיל 2.5% polysorbate 20 עבור 1 h בטמפרטורת החדר בלוח 12-היטב תרבות התא.</li>
	<li>בשלב הבא, מודדת את העורקים עם 5 ג ' והארנב נגד ומטה-VCAM-1 ו-5 העכברוש g/mL anti-VE-cadherin רין במאגר חסימת, לילה ב 4 ° c.</li>
	<li>לאחר שטיפה לדוגמה 3x עם פתרון כביסה (TBS המכיל 2.5% polysorbate 20), להחיל את הנוגדנים בעלי מסגרת פלואורסצנטית משני (1:1000 דילול, אלקסה Fluor 555-התווית אנטי ארנבת IgG ו אלקסה Fluor 488-מתויג אנטי עכברוש IgG) עבור 1 h בחדר טמפרטורה. לשטוף את 3x בפתרון כביסה.</li>
	<li>להכתים את אבי העורקים עם 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) (1 μg/mL) עבור 10 דקות ולשטוף אותו 3x בפתרון כביסה.</li>
</ol>4. הרכבה של העורקים על מגלשת הזכוכית
<ol><li>מניחים את העורקים על שמיכות עם משטח הלומיאל כלפי מטה ולהעביר אותו לאט לפתרון ההרכבה אנטי לדעוך בעבר ירד על הכיסויים. מתחו בעדינות את העורקים. כדי לשמור על הדגימה שטוחה</li>
	<li>, הפוך את הסרבל. והניח אותו על הזכוכית הטיפול חייב להילקח כדי לא לאפשר בועות אוויר להישאר בין הדגימה לבין הזכוכית.</li>
</ol>5. תצפית על העורקים
<ol><li>בדקו את העורקים עם מיקרוסקופ. ממוקד לסריקת לייזר</li>
	<li>לנתח עוצמות צבע של ערוצים שונים מהאזור הרצוי בתמונות הפנים en עם תוכנת תמונה-Pro Plus.</li>
</ol>

<ol><li>Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li>
<li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li>
<li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li>
<li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+production+of+%26%2334%3Ben+face%26%2334%3B+preparations+one+cell+in+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A method for the production of &#34;en face&#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li>
<li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li>
<li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000(2013).</li>
<li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346(2014).</li>
<li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12%2F15-Lipoxygenase+mediates+high-fat+diet-induced+endothelial+tight+junction+disruption+and+monocyte+transmigration%3A+a+new+role+for+15%28S%29-hydroxyeicosatetraenoic+acid+in+endothelial+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).</li>
<li>Liu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q%2FTNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li>
<li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li>
<li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+the+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li>
<li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+CRP%2C+Atherogenic+LDL%2C+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li>
<li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

האנדותל חשוף לגורמים רבים, הכוללים שומנים, מגשרים דלקתיים ונוזלים מדגישים1,11,12. התבוננות ישירה בתאי האנדותל באתרו מספקת את היתרונות המיוחדים לניתוח שינויים במבנה התאים, הצמתים הבינתאיים ודפוסי ביטוי המולקולה בתגובה לגירוי הפציעה.
מחקרים קודמים סיפקו שני שונים בפנים שונות אימונוהיסטוכימיים טכניקות כדי לבחון את האנדותל של קיר העורקים4,5. האחת ...

