Name: זיהוי חומצת אמינו מפיקי יתר באמצעות נדירים-Codon-מסמנים עשירים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: למד שיטה יעילה לזיהוי חומצות אמינו מפיקות יתר באמצעות מסמנים עשירים בקודונים נדירים. טכניקה זו מספקת דיוק, רגישות ותפוקה גבוהה בו-זמנית, ומתאימה למיקרואורגניזמים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה היתה נתמכת במשותף על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט no. 21676026), המפתח הלאומי R & D תוכנית של סין (להעניק no. 2017YFD0201400), ואת הקרן פוסט דוקטורט בסין (להעניק no. 2017M620643). עבודות במכון לקידום באוניברסיטת UCLA (סאזהאו) תמכו על ידי מענקים פנימיים מפרובינצית ג'יאנגסו ופארק התעשייה סאזהאו.

1. הקמת הפלמידים המבטאים את הגנים הנדירים של הסמן
<ol><li>בחרו גן סימון המכיל מספר מתאים של הקודונים המשותפים לחומצת האמינו הממוקדת. הערה: עבור L-לאוצין, הקנאמיצין התנגדות גן , אשר מכיל 29 לוקיונים, שמהם 27 הם משמשים משותפים, משמש לבניית מערכת הבחירה13. הגן gfp , אשר מכיל 17 הגנודונים משותפים מתוך 19 לאוצין לוקיונים, או סגול חלבון קידוד הגנים פראנצרסגול (ppg), אשר הנמלים 14 לאוצין משותף, משמש עבור מערכת ההקרנה (טבלה משלימה 1 ).</li>
	<li>החלף את הקודונים המשותפים בגנים הסמן עם הקודון הנדיר הנרדף. עבור L-leucine, להחליף את הקשר שלה ב- kan, gfp, או ppg עם codons נדיר cta, יצירת קןr-rcs, gfp-rc, או ppg-rc, בהתאמה13 ( טבלה משלימה 1). הערה: תדירות הקודון הנדירה בגנים הסמן תשפיע על הצפיפות של מערכת הבחירה או ההקרנה. באופן כללי, הגדלת מספר הקודונים הנדירים תגדיל את הדרך של מערכת הבחירה או ההקרנה. כדי להשיג את הבחירה המתאימה או חוזק ההקרנה, לעצב סדרה של גנים סמן כי הנמל מספרים שונים של הקוטדונים נדירים להשוות את ההשפעות שלהם.</li>
	<li>ליצור אבני בניין של גנים נדירים-codon עשיר סמן באמצעות כלים כגון גנדיזיין14 (http://54.235.254.95/gd/) עבור סינתזה גנטית. לחלופין, להזמין את הגנים סמן מסחרי שירותי סינתזה הגנים.<ol>
<li>בדף ' עיצוב גננט ', בחר באפשרות ' עיצוב אבני בניין ' (חפיפה באורך קבוע).</li>
		<li>הדבק את רצפי הגנים הנדירים של הסמן בתיבת הרצף .</li>
		<li>הגדירו את אורך החפיפה בין ההרכבה. זכור כי ברירת המחדל 40 bp עובד בסדר עבור רוב רצפים. הערה: עיין במדריך המקוון לקבלת הוראות נוספות לגבי ההגדרות של הפרמטרים האחרים.</li>
		<li>לחץ על הלחצן אבני בניין עיצוב ולהזמין את האוליונואודים המפורטים בדף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לסנתז את הגנים נדירים-codon-שונה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוססי סינתזה מדויקת15.</li>
	<li>Ligate הנדיר-codon-עשיר קאןR-rc לחיות מחמד וקטור-28a, Gfp-rc ל pSB1C3, ו -ppg-rc ל cpb-37-44116. הערה: מפות pET-28a ו-pSB1C3 הינם זמינים במסד הנתונים המקוון SnapGene (טבלה משלימה 1); מפת ה-CPB-37-441 פלאמיד הינה זמינה באתר האינטרנט של החלבון כרומוגניים.<ol>
<li>על הקרח, להוסיף את הווקטור ואת שברי סמן ביחס טוחנת של 1:1 כדי 7.5 μL של ערבוב ההרכבה (ראה טבלת חומרים) לנפח כולל של 10 μl. מודאת הדגימה ב50. מעלות צלזיוס לשעה אחת</li>
		<li>המרה 5 μL של מוצר ההרכבה לתוך 50 μL של תאים מוכשרים (ראה את הטבלה של חומרים) ב 42 ° c עבור 30 s.</li>
		<li>לשחזר את התאים SOC (ציר מיטבי במיוחד עם דיכוי catabolite) בינוני ב 37 ° צ' עבור 1 h, צלחת אותם ב-LB (ציר לילה) אגר בינוני, ו הדגירה אותם ב 37 ° c ללילה.</li>
		<li>איחסן את המושבה לתוך מדיום LB ו-דגירה ב 37 ° c עבור 8 h.</li>
		<li>בודד את הפלביניים באמצעות ערכת מסחרית מועדפת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מיטוב תנאי הבחירה
<ol><li>הפוך את זן האב המשמש עבור מוטגנזה לתאים מוכשרים17.</li>
	<li>לשנות את 50 μl של התאים המוסמכים עם 1 μl של פלאבין כי נושאת את הסוג הפראי קאןr, ולהפוך קבוצה נוספת של התאים המוסמכים עם הפלס1 המכיל את קןr-RC29 עם כל האוצין קודון הוחלף על ידי נדיר .</li>
	<li>הוסף 950 μL של SOC בינונית ו-דגירה את המדגם ב שייקר ב 250 rpm ב 37 ° צ' עבור 1 h.</li>
	<li>צלחת 100 μL של התרבות התא על LB אגר בינונית המכיל 50 μg · mL-1 kanamycin, ו מודקת אותו ב 37 ° צ' עבור כ 8 h עד המושבות מופיעות.</li>
