Name: חזותי מבנה צומת לימפה ולוקליזציה לסלולר באמצעות Ex-Vivo Confocal מיקרוסקופ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: למדו טכניקת דימוי אקס-ויוו לבחינת אוכלוסיות תאים בבלוטות לימפה ניקוזיות באמצעות נוגדנים מסומנים בפלואורסצנטיות. השיטה שומרת על מבנה הרקמה ועל חיוניות התאים לחקר מערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי ה-NIH (R01 AI43458 to H.L.W.).

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת העמידה על בעלי חיים בבית הספר לרפואה של הרווארד ובריגהם ובית החולים לנשים, פרוטוקול 2016N000230.
1. עכברים המשמשים לניסוי
<ol><li>שימוש 8-שבוע עכברים זכר ונקבה על רקע B6 לניהול תערובת נוגדן.</li>
	<li>השתמש CX3CR1Gfp/wtCCR2rfp/wt עכברים כדי לקבוע אם לשעבר vivo שלם הדמיה בתוך יכול להיות גם להחיל על עכברי כתבת ללא מתן שילוב נוגדן, כמו גם כדי לחקור את הנוכחות של תאים mon, כולל אנטיגן הצגת תאים ו phagocytes, ואת התפוצה שלהם ב-LN. הערה: CX3CR1Gfp/wtCCR2RFP/wt לעכברים כתבת יש חלבון פלורסנט ירוק (gfp) ו חלבון פלורסנט אדום (rfp) הוכנס תחת השליטה של CX3CR1 ו CCR2 יזמים, בהתאמה. עכברים עיתונאי ניתן להשתמש עם או בלי ההזרקה של ערבוב הנוגדן. אנא ראה התייחסות4 להזרקה לערבב נוגדן בעכבר עיתונאי. המשך לניתוח אם לא ייזרקו נוגדן.</li>
</ol>2. הכנה לערבוב הנוגדן והזרקה
הערה: בצע את השלבים הבאים על עכברים שתוארו בשלב 1.1.
<ol><li>לדלל 1:10 של סגול מבריק (BV) 421 anti-CD4 (gk 1.5; 0.2 mg/ml), 1:10 של כחול מבריק (BB) 515 anti-CD19 (1d3; 0.2 mg/mL) ו-1:20 של phycoארימתרין (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0.2 mg/mL) ב PBS עם הנפח הסופי המתאים להזריק לתוך הירך הפנימית (כדי ל התמונה אינרינרית) או לתוך משטח כף היד (כדי התמונה popliteal) הלימפה. הערה: השתמש בתור איזוסוגים: BV421 Mouse IgG2b, k בקרת Isotypes (R35-38; 0.2 mg/mL); PE עכברוש IgG2a, κ בקרת איזוטיפ (R35-95; 0.2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, κ בקרת איזוטיפ (R35-95; 0.2 מ"ג/mL). אם שינוי הנוגדן מכתים, השתמש בסוג isotype נכון.</li>
	<li>כדי להפוך את התמונה בפנים, להזריק 100 μL של שילוב הנוגדן תת-עורי לתוך הירך הפנימית (איור 1A). לחילופין, הכנס 50 μL תת-עורי של מיקס נוגדן לתוך משטח כף היד לתמונה popliteal LN (איור 2A). השתמש עדין 1 mL מזרקים אינסולין, (אינסולין U-100) עם מחט של גודל 0.30 mm × 13 מ"מ (30 מד × 1/2 אינץ). הערה: ודא שהזריקה לצביעת הפנים היא תת-עורית ולא מתוך שרירי (הודעה), כמו ערבוב נוגדנים לא יירוקנו כראוי אם מנהל הודעה מבוצע.</li>
	<li>אל להרדמה בעלי חיים לפני הזרקת נוגדן ערבוב.</li>
	<li>המתן עד למינימום של 3 שעות (משנה dLN) ו-12 h (popliteal dLN) הזרקת הודעה כדי להסיר את האיברים.</li>
	<li>אם התיוג בתא אינו נצפה לחלוטין באמצעות צבעי פלורסנט גדולים כגון סגול מבריק או כחול מבריק, השתמש fluorophores קטן יותר, כולל fluorescein isothiocyanate (FITC), PE ו allophycocyanin (APC) כחלופה.</li>
</ol>3. הליך הניתוח כדי להסיר את הצומת הלימפה הניקוז
<ol><li>המתת חסד באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צוואר הרחם.</li>
	<li>לשתק עכברים על הבמה אקריליק עם דבק ולהחיל שמן מינרלי עם מספוגית כותנה לעור הבטן כדי למנוע התצהיר פרווה סביב החתך (איור 1B). אין צורך בהסרת פרווה.</li>