השינויים המוקדמים בכלי הקיבול מפעילים בעיקר את האנדותל, המתפקד כמכשול סלקטיבי בין הדם לקיר הכלי עם הjunctional מתחמים1. ראיות משמעותיות מצביעות על תפקיד קריטי עבור ההשפעות המכאניות של זרימת הדם בפונקציה אנדותל מודולאל2. נוזל הטיית מתח, כוח מתפורר שנוצר על ידי זרימת הדם, צורות דיפרנציאלי של תא מורפולוגיה ותפקוד, בהתאם לתבניות הזרימה הספציפיות באתרי כלי דם שונים2,3. נגעים טרשת עורקים המועדפת מתרחשים באתרים של זרימת דם מופרעת (d-זרימה), כגון כלי עקמומיות, מפרידי זרימה, נקודות הסתעפות, לעומת אזורים של זרימה יציבה (s-flow), כגון קטע ישר של העורק. לפיכך, התבוננות ישירה בדפוסי הביטוי ובביטויים של המולקולה צריכה לספק תובנות חשובות לפנוטיפים הקונסטרוקטיבי והפונקציונליים של תאי האנדותל באמצעות תבניות זרימה משתנות.
תאים אנדותל מתורבת לא יכול לבטא את הפנוטיפים בפועל כפי שהם עושים ב vivo בחלקו עקב אובדן ההשפעה של מתח להטות את הנוזלים, ציטוקינים המקיפים, תא תא או אינטראקציות תא מטריצה. כדי לסייע בכך, ניתן לחקור את המונאולייר השלם של תא האנדותל בסעיפים רוחבי באמצעות אימונוהיסטוכימיה קלאסית. עם זאת, מונאולייר האנדותל הוא כה דק ושברירי שבדרך כלל לא ניתן להבחין בו בבהירות. En הפנים אימונוהיסטוכימיה שימש להתבונן במשטח הפנימי של האנדותל אבל הוא מסובך או בלתי יציב בתוצאותיה, כי האנדותל הוא הסיר בקלות מן הרקמה הבסיסית, או רק חלק של קיר העורקים של חולדות או ארנבים, הקירות שלהם עבים, מותקן4,5.
לדגמי עכבר יש יתרונות ניכרים על פני בעלי חיים אחרים במובנים רבים. כאן, אנו מעסיקים שונה en הפנים הטכניקה החיסונית לנתח את תאי האנדותל של קשת אבי העורקים ואת בית האבי החזה ב C57BL/6 העכבר. טכניקה כזאת שימש רבות כדי לחקור את האנדותל הפתופסולוגיה בדפוסי זרימה שונים ובפיתוח של טרשת עורקים6,7,8,9,10. שיטה זו מאפשרת למדענים להתבונן בכל פני השטח של האנדותל באופן ברור ולהשוות את דפוסי הביטוי של חלבון מסוים באזורים מתחת למתחים שונים של הטיה.

<table><tbody><tr><td>תושבת נגד דהייה</td><td>Servicebio</td><td>G1401</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>RWD מדעי החיים</td><td>F11001-11</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>RWD מדעי החיים</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לניתוח</td><td>RWD מדעי החיים</td><td>F12005-10</td><td></td></tr><tr><td>Mciro מספריים קפיציים</td><td>RWD מדעי החיים</td><td>S11001-08</td><td></td></tr><tr><td>פוליאוקסיאתילן אוקטיל פניל אתר (טריטון X-100)</td><td>אמרסקו</td><td>M143</td><td></td></tr><tr><td>פוליסורבט 20 (שלישי 20)</td><td>אמרסקו</td><td>0777</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab134047</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן VE-Cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>555289</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 מסומן נגד ארנב IgG</td><td>invitrogen</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 מסומן אנטי-חולדות IgG</td><td>invitrogen</td><td>A-21208</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר&nbsp;</td><td>קרל זייס</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בפני הפנים הללו immunofluorescence כתמים כדי להתבונן בתאי כלי דם אנדותל ישירות

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

שינויים משתנים בעזרת המבנה האנדותל והורפולוגיה נחשבים לאירועים ראשוניים בפתוגנזה של טרשת עורקים. התבוננות ישירה של האנדותל ללא שינוי תספק מידע רב ערך להבנת האירועים הסלולאריים והמולקולריים בתאי האנדותל הלקוי. כאן, אנו מתארים שונה en הפנים אימונוofor, מכתים הטכניקה המאפשרת למדענים לקבל תמונות ברורות של משטח האנדותל שלמים ולנתח את דפוסי ביטוי המולקולה באתרו. השיטה היא פשוטה ואמינה להתבוננות במערך האנדותל השלמה באתרים שונים של העורקים. טכניקה זו עשויה להיות כלי מבטיח להבנת הפתופסולוגיה של טרשת עורקים, במיוחד בשלב מוקדם.