	<li>לבחור את המושבות כי הנמל הפראי סוג של קן ולאוצין נדיר-Codon-עשיר kanR-RC29 ולהשתמש בכל החיסונים 5 מ ל של חמישה מדולל בינונית LB (0.2 x Lb) המכיל 50 μg · mL-1 kanamycin. מודאת דגימות בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c. הערה: המדיום הינו חיוני עבור מערכת הבחירה. זה צריך להכיל רק פחמן מספיק חנקן כדי לאפשר ביטוי של חלבון עמידות לאנטיביוטיקה מן הגנים מסוג פראי ולא מן הנגזרים נדירים השתנה-codon. במקרה זה, הריכוז L-leucine ב-1x ליברות בינונית הוא גבוה מדי כדי לעכב לחלוטין את ביטוי החלבון מן הנדיר-codon-עשיר-האור. לפיכך, מדיום LB מדולל עם גורם דילול כגון 5 משמש כדי ליצור הבדל ברור ביטויי חלבון מסוג פראי ואת נדיר codon-עשיר גנים.</li>
	<li>העברת 200 μL של כל אחת מתרבויות התא לצלחת 96-באר בטריליטה בנקודות זמן מוגדרות (למשל, 8 h, 16 h, ו 24 שעות). למדוד את OD600 (צפיפות אופטית ב 600 nm) באמצעות קורא צלחת. הערה: אם ירידה בתא OD600 לא ניתן לזהות עבור זנים מחסה את הגנים נדירים-קודון-עשיר סמן בהשוואה ל-OD600 של המתח מחסה גנים סמן בסוג פראי, לנסות להגדיל את כמות קודון נדיר ב סמן גנים או להשתמש בינוני מדולל יותר.</li>
	<li>לבצע את שיטת האכלה חומצות אמינו כדי לבדוק אם הביטויים של הגנים נדיר-codon עשיר סמן (g., KanR-RC29) ניתן לשחזר על ידי הגברת הריכוז של חומצות אמינו ממוקדות. הערה: לבחירת מפיקי היתר של L-leucine, L-leucine משמש להזנה.<ol>
<li>איחסן את הזנים מחסה לג R-RC29 סמן גן לתוך 5 מ ל של 0.2 x LB (המכיל 50 μg · mL-1 kanamycin) עם או בלי האספקה של 1 גרם · . א-ל-לאוצין האיחסן אחר 5 מ ל של 0.2 x LB עם זנים כי הנמל הפראי בסוג קןR כמו בקרה. מודאת דגימות בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c.</li>
		<li>למדוד את OD600 עבור כל תרבות בנקודות זמן מוגדרות (למשל, 15 h, 17 h, 19 h, ו -22 שעות).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. מיטוב תנאי ההקרנה
<ol><li>המרה 50 μL של זן האב משמש עבור מוטזיס עם 1 μL של פלאבין (~ 50 ng מסוג · μL-1) שנושאת את הסוג הפראי של gfp או את הפראי- ppg. כמו כן, לשנות את המתח ההורה עם הנגזרים נדירים העשירים של הגנים סמן.</li>
	<li>הוסף 950 μL של SOC בינונית ו-דגירה את המדגם ב שייקר ב 250 rpm ב 37 ° צ' עבור 1 h.</li>
	<li>צלחת 100 μL של תרבות התא על ליברות אגר בינונית המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה (25 μg · mL-1 כלוראמניול עבור gfp בעלי מרקר בגובה cmR , או 50 μg · ml-1 kanamycin עבור ppg פלסמיד לשאת את הסמן KanR ) ו הדגירה לילה ב 37 ° c.</li>
	<li>בחר מושבה אחת כי הנמלים מסוג פראי gfp או ppg ומושבה אחת כי הנמלים המקבילה המקביל נדיר codon-עשיר, ולהעביר אותם 5 מ ל של מדיום מדולל כראוי LB בנפרד. מודאת דגימות בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c. הערה: עבור ה-E. coli זנים מחסה לאוצין נדיר-codon-עשיר gfp-rc או ppg-rc, בינונית ליברות הולות דולל (1x lb) ניתן להשתמש כדי ליצור הבדלים משמעותיים בביטויים של סוג פראי ו-נדיר codon-עשיר סמן גנים. גם, inducible יזמים משמשים לכונן את הביטויים של גנים סמן ההקרנה. התחילו בגיוס כאשר התאים מזינים את השלב האקספוננציאלי כדי להשיג מבדיל טוב יותר.</li>
	<li>עבור סמנים פלואורסצנט, העבר 200 μl של כל אחת מתרבויות התא לתוך 96-באר שחור התחתית ברורה בטריפליכאט בנקודות זמן מוגדרות (למשל, 2 h, 4 h, ו 6 h). למדוד את OD600 ואת הזריחה ולחשב את עוצמת הקרינה (היחס של הזריחה כדי OD600). לסמני כרומוגניים, מדדו את פיתוח הצבע של תרביות התא. הערה: אם עוצמות נמוכות יותר של כוונות זריחה לא ניתן לזהות עבור זנים מחסה gfp-RC בהשוואה לזה של זנים מחסה gfpמסוג פראי, או אם צבע בהיר לא ניתן לזהות עבור תאים המבטאים את החלבון הסגול מ -ppg-RC מאשר מהגן פראי סוג, לנסות להגדיל את מספר קודון נדיר על הגנים סמן או להשתמש בינוני מדולל יותר.</li>
	<li>בצע את שיטת ההזנה (ראה שלבים 2.7.1 ו-2.7.2). למדוד את עוצמת הקרינה או את התפתחות הצבע בנקודות זמן מוגדרות (למשל, 12 h, 18 h, ו 24 h).</li>
</ol>4. זיהוי מפיקי היתר של חומצת אמינו
<ol><li>איחסן 100 μL של התרבות של המוטציות לתוך 5 מ ל ליברות (2% v/v) ו-דגירה אותו שייקר ב 250 rpm ב 37 ° צ' עד הערכים של OD600 להגיע 0.4.</li>
	<li>להפוך את המוטציות. לתאים מוכשרים17</li>
	<li>שינוי 50 μL של תאים מוטציה עם 1 μL של הפלבאמצע (~ 50 ng · μL-1) נושאת את סמן בחירה kanR-RC29 או סמנים ההקרנה gfp-rc או ppg-rc. הוסף 950 μL של SOC בינוני וסובב את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס שייקר עבור 1 h.</li>
