Name: Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: חקור אינטראקציות בין פתוגנים לאפיתל מעי באמצעות שכבות יחיד של קולונואידים אנושיים. פרוטוקול זה מאפשר חקר ביולוגיית רירית ואינטראקציות מארח-פתוגן ברמת התא והביוכימיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH P01 AI125181 K01 DK106323 (JGI), K01 DK113043 (JFA). אנו מודים Kaper ג'יימס (אוניברסיטת מרילנד, בולטימור, MD, ארצות הברית) על מתן e. coli זן HS ו- EHEC. אנו גם להכיר פיזיולוגיה משולב של הדמיה ליבות של הופקינס Conte העיכול המחלה הבסיסית ואת מרכז הליבה של המחקר Translational (P30 DK089502) ג'ונס הופקינס ספקטרומטריית ואת פרוטאומיקס הליבה.

פרוטוקול זה מבוסס על מחקרים שפורסמו בעבר על-ידי המחברים. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 השלבים הבאים צריך להתבצע בארון סטרילי אבטחה באמצעות טכניקות aseptic נאותה. כל השיטות מעורבים דגימות האנושי אושרו על-ידי המוסדיים סקירה לוח של ג'ונס הופקינס הספר לרפואה של אוניברסיטת (IRB NA_00038329).
1. מעיל תא מוסיף תרבות עם מטריצה חוץ-תאית
<ol><li>להכין 5 מ של מלאי הקולגן הרביעי פתרון (1 מ"ג/מ"ל) חומצה אצטית 100 מ מ. תן לעמוד ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ 4 שעות באופן מלא מימה/להמיס.</li>
	<li>Aliquot הקולגן הרביעי במניה פתרון ולאחסן ב 4 ° C (≤ 1 חודש) או-20 ° C (> 1 חודש).</li>
	<li>מייד לפני ציפוי, לדלל את הקולגן הרביעי הפתרון מלאי במים כיתה תרביות רקמה סטרילי כדי ריכוז סופי של 34 μg/mL. לצלחת 24-ובכן תרבית תאים מוסיף, מעיל אחד הכנס עם 100 μL של פתרון, המתאים μg/cm 102.</li>
	<li>דגירה על צלחת תקן CO2 תרביות רקמה חממה ב 37 ° C עבור ≥ 2 h, או לנוחות, לאטום את הקצוות צלחת עם סרט פרפין, דגירה בשבוע לילה או 1 עד 4 ° C.</li>
</ol>2. לבודד את enteroids/colonoids מתרבות תלת-ממד
הערה: Enteroids או colonoids הן נוצרו מתורם ביופסיות ומתוחזק בתרבות 3D על פי פרוטוקולים סטנדרטיים שתואר קודם לכן. 14 , 18 . בקצרה, כוכים נקצרים מן ביופסיות מעי או כריתות דרך קלאציה ועצבנות מכני. כוכים, שנקטפו, שטופים מצופה ב BMM. התרחבות המדיה (שמתואר בשלב 4.2) להוסיף את התרבות, הוחלפו כל יומיים. היווצרות תרבות 3D מוצגת בתוך שעות לאחר ציפוי.
<ol><li>האחות המדיום תרבות מהצלחת 24-ובכן ולהחליף עם פתרון האיסוף כקרח 1 מ"ל (ראה טבלה של חומרים) לכל טוב.</li>
	<li>להשתמש במגרדת תא מיני כדי לסלק הפרידות בגדר מטריקס קרום המרתף, תוך תשומת לב מיוחדת לכל חומר סמוך לקצות היטב.</li>
	<li>להתסיס על הלוחית תפקודי לב / כ 200 סל ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות.</li>
</ol>3. מביצועם enteroids תלת-ממד/colonoids
<ol><li>להשתמש על פיפטה ערוץ אחד P200 או פיפטה רב ערוצית מצוידים עם טיפים מסנן סטרילי כדי triturate התליה תא.</li>
	<li>מאגר של suspension(s) תא בבקבוקון חרוט 15 מ"ל. השתמש בקבוקונים מרובים אם אמצעי האחסון השעיה טוטאלית > 6 מ.</li>
	<li>הוסף אמצעי שווה של מדיום DMEM/F12 מתקדם המכיל 10 מ מ HEPES, dipeptide-alanyl-L-גלוטמין (1 x) ו פניצילין-סטרפטומיצין (1 x) (שטיפת בינוני). היפוך ברכבת התחתית 3 - 4 פעמים כדי לערבב. צנטריפוגה 300 x גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס.<ol>
<li>באופן אופציונלי, תשאף המדיום לשטוף ולהחליף עם 0.5 mL/טוב טריפסין (ראה טבלה של חומרים). Resuspend colonoids עם פיפטה P200, קאפ הצינור והציבו באמבט מים 37 ° C כ 2 דק מיד להסיר את הצינור, שטיפת בינוני להוסיף נפח סופי של 10 מ"ל, וחיזרו את צנטריפוגה כמו שלב 3.3. הערה: שלב זה עשוי להיות עדיף אם trituration הוא לא וכתוצאה מכך שברים בגודל אחיד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ציפוי המתלה enteroid/colonoid
<ol><li>אם הוספת מצופה אוחסנו ב 4 ° C, equilibrate של °C/5% CO2 תרביות רקמה חממה 37 במשך לפחות 30 דקות לפני ציפוי התא.</li>
	<li>עבור כל הוספה להיות מצופה, להכין 1 מ"ל חמים (בין 25-37 מעלות צלזיוס) הרחבה בינונית (EM) ולהוסיף 10 μM Y-27632 ו- 10 μM ח'יר 99021. הערה: EM מורכב של מתקדם DMEM/F12 המכיל B27 (1 x), 50% WNT3A ממוזגים בינוני, 15% RSPO1 ממוזגים בינונית, 10% Noggin ממוזגים בינוני, 50 ng/mL האנושי EGF, 500 ננומטר A-83-01, 10 μM SB 202190, אנטיביוטיקה/antimycotic קוקטייל (1 x), 10 מ מ HEPES, Dipeptide-alanyl-L-גלוטמין (1 x), פניצילין-סטרפטומיצין (1 x) (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>האחות המדיום שטיפת מהצינור המכיל בגדר תא, resuspend באמצעי אחסון של EM מספיק להניב μL לפחות 100/הוספה.</li>