העכבר בן 12 שבועות C57BL/6 מורדמים ומכיל עם תמיסת מלח רגיל המכיל 40 יחידות/mL הפארין ולאחר מכן, מקורר 4% פאראפורמלדהיד. העורקים של העכבר נחשף תחת מיקרוסקופ מבתר (איור 1), גזור, גזור longitudinally פתוח (איור 2). En הפנים אימונוofor, כתמים של התאים כלי הדם האנדותל בוצעה כמודגם באיור 3 ושולחן 1. En הפנים אימונוoforas של מכשיר דם הדבקה של חלבון -1 (VCAM-1) ביטוי עם VE-קדהרין כמו סמן אנד...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לצביעת התאים. האנדותל של בית העורקים של העכבר ישירות טכניקה זו שימושית כשאתה לומד את הפנוטיפים הסלולאריים והמולקולריים של תאי האנדותל בדפוסי זרימה שונים ובפיתוח טרשת עורקים.

שימוש בפני הפנים הללו Immunofluorescence כתמים כדי להתבונן בתאי כלי דם אנדותל ישירות

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

פרוטוקול זה מסייע לאנשים לנתח מורפולוגיה של תאי אנדותל, ואת הביטוי של מולקולות באזורים, תחת לחץ נוזלי שונה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הערכה ישירה של תאי אנדותל כלי דם תחת לחץ נוזלי שונה. בעת ביצוע הליך זה, צעדים מרכזיים הם להשתמש paraformaldehyde מוכן טרי ולבצע זלבול טוב.התחל הליך זה עם הרדמה של עכבר C57BL/6 בן 12 שבועות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. אשר הרדמה נכונה על ידי צביטה עדין של הזנב. תדביק את כפות העכבר לערימה של מגבות נייר, עם סרט הדבקה.להחזיק את העור של העכבר עם מעצורים, לחתוך את העור עם זוג מספריים מהבטן לראש בית החזה. פתח את חלל הבטן, מתחת לצלעות, עם זוג חד של מספריים. להרים את עצם החזה עם מדפים, לחתוך את הסרעפת.ואז לחתוך את בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה. חותכים את הנבוב ממש מעל הכבד עם מספריים. הלחץ מפזר את עץ העורקים במשך חמש דקות, עם מלוחים רגילים מצוננים מראש המכילים 40 יחידות לכל הפרין מיליליטר, דרך החדר השמאלי, עד שהריאות והכבד הופכים חיוורים.לאחר מכן התבלבלו עם פרפורמלדהיד מקורר מראש של 4% ב-PBS במשך ארבע דקות. הסר את כל השרירים, האיברים והשומן, עד שהתספורת נחשפת. מקם את העכבר תחת מיקרוסקופ לנתח.השתמש מדפים עדינים זוג מספריים עדינים לחשוף את האאורטה בבירור תחת מיקרוסקופ ניתוח, ולהסיר את רקמת החיבור לאורך בית הדם, בצורה נקייה ככל האפשר. ניתחו את בית החזה מהלב לתא המטען הצליאק עם זוג מספריים עדינים. מניחים את בית הישוריים לתוך צלחת תרבות תאים של שישה סנטימטרים, עם PBS.חותכים את אב העורקים לאורך זמן, תחילה לאורך העקומה הפחותה, ולאחר מכן להשתמש microscissors לחתוך לפתוח את שלושת הענפים של קשת העורקים, כולל innominate, העורק התת-תת-חיים השמאלי לאורך העקומה הגדולה יותר עד הקטע הישר הוא נפגש. Permeabilize אבי האוזן עם 1%פוליוקסיאתילן אוקטיל פניל אתר, ב PBS במשך 10 דקות. לאחר מכן חסום את אבי הישבן עם סרום עיזים רגיל של 10% בתמיסת מלח עם חיץ טריס המכיל 2.5% פוליסורבט 20 למשך שעה בטמפרטורת החדר, בצלחת תרבות תאים של 12 בארות.