	<li>בחר מפיקי יתר של חומצות אמינו.<ol>
<li>צנטריפוגה את תרבות התא ב 4,000 x g עבור 5 דקות, למחוק את supernatant ולהוסיף 5 מ ל של 0.2 x ליברות בינונית המכילה 50 μg · mL-1 kanamycin. מודטה את המדגם ב 37 ° c שייקר לילה.</li>
		<li>צלחת התרבות לילה (למשל, 100 μL, תלוי בצפיפות התא של התרבות) על 0.2 x LB אגר בינונית המכילה 50 μg · mL-1 kanamycin ו מארג ב 37 ° צ' עבור 12 h. הערה: המושבות שפותחו הן המועמדים של מפיקי חומצת אמינו ממוקדות ובמקרה זה, מפיקי היתר של L-leucine.</li>
	</ol></li>
	<li>. להקרין את מפיקי חומצת האמינו<ol>
<li>צלחת את המספר המתאים של תאים (למשל, 100 μL) מחסה את סמן ההקרנה (כמתואר בשלב 4.3) אל ליברות אגר בינונית המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה (25 μg · mL-1 כלוראמניול עבור הקרנה עם GFP-RC ו 50 μg · ml -1 kanamycin עבור הקרנה עם ppg-RC) ו-הדגירה ב 37 ° c עבור 8 h.</li>
		<li>איחסן את המדיום LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (ראה שלב 4.5.1) עם כל מושבה אחת מן הצלחת. מודאת דגימות בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c.</li>
		<li>למדוד את OD600 ואת הזריחה ולחשב את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית אם GFP-RC משמש. מדדו את פיתוח הצבע של תרביות התא אם נעשה שימוש ב -ppg-RC . שימו לב כי זנים המציגות את עוצמת הזריחה גבוהה יותר או צבע עמוק יותר מאשר זה של זן האב הם חומצות אמינו המועמד מפיקים יתר, במקרה זה, מפיקי היתר L-leucine. הערה: מיון התא המופעל על-ידי הקרינה הפלואורסצנטית מתאים גם לזיהוי מפיקים בעלי תא בודד, כאשר הגנים של חלבון הפלורסנט הנדירים משמשים להקרנה.</li>
	</ol></li>
	<li>ודאו שחומצות האמינו מיצרניות. את הזנים של המועמדים<ol>
<li>האיחסן 5 מ ל של LB בינונית עם כל אחד מזני המועמדים ולתת לתאים לצמוח לילה בשייקר ב 250 סל ד ב 37 ° c.</li>
		<li>לקצור את התאים מ-1 מ ל של תרבות התא על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 2 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של מים סטריליים.</li>
		<li>האיחסן 20 מ ל של M9 בינונית המכילה 4% גלוקוז עם 200 μL של ההשעיה התא ו דגירה ב 250 mL שייקר ב 250 rpm ב 37 ° צ' עבור 24 h.</li>
		<li>צנטריפוגה 1 מ ל של מדיום התרבות ב 4,000 x g עבור 5 דקות. העברה 200 μl של סופרנטנט לצינור 1.5 נקי ממדי. הכנת פתרונות L-leucine (כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים) של 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 ו-1 g · . אני-1 כסטנדרט</li>
		<li>הוסף 100 μL של 1 מ"מ triethylamine ו 100 μL של 1 מ ' פניקסיל isothiocyanate אל supernatant ואת הסטנדרטים, לערבב אותם בעדינות, ו מקרין אותם בטמפרטורת החדר עבור 1 h18. התראה: Triethyine ו פנאיל isothiocyanate יכול לגרום כוויות עור חמורות נזק העין והוא מזיק אם שאפה. לבש כפפות ומסכה, ואם אפשר, בצע את השלב הזה בתוך מכסה המנוע.</li>
		<li>הוסף 400 μl של n-הקסאן לאותה צינורית ומערבולת אותו עבור 10 s. לסנן את השלב התחתון המכיל את נגזרות חומצות אמינו באמצעות קרום 0.2 יקרומטר polyטטראואתילן. התראה: n-הקסאן יכול לגרום לגירוי בעור. לבש כפפות וביגוד מגן. אם זה בא במגע עם העור, לשטוף את העור עם הרבה מים.</li>
		<li>הכנת השלב הנייד A על ידי ערבוב 0.1 M נתרן אצטט (pH 6.5) ו acetonitrile ב 99.3:0.7 יחס נפחי. הכינו את הצ (80% v/v) כשלב נייד B. מסנן את כל השלבים הניידים באמצעות ממברנות הפוליציטיאואתילן של 0.2 יקרומטר. התראה: Acetonitrile מזיק אם השאיפה והוא יכול לגרום גירויים בעור ובעיניים. לבש כפפות וביגוד מגן ובצע את הצעד הזה בתוך מכסה המנוע.</li>
		<li>הפעל 1 μL של המדגם על בדיקת אולטרה מצויד בעמודה סי18 בהתאם לתוכנית להתחמק בטבלה 1 עם קצב הזרימה של 0.42 mL · min-1 וטמפרטורת עמודה של 40 ° c. לזהות את חומצות אמינו ממוקדות ב 254 ננומטר עם גלאי מערך דיודה ולחשב ריכוזים שלהם על ידי מיפוי אזורי שיא לעיקול רגיל.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>זמן (מזערי)</td>
			<td>שלב נייד A (%)</td>
			<td>שלב נייד B (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3.5</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>43</td>
			<td>57</td>
		</tr>
<tr>
<td>7.1</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1: תוכנית הימנעות עבור כימות של חומצות אמינו.