	<li>האחות הפתרון הרביעי קולגן מן כל הוספה, לשטוף פעמיים עם 150 μL של המדיום שטיפת לכל הוספה.</li>
	<li>Pipet 600 μL של EM אל החלל מתחת כל הוספה.</li>
	<li>Pipet 100 μL תא השעיה לתוך כל הוספה.</li>
	<li>להחזיר את הצלחת החממה תרביות רקמה ולהשאיר ללא הפרעה במשך לפחות 12 שעות. הערה: להימנע טלטולים או בחדות הטיית הלוח כדי למנוע הפצה אחידה של colonoid קטעים על קרום הוספה.</li>
	<li>לפקח על הקובץ המצורף תא והפצת כדי ליצור טפט confluent על ידי הצבת את הצלחת על מיקרוסקופ אור שלב-ניגודיות תחת 2.5 x-10 x עדשה אובייקטיבי.</li>
	<li>לאחר 1-2 ימים, שברי רוב צריך לדבוק קולגן המטריצה. לרענן את המדיום תרבות, להפסיק את הטיפול עם Y-27632 ועם ח'יר 99021. להמשיך לרענן את המדיום כל 2-3 ימים עד confluent. Confluency נגיש בדרך כלל ב- 7-10 ימים.</li>
</ol>5. מדד transepithelial ההתנגדות החשמלית
<ol><li>לצרף את הפניות אלקטרודה והכוח -voltohmmeter אפיתל (EVOM). ודא כי הפונקציה מדידה מוגדר אוהם.</li>
	<li>טובלים את הטיפים אלקטרודה בקצרה ב-70% אתנול, לנגב היבש עם טישו מעבדה. Equilibrate האלקטרודה ב 5 מ של שטיפת בינונית במשך כ 5 דקות.</li>
	<li>לטבול את קצה האלקטרודה קצר יותר במדיום הוספה, אוריינט קצה האלקטרודה יותר לתוך הלוח התחתון טוב. לשמור על האלקטרודה בכיוון אנכי מלא עד הקריאה EVOM יציב יחסית, או לא יותר מ- 60 s. הערה: אם מכלול אלקטרודת מטים רחוק אנכי, או גובה הטיפ מכוונן באופן לא תקין, הטיפ קצר יותר עשוי לבוא במגע עם ולשבש את טפט תא.</li>
	<li>השוואת מידות EVOM את הערך המתקבל הוספה ללא התא שקועים תרבות בינוני כדי להעריך את ההתקדמות לקראת confluency או בידול.</li>
</ol>6. הבידול של monolayers enteroid/colonoid confluent
<ol><li>להחליף אותם בידול בינוני (DM), להמשיך לרענן מדיה בכל יומיים עד היום 5. זה DM EM חסר WNT3A, RSPO1, A-83-01, SB 202190.</li>
	<li>נמשיך לעקוב TER לוודא בידול הוא הליך כצפוי. טר ימשיכו להגדיל בימים 1-5 של בידול. Monolayers יכול להמשיך להגדיל טר, שומרים על הכדאיות מעבר יום 5-6 אבל התערוכה מקסימלית וללא ביותר לשחזור תוצאות בעת שימוש ביום 5-6.</li>
</ol>7. זיהום חיידקי עם commensal או פתוגניים החיידק
<ol><li>יום אחד לפני ביצוע הזיהום, לרחוץ ולהאכיל monolayers עם EM או DM תרופתיים.</li>
	<li>השתמש לולאה מיקרוביולוגיה סטרילי כדי לגרד את פני השטח של מניה גליצרול חיידקי קפוא ובעדינות לחסן 2 מ ל מרק ליברות. העברת הצינור תקן רועד חממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12-16 h.</li>
	<li>לדלל 50 μL של התרבות starter לתוך מרק LB טרי מ ל (1: 100) ולהמשיך הדגירה ברעידות במשך 90 דקות. זה תניב תרבות שלב יומן עם צפיפות של 105-106 המושבה יוצרי יחידות (cfu) / mL.<ol>
<li>באופן אופציונלי, לאשר את ריכוז חיידקי על ידי מדידת צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) בספקטרופוטומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ספין למטה התרבות חיידקי ב g x 12,000 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend לחיידקים תרופתיים EM או DM ריכוז סופי של 107 cfu/mL.</li>
	<li>להוסיף 10 μL של חיידקי השעיה תותב (הריכוז הסופי 106 cfu/mL). Pipet לאט כדי לערבב להימנע מהפרעה בשכבת ריר חוץ-תאית.</li>
	<li>להחזיר את הצלחת חממה תרביות רקמה עבור התקופה זיהום הרצוי.</li>
</ol>8. קיבוע כדי לשמר, immunostain ריר
<ol><li>מעלית התרבות התא מוסיף מהצלחת 24-ובכן, היפוך בקפידה על נייר טישו מעבדה כדי להסיר את המדיום הפסגה, ותנגב נמצא נוזל חיצוני נצמדים תותב.</li>
	<li>בצלחת. ובכן 24 חדשים, לטבול את תותב בריכוז 1:3 של חומצה אצטית באתנול מוחלטת (פתרון של קלארק) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>היפוך של הוספה כדי להסיר את מקבע נתרענן התאים ב- PBS x 1 עבור 10 דקות להמשיך עם פרוטוקולים סטנדרטיים immunostaining.</li>
	<li>השימוש סכין גילוח לחתוך מסביב להיקף של קרום הוספה. להעביר את הקרום לשקופית מיקרוסקופ זכוכית באמצעות מלקחיים, ולהצמיד של coverglass הרכבה בינונית.</li>
</ol>9. הכנה של תא lysates immunoblotting
הערה: בצע את השלבים הבאים על קרח או בחדר קר.
<ol><li>וביופסיה בינונית, שטיפת הכנס פעם עם PBS.</li>