	<li>לבצע חתך באמצע הדרך באמצעות מספריים מעוקל מיקרו (11.5 ס מ) ו מלקחיים מעוקל מיקרו (12.5 ס מ) בבטן מן הערווה לתהליך xiphoid (איור 1C).</li>
	<li>הנתק את השרירים הבטני מהעור (איור 1D).</li>
	<li>הפוך את העור חתכים אופקיים בחלק העליון והתחתון של קו החתך האנכי כדי ליצור מדפים העור בצד של עניין (על פי הצד של הזרקת הנוגדן לערבב) והכנף את העור כדי להמחיש את הצומת לימפה (איור 1E).</li>
	<li>מקליט את העור על צלחת אקריליק (איור 1F).</li>
	<li>להסיר את הצומת הלימפה הניקוז להסרת המוח באמצעות מלקחיים מעוקל מיקרו (איור 1F). הלימפה יופיע כמו בצבע, בדרך כלל בלהה, כדור מתחת לעור.</li>
</ol>4. הליך ניתוח כדי להסיר את הצומת ניקוז לימפה popliteal
<ol><li>המתת חסד באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צוואר הרחם.</li>
	<li>לשתק עכברים במצב נוטה על הבמה אקריליק עם דבק ולהחיל שמן מינרלי עם מבער כותנה בעגל ובברך (איור 2א-ד).</li>
	<li>לבצע חתך באמצע קו בעגל מן העקב אל הברך (איור 2E, F).</li>
	<li>הנתק את שרירי השרירים של העגל מהעור (איור 2F, G).</li>
	<li>לחשוף את הפוסות פוקליטיל (איור 2G). בלוטות הלימפה של פופטיל. תופיע ככדור שחור בפוסות הפויבטיל</li>
	<li>הסר את הצומת הלימפה popliteal באמצעות מלקחיים מעוקל מיקרו (איור 2G).</li>
	<li>לחילופין, להפוך את העכבר מעל מיקום פרקדן, ולהתקרב לפוסה popliteal בין שרירי הזרוע והsemitendinosus עבור הסרת popliteal ב ידי ביצוע חתך באמצע הדרך בעגל מן העקב אל הברך ואחריו הדיסוציאציה של העגל שרירים מהעור הערה: פוליטיל פוסות הוא דיכאון רדוד הממוקם בחלק האחורי של מפרק הברך. פתח בקפידה כדי לראות את הצומת לימפה popliteal.</li>
</ol>5. הכנת צומת לימפה
<ol><li>מניחים את כל האיבר בצלחת תרבות עם תחתון זכוכית (35 מ"מ x 10 מ"מ) ולהסיר את השומן המקיף את האיבר באמצעות מלקחיים מעוקל מיקרו (איור 1G-I ואיור 2h).</li>
	<li>מרכז את האיבר באמצע המנה (איור 1J ואיור 2h).</li>
	<li>כסו את העוגב בחלק מחלונות המשימה העדינים ושמרו אותו רטוב עם טמפרטורת החדר מלוחים 0.9% או תמיסת פוספט מאגר (איור 1K-M ואיור 2h). הערה: אין צורך לשטוף בלוטות הלימפה לאחר ההסרה או לבצע את החילוץ הלימפה במכסה המנוע.</li>
</ol>6. vivo לשעבר-מיקרוסקופ קונסקופיה (הדמיה)
<ol><li>מקמו את צלחת פטרי בחריץ המיקרוסקופ ההפוך הפוך (איור 1N ואיור 2h).</li>
	<li>Lns תמונה תחת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (איור 1o ואיור 2h).</li>
	<li>ראשית, לקבל את המוקד הנכון באמצעות אור קונבנציונאלי של המיקרוסקופ קונפוקלית עם המטרה 4x או 10x. לאחר מכן לשנות מפונקציית האור למצב לייזר. הערה: אם המיקרוסקופ קונפוקלית לא מכיל מטרה 4x, המוקד יכול להיות מושגת באופן מושלם באמצעות המטרה 10x.</li>
	<li>כוונן את כוח הלייזר, היסט והרווח באמצעות מדגם isotype, שאינו מוכתם או שאינו פלורסנט (טבלה 1) כדי להסיר מכתמים אוטומטיים וכתמים לא ספציפיים מנוגדנים המסומנים ב-פלורסנט כגון אלה המשמשים בתמונות הראו ב כתב יד (BV-421 anti-CD4, BB515 אנטי-CD19 ו-PE anti-F4/80).</li>
	<li>כוונן את מיקומי ה- Z ו- XY , באמצעות מיקרומד ומרכבה, בהתאמה, על אזור העניין בצומת הלימפה.</li>
	<li>לרכוש תמונות תחת 4 x, 10x ו 20x מטרות התמקדות מבנה LN והפצה סלולרית. השתמש בהגדרה 1024 x 1024-פיקסלים. הערה: השיגו חמש תמונות לפחות בתחומים שונים לכל מטרה לכל חיה.</li>
	<li>לנתח תמונות באמצעות תוכנת תמונה כדי להפריד בין ערוצים, להוסיף קנה מידה וצבעים של עניין, ולשחזר תצוגה תלת-ממדית.</li>
</ol>