<ol><li>Tatsumi, N., Inui, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTatsumi%2C+N+%22Corynebacterium+glutamicum%3A+biology+and+biotechnology%22">Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology</a>. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).</li>
<li>Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTonouchi%2C+N+%22Amino+Acid+Fermentation%22">Amino Acid Fermentation</a>. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).</li>
<li>Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , US6403342B1 (2005).</li>
<li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+systems+metabolic+engineering+of+microorganisms+for+amino+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).</li>
<li>Norris, R., Lea, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+amino+acid+analogues+in+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Progress%22%5BJournal%5D)">The use of amino acid analogues in biological studies.</a> Science Progress. , 65-85 (1976).</li>
<li>Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentative+production+of+branched+chain+amino+acids%3A+a+focus+on+metabolic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).</li>
<li>Bach, T. M., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+metabolisms%2C+and+applications+of+L-proline+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).</li>
<li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On the genetic code.</a> Science. 139 (3554), 461-464 (1963).</li>
<li>Plotkin, J. B., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synonymous+but+not+the+same%3A+the+causes+and+consequences+of+codon+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias.</a> Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).</li>
<li>Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino%E2%80%90acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation.</a> EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+explains+patterns+of+codon+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage.</a> Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).</li>
<li>Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel%2B+and+Rel%E2%88%92+strains+during+amino+acid+starvation%3A+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+rare+codon-rich+markers+for+screening+amino+acid+overproducers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers.</a> Nature Communications. 9 (1), 3616(2018).</li>
<li>Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneDesign%3A+rapid%2C+automated+design+of+multikilobase+synthetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes.</a> Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).</li>
<li>Xiong, A. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+accurate+synthesis+of+long+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences.</a> Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PITC+derivatives+in+amino+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PITC derivatives in amino acid analysis.</a> Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).</li>
<li>Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillomavirus+capsid+protein+expression+level+depends+on+the+match+between+codon+usage+and+tRNA+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability.</a> Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).</li>
<li>Gregg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+optimization+of+tolC+as+a+powerful+dual+selectable+marker+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).</li>
<li>Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Bacillus+subtilis+sacB+gene+confers+sucrose+sensitivity+on+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).</li>
<li>Avcilar-Kucukgoze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discharging+tRNAs%3A+a+tug+of+war+between+translation+and+detoxification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).</li>
<li>Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+high+yield+production+of+L-serine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).</li>
<li>Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectinomycin+resistance+at+site+1192+in+16S+ribosomal+RNA+of+E.+coli%3A+an+analysis+of+three+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants.</a> Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).</li>
<li>Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+tRNA+recognition+of+a+tRNA+synthetase+by+a+single+amino+acid+change%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).</li>
<li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+tRNA+aminoacylation+mechanism+based+on+a+single+G%E2%80%A2+U+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair.</a> Nature. 510 (7506), 507(2014).</li>
<li>Hoesl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+evolution+of+a+bacterial+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemical evolution of a bacterial proteome.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).</li>
<li>Hershberg, R., Petrov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+on+codon+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Selection on codon bias.</a> Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).</li>
<li>Huo, Y. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+proteins+into+biofuels+by+engineering+nitrogen+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux.</a> Nature Biotechnology. 29, 346(2011).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