	<li>להוסיף 150 μL פירוק מאגר המכיל פרוטאז מעכבי (ראה טבלה של חומרים) הכנס, מעצור 5-10 דקות פירוק המאגר מכיל 50 מ מ טריס pH 8, 150 מ מ NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0.5% נתרן deoxycholate, 0.1% מרחביות, מעכבי פרוטאז מטריים קוקטייל.</li>
	<li>להשתמש במגרדת תא מיני כדי להסיר התאים תותב ולאחר מכן השתמש פיפטה P200 כדי triturate בקצרה את ההשעיה ואת העברת צינור microcentrifuge.</li>
	<li>Sonicate את הבולם עם 5 x 1 s פולסים במהירות משרעת 20% באמצעות microtip של בדיקה (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להוסיף מאגר מרחביות-דף הטעינה אם מיד מבצע אלקטרופורזה, או aliquot ולאחסן lysates ב-20 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mini-guts%3A+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, 633-642 (2016).</li>
<li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+stimulates+a+complex+physiological+response+in+the+immature+human+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium.</a> eLife. 6, e29132(2017).</li>
<li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6, 301-319 (2018).</li>
<li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+and+Toxin+Production+by+Clostridium+difficile+within+Human+Intestinal+Organoids+Result+in+Disruption+of+Epithelial+Paracellular+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Persistence and Toxin Production by Clostridium difficile within Human Intestinal Organoids Result in Disruption of Epithelial Paracellular Barrier Function.</a> Infection and Immunity. 83, 138(2015).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids+as+a+Model+of+Upper+Small+Intestinal+Ion+Transport+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids as a Model of Upper Small Intestinal Ion Transport Physiology and Pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150, 638-649.e638 (2016).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+and+Differentiation-Associated+Alterations+of+Anion+Secretion+in+Human+Duodenal+Enteroid+Monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis and Differentiation-Associated Alterations of Anion Secretion in Human Duodenal Enteroid Monolayers.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 591-609 (2018).</li>
<li>Tse, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohemorrhagic+E.+coli+%28EHEC%29%E2%80%94Secreted+Serine+Protease+EspP+Stimulates+Electrogenic+Ion+Transport+in+Human+Colonoid+Monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Enterohemorrhagic E. coli (EHEC)—Secreted Serine Protease EspP Stimulates Electrogenic Ion Transport in Human Colonoid Monolayers.</a> Toxins. 10, 351(2018).</li>
<li>Jabaji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+collagen+gel+as+an+alternative+extracellular+matrix+for+the+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+murine+small+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 19, 961-969 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewing+Monolayer+of+Primary+Colonic+or+Rectal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Self-renewing Monolayer of Primary Colonic or Rectal Epithelial Cells.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4, 165-182 (2017).</li>
<li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7, 818-828 (2014).</li>
<li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64, 911(2015).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell%E2%80%93derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell–derived human enteroids.</a> Science. 353, 1387(2016).</li>
<li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Human+and+Mouse+Intestinal+Epithelial+Cell+Monolayer+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform.</a> Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).</li>
<li>In, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+Reduces+Mucus+and+Intermicrovillar+Bridges+in+Human+Stem+Cell-Derived+Colonoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2, 48-62 (2016).</li>
