שימוש בפני הפנים הללו Immunofluorescence כתמים כדי להתבונן בתאי כלי דם אנדותל ישירות

פרוטוקול זה מסייע לאנשים לנתח מורפולוגיה של תאי אנדותל, ואת הביטוי של מולקולות באזורים, תחת לחץ נוזלי שונה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הערכה ישירה של תאי אנדותל כלי דם תחת לחץ נוזלי שונה. בעת ביצוע הליך זה, צעדים מרכזיים הם להשתמש paraformaldehyde מוכן טרי ולבצע זלבול טוב.

התחל הליך זה עם הרדמה של עכבר C57BL/6 בן 12 שבועות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. אשר הרדמה נכונה על ידי צביטה עדין של הזנב. תדביק את כפות העכבר לערימה של מגבות נייר, עם סרט הדבקה.

להחזיק את העור של העכבר עם מעצורים, לחתוך את העור עם זוג מספריים מהבטן לראש בית החזה. פתח את חלל הבטן, מתחת לצלעות, עם זוג חד של מספריים. להרים את עצם החזה עם מדפים, לחתוך את הסרעפת.

ואז לחתוך את בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה. חותכים את הנבוב ממש מעל הכבד עם מספריים. הלחץ מפזר את עץ העורקים במשך חמש דקות, עם מלוחים רגילים מצוננים מראש המכילים 40 יחידות לכל הפרין מיליליטר, דרך החדר השמאלי, עד שהריאות והכבד הופכים חיוורים.

לאחר מכן התבלבלו עם פרפורמלדהיד מקורר מראש של 4% ב-PBS במשך ארבע דקות. הסר את כל השרירים, האיברים והשומן, עד שהתספורת נחשפת. מקם את העכבר תחת מיקרוסקופ לנתח.

השתמש מדפים עדינים זוג מספריים עדינים לחשוף את האאורטה בבירור תחת מיקרוסקופ ניתוח, ולהסיר את רקמת החיבור לאורך בית הדם, בצורה נקייה ככל האפשר. ניתחו את בית החזה מהלב לתא המטען הצליאק עם זוג מספריים עדינים. מניחים את בית הישוריים לתוך צלחת תרבות תאים של שישה סנטימטרים, עם PBS.

חותכים את אב העורקים לאורך זמן, תחילה לאורך העקומה הפחותה, ולאחר מכן להשתמש microscissors לחתוך לפתוח את שלושת הענפים של קשת העורקים, כולל innominate, העורק התת-תת-חיים השמאלי לאורך העקומה הגדולה יותר עד הקטע הישר הוא נפגש. Permeabilize אבי האוזן עם 1%פוליוקסיאתילן אוקטיל פניל אתר, ב PBS במשך 10 דקות. לאחר מכן חסום את אבי הישבן עם סרום עיזים רגיל של 10% בתמיסת מלח עם חיץ טריס המכיל 2.5% פוליסורבט 20 למשך שעה בטמפרטורת החדר, בצלחת תרבות תאים של 12 בארות.

הדגירה הבאה של בית ההארתא במאגר החסימה המכילה חמישה גרם לארנב מיליליטר נגד VCAM1, וחמישה גרם לחולדה מיליליטר נגד VE-Cadherin, לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה מדגם שלוש פעמים עם פתרון כביסה, להחיל את הפלואורסצנטיות נדנוגדנים משניים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, שמירה במקום חשוך. יש לשטוף עוד שלוש פעמים בתס הכביסה.

יש לנטרל את בית השחי עם DAPI למשך 10 דקות, תוך שמירה על מקום חשוך. לאחר מכן שטפו את בית הדם המוכתם שלוש פעמים בתספורת הכביסה. מניחים את העורקים על פתק כיסוי עם משטח lumenal כלפי מטה, ולהזיז אותו לאט כדי פתרון הרכבה antifade כי כבר ירד בעבר על החלקת הכיסוי.

בעדינות למתוח את בית ההאורת כדי לשמור על הדגימה שטוחה. הפוך את החלקת המכסה והניח אותה על מגלשת הזכוכית. יש לדאוג להימנע בועות אוויר בין הדגימה לבין הזכוכית.

בחן את בית ההאורטה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר. נתח את התעצמות הצבעים בערוצים שונים מהאזור הרצוי בתמונות הפנים en, באמצעות תוכנת Image-Pro Plus. En פנים immunofluorescence הכתמת תמונות של תאי אנדותל כלי הדם מאוסעת העכבר מוצגים.

En immunofluorescence של חלבון הידבקות בתאי כלי הדם אחד, והבעה עם VE-Cadherin כסמן אנדותל, מוצגים תחת דפוסי זרימה משתנים מאזורים שונים של aorta העכבר. DAPI היה גם נגדי כדי להראות את גרעיני התא עבור הדמיה טובה יותר. כאשר מסתכלים דרך ערימות Z מתחת למיקרוסקופ, תאי השריר אנדותל וחלק ניתן להבדיל בקלות על ידי מורפולוגיה גרעיני התא שלהם.

גרעיני התא ה אנדותל הם בצורת אליפסה, וגדול יותר מאשר ציר בצורת, חלקה תא שריר גרעינים. הביטוי של VCAM-1 היה שופע יותר באזורים תחת זרימה מופרעת, עקמומיות פחותה של קשת בית החזה, בהשוואה לאזורים תחת זרימה יציבה, עקמומיות גדולה יותר של קשת בית החזה, ובאב המעצורים בבית החזה. כאן אזורים של עקמומיות פחותה של aorta העכבר מסומנים כמו אזורי d-זרימה, ואת עקמומיות בית החזה גדול יותר.

עם השינוי הנכון, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על ניתוח של חדרות כלי הדם, ואת המיקום של macromolecules ב האינטימה התא אנדותל.