הדגירה הבאה של בית ההארתא במאגר החסימה המכילה חמישה גרם לארנב מיליליטר נגד VCAM1, וחמישה גרם לחולדה מיליליטר נגד VE-Cadherin, לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה מדגם שלוש פעמים עם פתרון כביסה, להחיל את הפלואורסצנטיות נדנוגדנים משניים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, שמירה במקום חשוך. יש לשטוף עוד שלוש פעמים בתס הכביסה.יש לנטרל את בית השחי עם DAPI למשך 10 דקות, תוך שמירה על מקום חשוך. לאחר מכן שטפו את בית הדם המוכתם שלוש פעמים בתספורת הכביסה. מניחים את העורקים על פתק כיסוי עם משטח lumenal כלפי מטה, ולהזיז אותו לאט כדי פתרון הרכבה antifade כי כבר ירד בעבר על החלקת הכיסוי.בעדינות למתוח את בית ההאורת כדי לשמור על הדגימה שטוחה. הפוך את החלקת המכסה והניח אותה על מגלשת הזכוכית. יש לדאוג להימנע בועות אוויר בין הדגימה לבין הזכוכית.בחן את בית ההאורטה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר. נתח את התעצמות הצבעים בערוצים שונים מהאזור הרצוי בתמונות הפנים en, באמצעות תוכנת Image-Pro Plus. En פנים immunofluorescence הכתמת תמונות של תאי אנדותל כלי הדם מאוסעת העכבר מוצגים.En immunofluorescence של חלבון הידבקות בתאי כלי הדם אחד, והבעה עם VE-Cadherin כסמן אנדותל, מוצגים תחת דפוסי זרימה משתנים מאזורים שונים של aorta העכבר. DAPI היה גם נגדי כדי להראות את גרעיני התא עבור הדמיה טובה יותר. כאשר מסתכלים דרך ערימות Z מתחת למיקרוסקופ, תאי השריר אנדותל וחלק ניתן להבדיל בקלות על ידי מורפולוגיה גרעיני התא שלהם.גרעיני התא ה אנדותל הם בצורת אליפסה, וגדול יותר מאשר ציר בצורת, חלקה תא שריר גרעינים. הביטוי של VCAM-1 היה שופע יותר באזורים תחת זרימה מופרעת, עקמומיות פחותה של קשת בית החזה, בהשוואה לאזורים תחת זרימה יציבה, עקמומיות גדולה יותר של קשת בית החזה, ובאב המעצורים בבית החזה. כאן אזורים של עקמומיות פחותה של aorta העכבר מסומנים כמו אזורי d-זרימה, ואת עקמומיות בית החזה גדול יותר.עם השינוי הנכון, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על ניתוח של חדרות כלי הדם, ואת המיקום של macromolecules ב האינטימה התא אנדותל.

using-en-face-immunofluorescence-staining-to-observe-vascular

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדמיה מיקרוסקופית של תאים אנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מאפשר אפיון של שינויים דינמיים מבנים cytoskeletal. שלא כמו טכניקות להשתמש דגימות קבוע, שיטה זו מספקת הערכה מפורטת של השינויים הזמני cytoskeleton אקטין בתאי אותו לפני, במהלך ואחרי גירויים פיזיים, תרופתי, או דלקתיים שונים.

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין

סרטון זה מדגים הדמיה של תאים חיים של טופולוגיית סינפסות אימונולוגיות, וחוקר את יחסי הגומלין בין לימפוציטים מסוג T לבין תאי אפיתל הנושאים אנטיגנים פלואורסצנטיים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה תזוזה של ציטופלסמה אדומה וטבעות קרום צהובות בתאי אנדותל, דבר המצביע על היווצרות סינפסות אימונולוגיות.