<ol><li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li>
<li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li>
<li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin%2C+Location%2C+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li>
<li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151(2018).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anais+da+Academia+Brasileira+de+Ciencias%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317(2019).</li>
<li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li>
<li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li>
<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li>
<li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li>
<li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li>
<li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li>
<li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

השילוב של הדמיה עם טכניקות אחרות, כולל ביולוגיה מולקולרית מימדי החיסונית גבוהה החיסון הגדילו את היכולת שלנו לחקור את התאים החיסוניים בהקשר המקורי שלהם. למעשה, בעוד גישות אחרות עשויות לדרוש עיכול רקמות ובידוד התא – אשר יכול להוביל לאובדן שלמות רקמות-השימוש ב vivo או ex הדמיה vivo מעניקה יתרון גדול בחקירת תת סוגים שונים בצורה גיאוגרפית3 , 16. זה לא מפתיע כי הזמינות של זנים העכבר מהונדסים גנטית שבו תאים מיועדים במיוחד fluorophores שונים הוא גדל במהירות. חשוב מכך, שי...

בלוטות הלימפה (LNs) הם איברים בצורת ovoid הנוכחי ברחבי הגוף עם הפונקציה הקריטית של גישור התגובות החיסונית מולדים ואדפטיבית. LNs לסנן את הלימפה כדי לזהות חלקיקים זרים ותאים סרטניים כדי לטעון תגובה חיסונית נגדם1. אנטיגן הצגת תאים (APCs), תאים T ו-B תאים לעבוד לצד ליצור אנטיגן ספציפי נוגדנים (חסינות הומאתית) ו ציטוטוקסיקס לימפוציטים (חסינות הסלולר) כדי לחסל את החלקיקים הזר תאים סרטניים2. כך, הבנת הדינמיקה של התאים החיסוניים נוכח במערכת הלימפה יהיו השלכות חשובות על פיתוח החיסון וחיסוני סרטן.
הופעתו של מיקרוסקופים חזק-כולל קונפוקלית וקד חדש ומיקרוסקופים רזולוציה סופר-אפשרה התקדמות יוצאת דופן בהבנת איך אוכלוסיות שונות תאים החיסונית להתנהג בסביבה הטבעית שלהם3. עכשיו זה אפשרי תמונה מספר סוגי תאים בו באמצעות שילוב של רגשים עם עכברים מהונדסים גנטית לבטא חלבונים פלורסנט תחת שליטה של יעדים ספציפיים4,5. למעשה, טכניקות ממדיות גבוהות, כולל cy, המוני וניתוחי זרימה רב-פרמטרית היו חיוניים להרחבת הידע שלנו על מידור תאים חיסוניים שונה ופונקציונליות בבריאות ובמחלות6, 7. עם זאת, כדי להכין דגימות עבור טכניקות אלה, רקמות צריך עיכול ותאים מופרדים מתוך הסביבה הטבעית שלהם להיות מנותח בתא השבולים. כדי להתעלות על מגבלות אלה ולאפשר תרגום טוב יותר בביולוגיה, המטרה של הפרוטוקול המוצע כאן היא להחיל מתודולוגיה ישירה על התמונה לשעבר vivo בלוטות הלימפה כולו באמצעות קונפוקלית מניות מיקרוסקופים עם היתרון של מהירות משופרת, רקמה שימור המבנה והכדאיות התאית בהשוואה למספר החיסונית הקונבנציונלי. באמצעות גישה זו, הצלחנו להראות כי עכברים לקוי עבור γδ T תאים, סוג של לימפוציטים T מעורב ההגנה המוקדמת מוקדם נגד פתוגנים4, יש להתפשר זקיקי ו תא T אזורי לעומת עכברים סוג פראי. ממצאים אלה אפשרו לנו להמשיך במחקר שבו הדגמנו כי תאים γδ T לשחק תפקיד קריטי הומאוסטזיס של איברי הלימפה ותגובה חיסונית ומוראלית4. יתר על כן, פרוטוקול זה מספק מסלול פיזיולוגי עבור הבדיקות והנוגדנים כדי להגיע לצומת הלימפה, כפי שהם מנוהלים תת-עורי ומתפזר באמצעות זרימת הלימפה ברקמות, בנייה על דוחות הקודם המשמשים באתרו תיוג עם נוגדנים כדי להמחיש מבנים הקשורים לימפטי8,9, מרכז מונ, דינמיקה10,11,12, ומטרות נגישים בקלות כדי זרימת הדם13 ,14,15.