<li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+human+macrophage-enteroid+co-culture+model+to+investigate+mucosal+gut+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions.</a> Scientific Reports. 7, 45270(2017).</li>
<li>Vernetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Coupling+of+Human+Microphysiology+Systems%3A+Intestine%2C+Liver%2C+Kidney+Proximal+Tubule%2C+Blood-Brain+Barrier+and+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional Coupling of Human Microphysiology Systems: Intestine, Liver, Kidney Proximal Tubule, Blood-Brain Barrier and Skeletal Muscle.</a> Scientific Reports. 7, 42296(2017).</li>
<li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterotoxigenic+Escherichia+coli+is+phagocytosed+by+macrophages+underlying+villus-like+intestinal+epithelial+cells%3A+modeling+ex+vivo+innate+immune+defenses+of+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Enterotoxigenic Escherichia coli is phagocytosed by macrophages underlying villus-like intestinal epithelial cells: modeling ex vivo innate immune defenses of the human gut.</a> Gut Microbes. 9, 382-389 (2018).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Expansion+of+Epithelial+Organoids+From+Human+Colon%2C+Adenoma%2C+Adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Johansson, M. E. V., Sjövall, H., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gastrointestinal+mucus+system+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The gastrointestinal mucus system in health and disease.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10, 352-361 (2013).</li>
<li>Hews, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+StcE+metalloprotease+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+reduces+the+inner+mucus+layer+and+promotes+adherence+to+human+colonic+epithelium+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The StcE metalloprotease of enterohaemorrhagic Escherichia coli reduces the inner mucus layer and promotes adherence to human colonic epithelium ex vivo.</a> Cellular Microbiology. 19, e12717(2017).</li>
<li>Laurie, G. W., Leblond, C. P., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+type+IV+collagen%2C+laminin%2C+heparan+sulfate+proteoglycan%2C+and+fibronectin+to+the+basal+lamina+of+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and fibronectin to the basal lamina of basement membranes.</a> The Journal of Cell Biology. 95, 340(1982).</li>
<li>Timpl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+organization+of+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Macromolecular organization of basement membranes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 8, 618-624 (1996).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10, 1886-1890 (2010).</li>
<li>Ishii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+colonic+epithelium+adheres+to+carcinoembryonic+antigen+and+type+IV+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Normal colonic epithelium adheres to carcinoembryonic antigen and type IV collagen.</a> Gastroenterology. 106, 1242-1250 (1994).</li>
<li>Moore, R., Madri, J., Carlson, S., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagens+facilitate+epithelial+migration+in+restitution+of+native+guinea+pig+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Collagens facilitate epithelial migration in restitution of native guinea pig intestinal epithelium.</a> Gastroenterology. 102, 119-130 (1992).</li>
<li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Organ-on-a-Chip+Models+of+Human+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Organ-on-a-Chip Models of Human Intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 659-668 (2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרמטרים קריטיים עבור מוצלחת היווצרות enteroid/colonoid monolayers כוללים 1) בריא, מתרבים 3D תרבויות חומר המוצא כמו; 2) ציפוי המשטח הוספה תא תרבות קולגן אנושי הרביעי לפני טפט זריעה; 3) פיצול של תלת-ממד תרבויות או מכנית או enzymatically, אך לא את רמת תא בודד.