מספר המקורות הנדירים בגנים הסמן והבחירה או הסינון הם קריטיים לעכב את ביטויי החלבון מהגנים הנדירים של הסמן השונה-codons. אם לא ניתן לזהות הבדל משמעותי בין ביטויי חלבון מן הגנים סמן פראי ונגזרות שלהם, הגדלת מספר החומרים הנדירים או שימוש במדיום מוגבלת מזינים עשוי להגביר את ההבדלים. עם זאת, אם אפקט העיכוב חזק מדי, לא ניתן לשחזר את ביטויי החלבון גם על ידי האכלה נוספת של חומצות האמינו המתאימות. במקרה זה, מספר הדונים נדירים בגנים סמן צריך להיות מופחת כדי להקל על חלק מהלחץ. דרך נוספת לכוונן את הבחירה או הסינון היא לכוונן את מספר...

הייצור הנוכחי של חומצות אמינו מסתמך בכבדות על תסיסה. עם זאת, מגדל ותשואות עבור רוב חומצות אמינו זנים הייצור הם מתחת הדרישות העולות של שוק חומצות אמינו גלובלי כי הוא שווה מיליארדי דולרים1,2. קבלת ביצועים גבוהים חומצת אמינו מפיקי הם קריטיים לשדרוג תעשיית חומצת האמינו.
אסטרטגיה מסורתית לזיהוי מפיקי חומצת אמינו מנצלת את התחרויות בין חומצות אמינו לבין האנלוגיות שלהם בסינתזה החלבונים3,4. אנלוגיות אלה מסוגלים לחייב את tRNAs כי להכיר את חומצות אמינו המקביל ובכך לעכב את elongations של רשתות פפטיד, המוביל הצמיחה נעצר או מוות התאים5. דרך אחת להתנגד הלחצים האנלוגיים היא להגביר את ריכוזי חומצות אמינו תאיים. חומצות האמינו המועשרת יתחרו את האנלוגיות עבור tRNAs הסופיים ויבטיחו את הסינתזה הנכונה של חלבונים פונקציונליים. לכן, זנים השורדים את האנלוגיות ניתן לבחור ונוטים להיות מפיקי היתר של חומצות האמינו המתאימות.
למרות שהוא הצליח להצליח בבחירת יצרני מיתר עבור חומצות אמינו כגון L-leucine6, האסטרטגיה מבוסס אנלוגי סובל מחסרונות חמורים. דאגה אחת גדולה היא ההתנגדות האנלוגית מקורו בתהליך של מוטגנזה או באמצעות מוטציות ספונטניות. זנים עם התנגדות יכול להימלט מהבחירה על ידי חסימת, ייצוא, או משפיל את האנלוגיות5. דאגה נוספת היא תופעות הלוואי הרעילות של האנלוגיות על תהליכים סלולריים אחרים7. כתוצאה מכך, זנים השורדים את הבחירה האנלוגית לא יכול להיות חומצות אמינו overproducers, בעוד מפיקי יתר הרצוי יכול להיות מושמד בטעות בשל תופעות לוואי שליליות.
כאן, אסטרטגיה הרומן המבוססת על החוק של קודון הטיה מוצגת על מנת להשיג זהויות מדויקות ומהירה של מפיקים יתר של חומצות אמינו. חומצות אמינו רוב מקודדים על ידי יותר מאשר שלישיה נוקלאוטיד אחד כי הוא המועדף באופן שונה על ידי אורגניזמים המארחים8,9. מספר משתמשים מסוימים משמשים לעתים רחוקות ברצפי הקידוד ומכונים הקודונים נדירים. התרגומים שלהם לתוך חומצות אמינו מסתמכים על trnas קנצוני לשאת את חומצות האמינו המתאימות. עם זאת, tRNAs המכירים בקודונים נדירים יש בדרך כלל הרבה יותר מחולות מאשר tRNAs של הקודונים המשותפים10,11. כתוצאה מכך, tRNAs נדירים אלה פחות סביר ללכוד את חומצות האמינו חינם בתחרויות עם איזוזמינים אחרים, ותרגומים של הרצפים נדיר-codon-עשיר מתחילים להאט או אפילו מסתיימים כאשר כמויות של חומצות אמינו מוגבלות 10. התרגומים יכולים, תיאורטית, להיות משוחזר אם יש עודף חומצת אמינו לאחר הטענת tRNAs משותף נרדף בשל הפקות יתר או ההאכלה נוספת של חומצות אמינו המקביל12. אם הגנטי נדיר-codon-עשיר מקודד בחירה או סמן ההקרנה, זנים המציגות פנוטיפים המתאימים יכול להיות מזוהה בקלות וכנראה המפיקים יתר של חומצות אמינו ממוקדות.
האסטרטגיה הנ ל מיושמת על מנת ליצור מבחר ומערכת הקרנה לזיהוי מפיקי יתר של חומצות אמינו. מערכת הבחירה משתמשת גנים עמידות לאנטיביוטיקה (g., KanR) כמו סמנים בעוד מערכת ההקרנה משתמשת הגנים הקידוד פלורסנט (למשל, חלבון פלורסנט ירוק [gfp]) או כרומוגניים (למשל, פראנצרסגול) חלבונים. הגנים סמן בשתי המערכות משתנים על ידי החלפת מספרים מוגדרים של הקודונים המשותפים עבור חומצת האמינו הממוקדת עם חלופה נדירה נרדפת. זנים בספריית מוטציה כי הנמל הגן נדיר-codon-עשיר סמן בחרו או הוקרן בתנאים הנכונים, ואת מפיקי היתר של חומצות אמינו ממוקדות ניתן לזהות בקלות. זרימת העבודה מתחילה עם בניית מערכת גנטית נדיר codon-עשיר סמן, ואחריו אופטימיזציה של תנאי עבודה, ולאחר מכן זיהוי ואימות של חומצות אמינו מפיקים יתר. זו אסטרטגיה בלתי תלויה אנלוגי מבוסס על הדוגמה בתרגום חלבונים ומאומת למעשה כדי לאפשר זהויות מדויקות ומהירה של מפיקי חומצות אמינו. תיאורטית, זה יכול להיות מועסק ישירות עם חומצות אמינו עם מיקרודונים נדירים ועל כל המיקרואורגניזמים. בסך הכל, האסטרטגיה נדירה-codon מבוסס ישמש חלופה יעילה לגישה המקובלת מבוססי אנלוגי כאשר אנלוגי הנכון עבור חומצות אמינו ספציפיות אינן זמינות, או כאשר שיעור חיובי שווא גבוה הוא הדאגה העיקרית. הפרוטוקול שלהלן משתמש לאוצין נדיר קודון להפגין את האסטרטגיה הזאת בזיהוי es, coli קולי L-לאוצין מפיקי.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile</td><td>Thermo</td><td>51101</td><td></td></tr><tr><td>EasyPure HiPure פלסמיד MiniPrep ערכת</td><td>טרנסגן</td><td>EM111-01</td><td></td></tr><tr><td>EasyPure ערכת מיצוי ג'ל מהיר</td><td>Transgen</td><td>EG101-01</td><td></td></tr><tr><td>גיבסון הרכבה מאסטר מיקס</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>L-לאוצין</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרו-פלטות</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>n-הקסאן</td><td>Thermo</td><td>H3061</td><td></td></tr><tr><td>פניל איזותיוציאנט</td><td>Sigma</td><td>P1034</td><td></td></tr><tr><td>PrancerPurple CPB-37-441</td><td>ATUM</td><td>CPB-37-441</td><td></td></tr><tr><td>TransStar FastPfu זבוב DNA</td><td>פולימראז טרנסגן</td><td>AP231-01</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד</td><td>Agilent</td><td>1290 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>סוג פרא C. glutamicum</td><td>ATCC</td><td>13032</td><td></td></tr><tr><td>XL10-Gold E. coli תא מוכשר</td><td>Agilent</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 עמודה</td><td>Agilent</td><td>ברקוד 959759-902K</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי חומצת אמינו מפיקי יתר באמצעות נדירים-codon-מסמנים עשירים