<table><tbody><tr><td>BV421 anti-CD4</td><td>BD Horizon</td><td>562891</td><td>GK1.5; 0.2 מ"ג mL-1</td></tr><tr><td>BB515 anti-CD19</td><td>BD Horizon</td><td>564509</td><td>1D3; 0.2 מ"ג mL-1</td></tr><tr><td>BB515 Rat IgG2a, &kappa; בקרת איזוטיפ</td><td>BD Horizon</td><td>564418</td><td>R35-95; 0.2 מ"ג מ"ל-1</sup</td></tr><tr><td>>BV421 עכבר IgG2b, K בקרת איזוטיפ</td><td>BD Horizon</td><td></td><td>562603 R35-38 0.2 מ"ג מ"ל-1</td></tr><tr><td>Cellview צלחת תרבית</td><td>Greiner-Bio</td><td>627861</td><td>35x10 מ"מ עם תחתית זכוכית</td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין</td><td>BD פלסטיפאק-אינסולין</td><td></td> <td>U-100</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>מותג המדע Kimtech</td><td>7557</td><td>גודל 21 x 20 ס"מ / 100 גיליונות לקופסה</td></tr><tr><td>מיקרוכירורגיה מלקחיים מעוקלים</td><td>WEP מכשירים כירורגיים</td><td>בהתאמה אישית</td><td>12.5 ס"מ</td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים מיקרו-כירורגיה</td><td>WEP מכשירים כירורגיים</td><td>בהתאמה אישית</td><td>11.5 ס"מ</td></tr><tr><td>מחט</td><td>BD PrecisionGlide-30</td><td></td> <td>מד וזמנים; &frac12; אינץ'</td></tr><tr><td>ניקון Eclipse Te + A1R ראש קונפוקלי</td><td>ניקון</td><td>-</td><td>טעון ב-4 קווי לייזר עיקריים (405, 488, 543 ו-647 ננומטר)</td></tr><tr><td>PE anti-F4/80</td><td>BD Pharmigen</td><td>565410</td><td>T45-2342; 0.2 מ"ג mL-1</td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a, &kappa; בקרת איזוטיפ</td><td>BD Pharmigen</td><td>553930</td><td>R35-95; 0.2 מ"ג mL-1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td></td> <td>טעון ב-4 קווי לייזר עיקריים (405, 488, 543 ו-647 ננומטר)</td></tr></tbody></table>

חזותי מבנה צומת לימפה ולוקליזציה לסלולר באמצעות ex-vivo confocal מיקרוסקופ

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

בלוטות הלימפה (LNs) הם איברים התפשטות בתוך הגוף, שם התגובות החיסונית מולדים יכול להתחבר עם חסינות אדפטיבית. למעשה, LNs הם משולבת אסטרטגית בנתיב של כלי הלימפה, המאפשר מגע אינטימי של אנטיגנים רקמות עם כל התאים החיסוניים הקבועים ב-LN. כך, הבנת הרכב הסלולר, הפצה, מיקום ואינטראקציה באמצעות לשעבר vivo הדמיה מלאה יוסיף לידע על איך הגוף מתאם תגובות החיסון המקומי מערכתית. פרוטוקול זה מציג אסטרטגיה הדמיה vivo ex בעקבות בניהול vivo של נוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט המאפשר מתודולוגיה מאוד מאוד וקלה לביצוע באמצעות קונפוקלית יקרוסקופים קונבנציונאלי ו ריאגנטים מניות. באמצעות הזרקה תת עורית של נוגדנים, ניתן לתייג אוכלוסיות תאים שונות בניקוז LNs מבלי להשפיע על מבני רקמות שעלולים להיפגע על ידי טכניקה מיקרוסקופית החיסונית קונבנציונאלי.