הערכת טופולוגיית סינפסה אימונולוגית באמצעות דימות תאים חיים

מקור: Gucciardo, E., et. al., מודל תרבית רקמות ex vivo לסיבוכים פיברווסקולריים ברטינופתיה סוכרתית פרוליפרטיבית. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מפרט פרוטוקול צביעה חיסונית עבור תרביות ex vivo של רקמה פיברווסקולרית המוטמעת בג'ל פיברין. זה מאפשר הדמיה מפורטת של שינויים בכלי הדם הקשורים לרטינופתיה סוכרתית...

צביעה אימונופלואורסצנטית של רקמה פיברווסקולרית חולה שמקורה בחולה משובצת בג'ל

מקור: Alluri, H., et al. מחסור בחמצן-גלוקוז וחמצון מחדש כמודל פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה במבחנה לחקר תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח. J. Vis. Exp. (2015). הסרטון מדגים את הלוקליזציה הפלואורסצנטית של חלבוני צומת הדוקים וסיבי מתח בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח של חולדות (RBMECs). בשכבה החד-שכבתית הלחוצה, נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית משמשים לתיוג חלבוני הצומת ההדוק, בעוד שהפלואידין המתויג בפלואורופור מסמן את סיבי הלחץ. המולקולות המסומנות מומחשות לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

לוקליזציה פלואורסצנטית של חלבוני צומת הדוקים וסיבי עקה בתאי אנדותל

הדוח שלנו מתאר שיטה ייחודית כדי לחזות ולנתח אינטראקציות CTC / EC בסרטן הערמונית בתנאי זרימה פיסיולוגיים.

בשיטה חוץ גופית כדי לבחון אינטראקציות בתיווך-E-selectin בין תאים סרטניים בערמונית מחזור שמקורם בתאי חולים ואנדותל האנושי

כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

חסינות אדפטיבית נשלטת על ידי 'סינפסות אימונולוגיות' דינמיות הנוצרות בין תאי T לתאים המציגים אנטיגן. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקירת תאי אנדותל הן כ-APCs פיזיולוגיים לא נחקרים והן כסוג חדש של 'מודל APC תאי מישורי'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

במאמר זה נתאר שיטה קלה מותאמת יחסית באמצעות צבע פלואורסצנטי diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2da) ו dihydroethidium (DHE) לגילוי סימולטני אן-פאס וויזואליזציה של תחמוצת חנקן תאית (NO) אניון סופראוקסיד (O 2 .- ) בהתאמה, טרי מבודד aortas השלם של מודל עכבר להשמנה.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות אנדותל-pericyte אדם העכבר באמצעות וריאציה של assay אנגיוגנזה תקע ג'ל מטריקס.

In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג&#39;ל עכבר

פרוטוקול זה מתאר את הדמיה intravital של העכברים הטרנסגניים לבטא סמני פלואורסצנט תאים ספציפיים. הדמיה intravital מספק שיטה לא פולשנית ברזולוציה גבוהה תצפיות בבעלי חיים באמצעות windows מושתלת שדרכו החזיית תהליכים מיקרוסקופיים אפשרית. שיטה זו שימושית במיוחד ללמוד תהליכים האורך.

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

נוהל להכנת ההכנות הפנים של העורק הראשי עורקים אבי העורקים מתואר. הכנות כאלה, כאשר מוכתמים immunofluorescently עם נוגדנים ספציפיים, מאפשרים לנו ללמוד לוקליזציה של חלבונים זיהוי של סוגי תאים בתוך הקיר כולו כלי הדם על ידי מיקרוסקופיה confocal.

הכנת פנים של כלי דם עכבר

למד שיטת צביעת immunofluorescence לצפייה ישירה בתאי אנדותל של עורקי עכברים. הטכניקה מאפשרת ניתוח פנוטיפ תאי ומולקולרי בתנאי לחץ גזירה שונים, ומסייעת בחקר מנגנוני התפתחות טרשת עורקים.

שימוש בפני הפנים הללו Immunofluorescence כתמים כדי להתבונן בתאי כלי דם אנדותל ישירות

גלה סרטונים נוספים