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

כדי לספק את השוק הצומח אי פעם עבור חומצות אמינו, זנים הייצור ביצועים גבוהים נחוצים. חומצות אמינו מפיקים מאוד מזוהים על ידי רתימת התחרויות בין חומצות אמינו לבין האנלוגיות שלהם. עם זאת, שיטה מבוססת-אנלוגי זו היא בדיוק נמוכה, והאנלוגי המתאים לחומצות אמינו ספציפיות מוגבל. כאן, אנו מציגים אסטרטגיה חלופית המאפשרת הקרנת מדויק, רגיש, תפוקה גבוהה של יצרני מיתר חומצות אמינו באמצעות סמנים נדירים-העשירים. אסטרטגיה זו היא בהשראת התופעה של הטיית השימוש של קודון בתרגום חלבונים, אשר מסווגים ביניהם לבין הנפוצים או נדירים מבוסס על התדרים שלהם של התרחשות ה-DNA קידוד. התרגום של מגנטים נדירים תלוי ב-rnas המקביל (trnas) נדיר שלהם, אשר לא ניתן לטעון במלואה על ידי חומצות אמינו קנצוני מתחת לרעב. באופן תיאורטי, tRNAs נדיר יכול להיות מחויב אם יש עודף של חומצות אמינו לאחר הטעינה של איזומקובלים משותפים נרדף. לכן, תרגומים מפגרים הנגרמים על ידי הקודונים נדירים יכולים להיות משוחזרים על ידי האכלה או הפקות יתר של חומצות האמינו המתאימות. תחת הנחה זו, מערכת בחירה או סינון לזיהוי מפיקי חומצות אמינו מוקמת על ידי החלפת הפחם המשותף של חומצות אמינו ממוקדות עם חלופות נדירות שלהם נרדף גנים עמידות לאנטיביוטיקה או את הגנים הצפנה או חלבונים כרומוגניים. אנו מראים כי ביטויי החלבון יכולים להיות מאוד מפריע בשילוב של הידרודונים נדירים וכי רמות החלבונים לתאם באופן חיובי עם ריכוזי חומצת אמינו. באמצעות מערכת זו, יצרני יתר של חומצות אמינו מרובות יכול להיות מוקרן בקלות מספריות מוטציה. האסטרטגיה הנדירה המבוססת על המחשב מחייבת רק גן אחד שהשתנה, והמארח פחות סביר להימלט מהבחירה מאשר בשיטות אחרות. הוא מציע גישה חלופית להשגת מפיקי יתר של חומצות אמינו.

עבור מערכת הבחירה, ירידה חדה ב-OD600 עבור זנים מעניקה נדיר-codon-עשיר עמידות לאנטיביוטיקה הגן צריך להיות נצפתה בהשוואה למתח מחסה את הגן מסוג פראי התנגדות לאנטיביוטיקה כאשר תרבותי בצורה מתאימה בינונית (איור 1a). תחת אותם התנאים, הירידה בתא OD600 הופך להיות ברור יותר כמו מספר של הפחם נדיר ב עמידות לאנטיביוטיקה הגנים מגביר (איור 1a). יש לציין כי עיכוב של התבטאויות נדירות על ביטויי חלבון מתרחש בעיקר תחת תנאים מו...

מחקר זה מציג אסטרטגיה חלופית לשיטה הקונבנציונלית הרעילה האנטי-אנלוגית בזיהוי מפיקי מיתר של חומצות אמינו באמצעות סמנים נדירים-מאוד עשירים להשגת דיוק, רגישות ותפוקה גבוהה בו זמנית.