כתב יד זה מראה טכניקות כדי להסיר בלוטות לימפה ומבלי לפגוע במבנה שלהם בעקבות הזרקת נוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט כדי להכתים אוכלוסיות תאים מסוימות באיברים אלה (איור 1 ואיור 2 ).
השילוב החזק של האימונויניום של תאי LN עם BV421 anti-CD4 ו BB515 anti-CD19 ו הדמיה מיקוד ניתוח הגדיר את הלוקליזציה של תאי T (CD4 +) ו B תאים (CD19 +) ב אינלירינל ו popliteal LNs. בשני האברים, התאים מוקפים באוכלוסיית תאי T (איור 3,...

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לתמונה אוכלוסיות תאים שונות בבלוטות לימפה ניקוז ללא שינויים במבנה האיברים.

חזותי מבנה צומת לימפה ולוקליזציה לסלולר באמצעות Ex-Vivo Confocal מיקרוסקופ

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

זה לשכפל וקל לבצע פרוטוקול משתמשת לשעבר vivo הלימפה צומת הדמיה אסטרטגיה כדי לעקוב אחר ניקוז של in-vivo מנוהל נוגדנים פלואורסצנטיים שכותרתו לאיברים מקומיים משניים הלימפה. הדגמת טכניקה זו מאפשרת הדמיה ספציפית של ההליך, אשר יכול להקל על ביצוע מוצלח של הפרוטוקול. זוהי טכניקה פשוטה מאוד פשוטה שיכולה להתבצע על ידי כל אחד.ההיבט המאתגר היחיד הוא הטיפול בעכבר, הדורש הכשרה מסוימת. טכניקה זו יש את היתרון של שימור מאמץ רקמת מהירות משופרת וכדאיות התא בהשוואה לשיטות הכתם פלואורסצנטי קונבנציונלי. הכשרת ההליך תהיה ברונה טייטמטסו, טכנאית מהמעבדה.לדלל את הנוגדנים של עניין, גדמו פלואורופורים המתאימים, ב 100 microliters של PBS עבור הדמיית בלוטות הלימפה inguinal, או 50 microliters של PBS עבור הדמיית לימפה popliteal. להדמיית בלוטות לימפה אינguinal, לטעון 100 microliters של קוקטייל הנוגדן לתוך מזרק אינסולין מיליליטר אחד, מצויד מד 30 על ידי מחט חצי אינץ ', ו תת עורית להזריק את הנוגדנים לתוך הירך הפנימית של העכבר הניסיוני. להדמיית בלוטות לימפה פופליטיות, הזריקו 50 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים תת עורית לתוך כרית כפות רגליים אחת של החיה הניסיונית.ואז להחזיר את החיה לקופסת הבית שלה. עבור קציר לימפה ניקוז inguinal, לאחר המתנה של לפחות שלוש שעות מן הזריקה, לשתק את העכבר על הבמה האקרילית עם סרט דבק ולהחיל שמן מינרלי על עור הבטן. השתמש במספריים מיקרו-כירורגיים סטנדרטיים ומקלפים מעוגלים מיקרו-כירורגיים כדי לבצע חתך בעור קו האמצע בבטן מהעווית לתהליך הקסיפואיד, ולנתק את שריר הבטן מהעור.בצע חתכים אופקיים בעור בחלק העליון והתחתון של קו החתך האנכי, כדי ליצור מדפים בעור בצד ההזרקה, ולחזור בו העור כדי לדמיין את צומת הלימפה. אבטחו את דש העור לצלחת האקרילית, ולהשתמש במקלות כדי להסיר את צומת הלימפה הכדורי השקוף, בדרך כלל כדורי. עבור קציר בלוטות לימפה ניקוז popliteal, לפחות 12 שעות לאחר הזריקה, לשתק את העכבר במצב נוטה על שלב אקרילי.החל שמן מינרלי על העגל והברך בצד המוזרק של החיה. לאחר מכן, לעשות חתך קו האמצע בעגל מן העקב אל הברך, ולנתק את השרירים עגל מן העור. חשוף את האפוסה הפופליטית.