חזותי מבנה צומת לימפה ולוקליזציה לסלולר באמצעות Ex-Vivo Confocal מיקרוסקופ

זה לשכפל וקל לבצע פרוטוקול משתמשת לשעבר vivo הלימפה צומת הדמיה אסטרטגיה כדי לעקוב אחר ניקוז של in-vivo מנוהל נוגדנים פלואורסצנטיים שכותרתו לאיברים מקומיים משניים הלימפה. הדגמת טכניקה זו מאפשרת הדמיה ספציפית של ההליך, אשר יכול להקל על ביצוע מוצלח של הפרוטוקול. זוהי טכניקה פשוטה מאוד פשוטה שיכולה להתבצע על ידי כל אחד.

ההיבט המאתגר היחיד הוא הטיפול בעכבר, הדורש הכשרה מסוימת. טכניקה זו יש את היתרון של שימור מאמץ רקמת מהירות משופרת וכדאיות התא בהשוואה לשיטות הכתם פלואורסצנטי קונבנציונלי. הכשרת ההליך תהיה ברונה טייטמטסו, טכנאית מהמעבדה.

לדלל את הנוגדנים של עניין, גדמו פלואורופורים המתאימים, ב 100 microliters של PBS עבור הדמיית בלוטות הלימפה inguinal, או 50 microliters של PBS עבור הדמיית לימפה popliteal. להדמיית בלוטות לימפה אינguinal, לטעון 100 microliters של קוקטייל הנוגדן לתוך מזרק אינסולין מיליליטר אחד, מצויד מד 30 על ידי מחט חצי אינץ ', ו תת עורית להזריק את הנוגדנים לתוך הירך הפנימית של העכבר הניסיוני. להדמיית בלוטות לימפה פופליטיות, הזריקו 50 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים תת עורית לתוך כרית כפות רגליים אחת של החיה הניסיונית.

ואז להחזיר את החיה לקופסת הבית שלה. עבור קציר לימפה ניקוז inguinal, לאחר המתנה של לפחות שלוש שעות מן הזריקה, לשתק את העכבר על הבמה האקרילית עם סרט דבק ולהחיל שמן מינרלי על עור הבטן. השתמש במספריים מיקרו-כירורגיים סטנדרטיים ומקלפים מעוגלים מיקרו-כירורגיים כדי לבצע חתך בעור קו האמצע בבטן מהעווית לתהליך הקסיפואיד, ולנתק את שריר הבטן מהעור.

בצע חתכים אופקיים בעור בחלק העליון והתחתון של קו החתך האנכי, כדי ליצור מדפים בעור בצד ההזרקה, ולחזור בו העור כדי לדמיין את צומת הלימפה. אבטחו את דש העור לצלחת האקרילית, ולהשתמש במקלות כדי להסיר את צומת הלימפה הכדורי השקוף, בדרך כלל כדורי. עבור קציר בלוטות לימפה ניקוז popliteal, לפחות 12 שעות לאחר הזריקה, לשתק את העכבר במצב נוטה על שלב אקרילי.

החל שמן מינרלי על העגל והברך בצד המוזרק של החיה. לאחר מכן, לעשות חתך קו האמצע בעגל מן העקב אל הברך, ולנתק את השרירים עגל מן העור. חשוף את האפוסה הפופליטית.

בלוטות הלימפה הפופליטיות יופיעו כתחום שקוף בתוך הפוסה. לאחר מכן, להסיר את בלוטות הלימפה עם מדפים מעוגלים מיקרוכירורגיה. כדי להכין את בלוטות הלימפה להדמיה, מניחים את כל האיברים בצלחת תרבות 35 על 10 מילימטר עם תחתית זכוכית, ולהשתמש במטלות כדי להסיר את כל השומן המקיף את הרקמה.

מרכזים את האיבר באמצע המנה, ומכסים את הרקמה בחתיכת מגב משימה עדין ספוג מלוחים. להדמיית אקס ויוו, מקם את המנה בחריץ המיקרוסקופ הקונפוקל ההפוך ולהשתמש באור הקונבנציונלי של מיקרוסקופ הקונפוקל ובמטרה 4-10X כדי להשיג את המיקוד הנכון. עבור מתפקוד האור למצב לייזר ולהשתמש בדגימה מוכתמת איזוטופים, לא מוכתמת או לא פלואורסצנטית כדי להתאים את כוח הלייזר, לקזז ולהשיג כדי להסיר את הפלואורסצנטיות האוטומטית ואת כל הכתמים שלא צוינו.

לרכוש תמונות תחת 4, 10 ו 20X מטרות התמקדות מבנה בלוטות הלימפה והפצה הסלולר באמצעות הגדרת 1024 על ידי 1024 פיקסל. לאחר מכן, השתמש בתוכנה מתאימה לניתוח דימות כדי להפריד בין הערוצים, כדי להוסיף את קנה המידה והצבעים המעניינים, ולבנות מחדש את התצוגה תלת-ממדית. השילוב רב העוצמה של immunolabeling של תאי בלוטות הלימפה עם נוגדנים נגד CD4 ואנטי CD19 וניתוח הדמיה קונפוקלים מאפשר לוקליזציה של תאי T ו- B בתוך בלוטות הלימפה inguinal.

בבלוטות הלימפה popliteal, כמו ברקמה inguinal, זקיקי תא B מוקפים אוכלוסיות תא T, סימן ההיכר של מבנה בלוטות הלימפה. כפי שנצפה בתמונות אלה, phagocytes אינם מפנימים את הנוגדנים מוזרק, המציין כי הכתמת תא B ו- T הוא ספציפי. יתר על כן, שחזור מחדש של התיוג מציין כי כתמי תא T ו- B אינם חופפים, ומאשרים עוד יותר את הספציפיות של הכתמים.

תאים חד תאיים נצפו לאורך כל הצומת הלימפה inguinal, כולל סינוס subcapsular. עם רוב התאים המונונוקלריים המבטאים CX3XR1, ואחריו CCR2 ו- CXCR31CCR2 תאים חיוביים כפולים. אותה תבנית של התפלגות תאים ופנוטיפים של תאים נצפתה בצומת הלימפה popliteal.

שתי בלוטות הלימפה גם להפגין אזורים כהים ללא ביטוי קולטן תאים mononuclear כי הם תפוסים על ידי לימפוציטים. יתר על כן, תאים mononuclear הם נדירים בתוך האזור הפנימי של בלוטות הלימפה, נשאר מרוכז באזורים החיצוניים של הרקמה, המציין כי תאים אלה בעיקר לכבוש את הסינוס subcapsular צומת הלימפה. תערובת הנוגדנים צריכה להיות מוזרקת במדויק לתוך הרקמה התת עורית עבור מערכת הלימפה כדי לנקז כראוי את הנוגדנים לבלוטות הלימפה.

שיטה זו יכולה להיות מיושמת על פיזור ביולוגי של תרופות עם תווית פלואורסצנטית, ועל מחקרי מיקוד תאים של חלקיקים פלואורסצנטיים מסומנים.