זיהוי חומצת אמינו מפיקי יתר באמצעות נדירים-Codon-מסמנים עשירים

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

שיטה זו מספקת חלופה יעילה לגישה האנלוגית הקונבנציונלית בהשגת יתר של חומצות אמינו. טכניקה זו עולה על השיטה המסורתית המבוססת על אנלוגיה על-ידי מתן דיוק, רגישות ותפוקה גבוהה בו-זמנית. שיטה זו שופכת אור חדש על הבנת חוזקות ייצור יתר של חומצות אמינו ותרגום של קודונים נדירים, תיאורטית, יכול להיות מיושם על כל מיקרואורגניזמים.פרוטוקול זה מסתמך בעיקר על פעולות ניסיוניות מולקולריות בסיסיות שקל לעקוב אחריהן, אך עשויות לדרוש ניסויים מרובים על מנת להשיג את הבחירה המתאימה של מחרוזות מאמץ. הדגמה חזותית של טכניקה זו מציעה הערכה ישירה על הביצועים של הבחירה מערכת הקרנה בזיהוי יצרני חומצות אמינו. כדי להתחיל בהליך זה, מוסיפים את הווקטור שברי הסמן, על הקרח, ביחס טוחנת של אחד עד שבע נקודות חמישה מיקרוליטרים של תערובת הרכבה לנפח כולל של עשרה מיקרוליטרים.דגירה ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. הפוך חמישה מיקרוליטרים של מוצר ההרכבה ל-50 מיקרוליטרים של תאי רכיבים ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. לשחזר את התאים במרק סופר אופטימלי עם מדיום דיכוי קטבוליט ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר מכן, צלחת אותם על LB אגר בינוני דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, השתמש בערכה מסחרית מועדפת כדי לבודד את הפלסמיד. ראשית, להפוך 50 microliters של התאים המוסמכים עם מיקרוליטר אחד של פלסמיד שנושא את קאנר מסוג פראי.להפוך קבוצה שנייה של תאים מוכשרים עם פלסמיד המכיל KanR RC 29 עם כל קודונים לאוצין הוחלף על ידי CTA קודון נדיר. לוח ודגירה של תרבות התא כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר את המושבות כי מחסה גן סמן הבחירה מסוג פראי הנגזרת נדירה-קודון עשיר בנפרד לתוך חמישה מיליליטר של חמש פעמים מדולל LB בינוני המכיל kanamycin בריכוז של 50 מיקרוגרם למיליליטר.הדגירה את הדגימות בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 250 סל"ד. לאחר מכן, להעביר 200 microliters של כל אחת מתרבות התא לתוך צלחת 96 גם ב triplicate בנקודות זמן מוגדרות. השתמש בקורא לוחות כדי למדוד את OD600.לחסן את הכתמים מחסה הגן סמן KanR RC 29 בשתי קבוצות של חמישה מיליליטר של 0.2 x LB בינוני המכיל kanamycin, עם או בלי אספקה של L-לאוצין. הוסף L-לאוצין לאחד המדיה לריכוז סופי של גרם אחד לליטר. הדגירה את הדגימות בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 250 סל"ד ולמדוד את OD600 עבור כל תרבות בנקודות זמן מוגדרות.כדי להתחיל, להפוך 50 microliters של זן האב המשמש mutagenesis עם microliter אחד של פלסמיד שנושאת GFP מסוג פראי או PPG מסוג פראי. לוח ודגירה של תרבות התאים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר את המושבות בנפרד לחמישה מיליליטר של מדיום LB מדולל כראוי.דגירה הדגימות בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 250 סל"ד. עבור סמני פלואורסצנטיות, להעביר 200 microliters של תרבות התא לתוך 96 צלחת אחורית תחתונה ברורה היטב ב triplicate בנקודות זמן מוגדרות. למדוד את OD600 ב פלואורסצנטיות ולחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות.עבור סמנים כרומוגניים, למדוד את התפתחות הצבע של תרבות התא. בצע את בדיקת ההזנה כפי שתואר בעבר ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות או את התפתחות הצבע בנקודות זמן מוגדרות. ראשית, להפוך 50 microliters של תאים מוטנטים עם microliter אחד של פלסמיד נושאת את סמן הבחירה KanR RC 29, או סמני ההקרנה GFP RC או PPG RC. לאחר מכן, צנטריפוגה תרבות התא ב 4000 פעמים G במשך חמש דקות.לבחירה, השלך את העל-טבעי והוסף חמישה מיליליטר של מדיום 0.2 x LB המכיל קנאמיצין לתאים הנושאים את סמן הבחירה. דגירה המדגם לילה בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, צלחת תרבות הלילה על 0.2 x LB אגר בינוני המכיל קאנאמיצין ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות.להקרנה, צלחת המספר המתאים של תאים מחסה סמן ההקרנה על מדיום אגר LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה שעות. לאחר מכן, לחסן את המדיום LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה עם כל מושבה אחת מהצלחת.הדגירה את הדגימות בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 250 סל"ד. למדוד את OD600 ואת הפלואורסצנטיות ולחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות אם GFP RC משמש. למדוד את התפתחות הצבע של תרבות התא אם PPG RC משמש.כדי לאמת את המוצריות של חומצות האמינו של הזנים המועמדים, הכינו את תרבות הזרעים על ידי חיסון חמישה מיליליטר של מדיום LB עם כל אחד מהזנים המועמדים ותנו לתאים לגדול בן לילה בשייקר ב-250 סל"ד וב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, לקצור את התאים ממיליליטר אחד של תרבות התא על ידי צנטריפוגה ב 4000 פעמים G במשך שתי דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את הצבעים במיליליטר אחד של מים סטריליים.לחסן 20 מיליליטר של M9 בינוני המכיל ארבעה אחוז גלוקוז עם 200 microliters של ההשעיה התא דגירה בשייקר 250 מיליליטר ב 250 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. למחרת, צנטריפוגה מיליליטר אחד של מדיום התרבות ב 4000 פעמים G במשך חמש דקות. מעבירים 200 מיקרוליטרים של העל-טבעי לצינור נקי של 1.5 מיליליטר.הכן פתרונות סטנדרטיים L-לאוצין בריכוזים המוצגים כאן. במכסה המנוע של האדים, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של טריאתילאמין מילימולארי אחד ו-100 מיקרוליטרים של פניל דיסותיוצ'ינאט טוחן אחד הן לעל-טבעי והן לסטנדרטים. מערבבים את הפתרונות בעדינות ומדרגרים אותם בטמפרטורת החדר למשך שעה.לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של n-hexane לאותו צינור ומערבולת זה במשך עשר שניות. השלב התחתון מכיל את נגזרות חומצות האמינו והוא משמש לניתוח HPLC. סנן את השלב התחתון באמצעות 0.2 ממברנות פוליטרא-פוליאואורואתילן מיקרוליטר.לאחר מכן, הפעל מיקרוליטר אחד של המדגם על HPLC אולטרה מצויד בעמודה C18 עם קצב זרימה של 0.42 מיליליטר לדקה ו בטמפרטורת עמודה של 40 מעלות צלזיוס. השתמש בגלאי מערך דיודה כדי לזהות את חומצות האמינו הממוקדות ב-254 ננומטר ולחשב את הריכוזים שלהן על ידי מיפוי אזורי השיא מתחת לעקומה הסטנדרטית. במחקר זה, חומצות אמינו overproducers מזוהים באמצעות סמנים נדירים עשירים codon כדי להשיג בו זמנית דיוק, רגישות, ותפוקה גבוהה.עבור מערכת הבחירה, יש לראות ירידה חדה ב- OD600 עבור זנים המטפחים את גן עמידות לאנטיביוטיקה נדיר עשיר בקודון בהשוואה לזן המטפח את סוג הבר. העיכוב של קודון נדיר על ביטויי חלבון מתרחש בעיקר בתנאים מורעבים. לאחר האכלה נוספת של חומצת האמינו המתאימה, OD600 עבור המתח מחסה את הגן נדיר codon עשיר עמידות לאנטיביוטיקה עולה באופן משמעותי.עבור מערכת ההקרנה, עוצמת הפלואורסצנטיות במספר התאים הפלואורסצנטיים נמוכה משמעותית עבור הזן המבטא את החלבון הפלואורסצנטי מהגן הנדיר העשיר בקודון מאשר מהגן הפראי. האכלה של חומצת האמינו המתאימה תחזיר ביטויי חלבון מהגנים הנדירים העשירים בקודון. בעת שימוש בחלבון הסגול, הצבע שפותח מה-PPG הנדיר העשיר בקודון קל יותר מזה של הגן הפראי.מדיום LB לא מזוהה מאפשר ביטוי איטי של PPG נדיר עשיר codon ללא L-לאוצין האכלה בחלבון הסגול לידי ביטוי הופך גלוי פעם התאים הם גלולה. עם זאת, זה לא מסתיר את העובדה כי ביטוי גנים מן PPG נדיר עשיר codon משופרת על ידי האכלה של L-לאוצין. האסטרטגיה הנדירה המבוססת על קודון יכולה לזהות את מייצרי יתר של חומצות האמינו הממוקדות מספריית המוטציות, ומוטנטים אלה צריכים לייצר כמויות גבוהות יותר של חומצות האמינו הממוקדות מאשר זני האב.בעת ניסיון הליך זה, חשוב להתאים תדירות קודון נדירה כדי להשיג אפליה ברורה ב- OD או בצבע בין תאים המכילים את סמני סוג הבר והנגזרות הנדירות העשירות בקודון. ניתוח Transcriptome ואת רצף הגנום יכול להיות מיושם על הזנים שנבחרו כדי לחקור את המנגנון הקשורים לייצור חומצות אמינו. באמצעות טכניקה זו, חומצות אמינו overproducers יכול להיות מזוהה ביעילות וניתוח של המידע הגנטי שלהם יציע תובנות חדשות לתוך המנגנונים שלהם מאחורי חומצות אמינו overproductions.נגזרת חומצות אמינו עלולה להזיק. הקפידו ללבוש כפפות ובגדי מגן ולבצע את השלבים הבאים ברדס אדים.