בלוטות הלימפה הפופליטיות יופיעו כתחום שקוף בתוך הפוסה. לאחר מכן, להסיר את בלוטות הלימפה עם מדפים מעוגלים מיקרוכירורגיה. כדי להכין את בלוטות הלימפה להדמיה, מניחים את כל האיברים בצלחת תרבות 35 על 10 מילימטר עם תחתית זכוכית, ולהשתמש במטלות כדי להסיר את כל השומן המקיף את הרקמה.מרכזים את האיבר באמצע המנה, ומכסים את הרקמה בחתיכת מגב משימה עדין ספוג מלוחים. להדמיית אקס ויוו, מקם את המנה בחריץ המיקרוסקופ הקונפוקל ההפוך ולהשתמש באור הקונבנציונלי של מיקרוסקופ הקונפוקל ובמטרה 4-10X כדי להשיג את המיקוד הנכון. עבור מתפקוד האור למצב לייזר ולהשתמש בדגימה מוכתמת איזוטופים, לא מוכתמת או לא פלואורסצנטית כדי להתאים את כוח הלייזר, לקזז ולהשיג כדי להסיר את הפלואורסצנטיות האוטומטית ואת כל הכתמים שלא צוינו.לרכוש תמונות תחת 4, 10 ו 20X מטרות התמקדות מבנה בלוטות הלימפה והפצה הסלולר באמצעות הגדרת 1024 על ידי 1024 פיקסל. לאחר מכן, השתמש בתוכנה מתאימה לניתוח דימות כדי להפריד בין הערוצים, כדי להוסיף את קנה המידה והצבעים המעניינים, ולבנות מחדש את התצוגה תלת-ממדית. השילוב רב העוצמה של immunolabeling של תאי בלוטות הלימפה עם נוגדנים נגד CD4 ואנטי CD19 וניתוח הדמיה קונפוקלים מאפשר לוקליזציה של תאי T ו- B בתוך בלוטות הלימפה inguinal.בבלוטות הלימפה popliteal, כמו ברקמה inguinal, זקיקי תא B מוקפים אוכלוסיות תא T, סימן ההיכר של מבנה בלוטות הלימפה. כפי שנצפה בתמונות אלה, phagocytes אינם מפנימים את הנוגדנים מוזרק, המציין כי הכתמת תא B ו- T הוא ספציפי. יתר על כן, שחזור מחדש של התיוג מציין כי כתמי תא T ו- B אינם חופפים, ומאשרים עוד יותר את הספציפיות של הכתמים.תאים חד תאיים נצפו לאורך כל הצומת הלימפה inguinal, כולל סינוס subcapsular. עם רוב התאים המונונוקלריים המבטאים CX3XR1, ואחריו CCR2 ו- CXCR31CCR2 תאים חיוביים כפולים. אותה תבנית של התפלגות תאים ופנוטיפים של תאים נצפתה בצומת הלימפה popliteal.שתי בלוטות הלימפה גם להפגין אזורים כהים ללא ביטוי קולטן תאים mononuclear כי הם תפוסים על ידי לימפוציטים. יתר על כן, תאים mononuclear הם נדירים בתוך האזור הפנימי של בלוטות הלימפה, נשאר מרוכז באזורים החיצוניים של הרקמה, המציין כי תאים אלה בעיקר לכבוש את הסינוס subcapsular צומת הלימפה. תערובת הנוגדנים צריכה להיות מוזרקת במדויק לתוך הרקמה התת עורית עבור מערכת הלימפה כדי לנקז כראוי את הנוגדנים לבלוטות הלימפה.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על פיזור ביולוגי של תרופות עם תווית פלואורסצנטית, ועל מחקרי מיקוד תאים של חלקיקים פלואורסצנטיים מסומנים.

visualizing-lymph-node-structure-cellular-localization-using-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שני הפוטונים הדמיה חשף תנועתיות הלימפוציטים אינטראקציות הסלולר בתוך הצומת לימפה בתנאי הבסיס, במהלך תגובה חיסונית 1. הנה, אנחנו מדגימים העברת המאמצת של תאים T, בידוד של בלוטות הלימפה, ועל תנועתיות הדמיה של CD4 + T תאים בתוך הצומת לימפה explanted.