identifying-amino-acid-overproducers-using-rare-codon-rich-markers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

עמותות גנטית לעתים קרובות להישאר בלתי מוסבר ברמה התפקודית. שיטה זו נועדה להעריך את ההשפעה של פנוטיפ הקשורים סמנים גנטיים על ידי ניתוח ביטוי גנים בתאים הטרוזיגוטיים SNPs עיבד. הטכנולוגיה מאפשרת מדידה מדויקת של MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה לכמת ספציפי אלל פריימר המוצרים הרחבה.

אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי

PCR בשילוב עם ניתוח ברזולוציה גבוהה להמיס (HRMA) הוא הוכיח כשיטת מהירה ויעילה לגנוטיפ דג הזברה.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

אנו מציגים פרוטוקול עבור ההערכה התפקודית של ספריות mutagenesis רווי אתר יחיד המקיפות של חלבוני ניצול רצף תפוקה גבוהה. חשוב לציין, גישה זו משתמשת זוגות פריימר מאונכים לבצע ריבוב בניית רצף ספרייה. תוצאות נציג באמצעות TEM-1 β-lactamase שנבחר במינון רלוונטי קליני של אמפיצילין מסופקות.

פרוטוקול והערכה תפקודית של ספריות mutagenesis רווית Whole-חלבון ניצול רצף תפוקה גבוהה

פרוטוקול ביטוי קל לשימוש ונטול תאים לשילוב ספציפי לשאריות של אנלוגים של חומצות אמינו לא קנוניות בחלבונים, כולל ניתוח במורד הזרם, מוצג למחקרים רפואיים, פרמצבטיים, מבניים ופונקציונליים.

שאריות ספציפיות התאגדות של חומצות אמינו Noncanonical לחלבוני דגם שימוש<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; חינם-Cell מערכת-תמלול תרגום

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת מטבוליטים מ סטפילוקוקוס והניתוח הבא שלהם באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ו ספקטרומטריית מסה.

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

ביולוגיה סינתטית מאפשר ההנדסה של חלבונים עם מאפיינים חסרת תקדים באמצעות החדרת חומצות אמינו קאנונית co-translational. . הנה, הצגנו איך spectrally אדום-העביר גרסה של fluorophore GFP-סוג עם מאפייני ספקטרוסקופיות הרומן פלורסצנטיות, הנקרא חלבון פלואורסצנטי "זהב" (GdFP), מופק ב e. coli באמצעות הלחץ הסלקטיבי ההתאגדות (SPI).

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

ניתוח אות לרעש ברמת חומצת אמינו קובע מהי השכיחות של וריאציה גנטית במיקום נתון חומצת אמינו מנורמל על רקע וריאציה גנטית של אוכלוסיה נתונה. דבר זה מאפשר זיהוי של variant "נקודות חמות" בתוך רצף חלבונים (אות) המתנשא מעל התדירות של שמתגלה נדירה באוכלוסיה (רעש).

קביעת הסבירות של Variant פתוגניות באמצעות חומצת אמינו ברמת ניתוח אות לרעש של וריאציה גנטית

תרגום ריבוזומים מפענח שלושה נוקלאוטידים לכל קודון לפפטידים. תנועתם לאורך mRNA, שנתפסה על ידי פרופיל ריבוזום, מייצרת את העקבות המציגות תקופת שלישייה אופיינית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש RiboCode כדי לפענח תכונה בולטת זו מנתוני פרופיל ריבוזום כדי לזהות מסגרות קריאה פתוחות בתרגום פעיל ברמת התמלול המלא.

De novo זיהוי של מסגרות קריאה פתוחות בתרגום פעיל עם נתוני יצירת פרופילים של ריבוזום

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תיוג חלבונים ספציפיים לסוג התא עם אזידונורלאוצין (ANL) באמצעות קו עכבר המבטא מוטציה L274G-מתיונין tRNA synthetase (MetRS*) ואת השלבים הדרושים לבידוד חלבונים ספציפיים לסוג התא המסומנים. אנו מתארים שני מסלולי מתן ANL אפשריים בעכברים חיים על ידי (1) מי שתייה ו-(2) זריקות תוך-צפקיות.

טיהור וזיהוי חלבונים ספציפיים מסוג תא מרקמות מורכבות באמצעות קו עכברים מוטנטי מתיונין tRNA Synthetase

הפרוטוקול המתואר כאן מספק הוראות מפורטות כיצד לנתח אזורים גנומיים בעלי עניין עבור פוטנציאל קידוד מיקרופרוטאין באמצעות PhyloCSF בדפדפן הגנום הידידותי למשתמש UCSC. בנוסף, מומלץ להמשיך ולחקור את מאפייני הרצף של מיקרופרוטאינים שזוהו כדי לקבל תובנה לגבי הפונקציות הפוטטיביות שלהם.

גישה משולבת לזיהוי מיקרופרוטאינים וניתוח רצף

פרוטוקול זה מתאר את השלבים החיוניים לביצוע קמפיינים לבחירת פני השטח של שמרים להעשרת וריאנטים חלבוניים הנקשרים לאנטיגן מעניין.

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

למד שיטה יעילה לזיהוי חומצות אמינו מפיקות יתר באמצעות מסמנים עשירים בקודונים נדירים. טכניקה זו מספקת דיוק, רגישות ותפוקה גבוהה בו-זמנית, ומתאימה למיקרואורגניזמים שונים.

זיהוי חומצת אמינו מפיקי יתר באמצעות נדירים-Codon-מסמנים עשירים

גלה סרטונים נוספים