Dissection ו 2-Photon הדמיה של בלוטות לימפה הפריפריה עכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה פלורסנט התמונה בתאי T הציג לפרוסות הלימפה. הטכניקה אישורים בזמן אמת וניתוחים של נדידת תאים T עם מסורתי widefield פלואורסצנטי או מיקרוסקופים confocal.

Ex vivo הדמיה של תאים T ב Slices צומת Murine לימפה עם widefield ו מיקרוסקופים confocal

ההתקדמות מיקרוסקופיה 2-פוטון אפשרו בזמן...

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

שיטות הדמיה שפותחו לאחרונה באמצעות פלואורסצנטי קרוב אינפרא אדום (NIRF) עשויות לעזור להבהיר את תפקיד מערכת הלימפה משחקת בהתפשטות גרורה סרטני, תגובה חיסונית, תיקון פצע, ומחלות אחרות הקשורים לימפטי.

דימות אופטי לא פולשנית של כלי דם הלימפה של עכבר

סרטון זה מדגים טכניקת דיסקציה לקצירת בלוטות לימפה מנקזות פופליטליות מהרגליים האחוריות של העכבר. בלוטות הלימפה ממלאות תפקיד קריטי בגישור בין מערכת החיסון המולדת והנרכשת, וקצירת בלוטות לימפה שלמות – עם מבנה רקמה שמור ויכולת קיום תאית – יכולה לסייע בחקר תגובות חיסוניות מקומיות וסיסטמיות.

שיטת דיסקציה לקצירת בלוטות לימפה מנקזות מורין פופליטל להדמיית Ex Vivo

ההדמיה intravital ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות משופרת עד 120 מיקרומטר עומק בבלוטות הלימפה של עכברים בוגרים מושגת על ידי מרחבית ויסות דפוס העירור של מיקרוסקופ שני פוטונים רב המוקדים. ב100 עומק מיקרומטר מדדנו החלטות 487 ננומטר (לרוחב) ו551 ננומטר (צירי), ובכך לעקוף את מגבלות פיזור ועקיפות.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

המטריצה ​​תאית עוברת שיפוץ משמעותי בריפוי פצעים, דלקות והיווצרות גידול. אנו מציגים גישה מיקרוסקופית immunofluorescence intravital רומן כדי להמחיש את הדינמיקה של סיבי, כמו גם רכיבי מטריצת רשת כמו עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה באמצעות epifluorescence או שני פוטונים במיקרוסקופ.

לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

פרוטוקול זה מתאר שיטה התמונה תושב גידולים הסתננות CD8 בתאי T עם נוגדנים fluorescently בשילוב בתוך אמבריולוגיה הגידול פרוסות תוויות. טכניקה זו מאפשרת ניתוחים בזמן אמת של נדידת תאים CD8 T באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

פרוטוקול מוצג שילוב של ניקוי רקמות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM) כדי לקבל תמונות רזולוציה תלת מימדית ותאי של כלי הלימפה ובלוטות הלימפה (LNs) איסוף נוזל המוח השדרה (CSF) ונוזל אפידורל השדרה.

הדמיה תלת מימדית של כלי הדם והניקוז הלימפטיים החולייתיים באמצעות iDISCO+ ומיקרוסקופית פלואורסצנטית גיליון אור

כאן מוצג פרוטוקול להערכת כלי הלימפה של קרום המוח בעכברים (MLVs), הממלאים תפקיד חשוב במחלות נוירולוגיות מרובות. מטרת הפרוטוקול היא לספק שיטה משולבת המאפשרת הן הערכה פונקציונלית של ניקוז העוקבים והן אפיון מורפולוגי מפורט של רשת ה-MLV הגב.

פרוטוקול משולב להערכת לימפות מנינגיאל: הזרקת סיסטרנה מגנה, הדמיית בלוטות לימפה, כריתת מנינגיאל וצביעה שלמה

למדו טכניקת דימוי אקס-ויוו לבחינת אוכלוסיות תאים בבלוטות לימפה ניקוזיות באמצעות נוגדנים מסומנים בפלואורסצנטיות. השיטה שומרת על מבנה הרקמה ועל חיוניות התאים לחקר מערכת החיסון.

חזותי מבנה צומת לימפה ולוקליזציה לסלולר באמצעות Ex-Vivo Confocal מיקרוסקופ

גלה סרטונים נוספים