במהלך בידוד של תלת-ממד enteroids/colonoids, מהירות אופטימלית חזק יכול להשתנות בהתאם קוטר הסיבוב של מודל שאכר נתון. הכוונה היא לא רק להתסיס את הצלחת של ערבוב יעיל, אבל גם למנוע מתיז התליה תא בשער צלחת או לתוך בארות סמוכים. פרקי זמן דגירה של < 30 דקות, תניב BMM שיורית נצמדים תאים, אשר יכול לעכב מצורף ועל היווצרות monolayers תא אחיד כאשר מצופה במוסיף. הדגירה נרחב (≥ 1 h) תניב הכדאיות תא ירד משמעותית.
היקף trituration נדרש מביצועם enteroids תלת-ממד/colonoids יכול להשתנות עם בוכנה קשיחות ומשתמש מיומנות. בדיקה תקופתית של תוכן טוב על מיקרוסקופ אור ניגודיות שלב מומלץ לקבוע אחידות פרגמנט במהלך trituration, עם מטרה של תאים כ-30 לכל קטע. במקום, או בנוסף trituration, ההשעיה יכול להיות מתעכל בקצרה עם טריפסין להשיג שברים קטנים יותר אחיד. תקציר טריפסין עשוי להיות רצוי אם monolayers מכילים אחוז גדול של מבנים דמויי תלת-ממד בין שכבת האפיתל יחידה אחרת. עם זאת, דיסוציאציה לתאים יחיד אינו רצוי כמו פעולה זו מפחיתה באופן משמעותי תא הכדאיות. אחד טוב של enteroids/colonoids תרבותי ב- droplet BMM 35 μL בדרך כלל יהיה מספיק כדי לאכלס מוסיף 2-3, אך גורם זה יכול להשתנות בהתאם המספר ואת גודל ממוצע של enteroids/colonoids.
Colonoid monolayers עלול לספוג נפח משמעותי של המדיום הפסגה כפי שהם להבדיל. זה יכול להיות עקפו על-ידי החלת מיט נוספים אל התא העליון הוספה (150-200 μL), למרות ייבוש של התא העליון אינו מופיע להשפיע לרעה על הכדאיות טפט או פונקציה במבחני במורד הזרם. לאחר כ 4-5 ימים של בידול, לפתח colonoid monolayers ריר חוץ-תאית, שעשויים להיות גלוי כמו חומר ג'לטיני/עבה על פני התא לאחר השאיפה זהיר של DM.
עבור EHEC אינטראקציה עם השכבה החיצונית ריר, אנו משתמשים באופן שגרתי כייל נוגדנים ותקופת הדגירה חיידקי שבהם צוין בפרוטוקול. עם זאת, כדאי בתחילה לבדיקה זני חיידקים ייחודי-מספר ריכוזים ותקופות הדגירה כדי לקבוע את הפרמטרים המתאימים עבור האפקט הרצוי.
במהלך קיבוע ריר, כ רפה בעברית המדיום הפסגה סביר יסיר רוב השכבה ריר כעיגולים בצבע חוץ-תאית. לכן, חשוב שופכים בזהירות את המדיום. אם המדיום נשמר ב- תותב על ידי מתח פנים, להשתמש בפינת ממחטה מקופלת מעבדה כדי לשבור את המתח משטח לפתיל רוב המדיום. לאחר קיבוע מכתים, בשכבת ריר שניתן מבלי משים יצא ממקומו או שיטוח בזמן הרכבה של coverglass מעל המסנן ' הוספה '. כדי לשמר את גובה ריר, למקם את המסנן על טיפה של הרכבה מדיה ומניחים בזהירות את coverglass על המסנן. אין הקש או לחץ כלפי מטה coverglass כמו זה ייתכן לשטח באופן משמעותי את שכבת הריר.
כדי ליצור של טפט מקוטב מתאי בתרבות 3D, זה הכרחי לשחזר את האינטראקציה בין basolateral אינטגרינים קרום תאי אפיתל המעי וחלבונים מטריצה חוץ-תאית (ECM). Laminin, קולגן הרביעי, fibronectin, מערך proteoglycans מהווים את ECM אפיתל המעי. 21 , 22 . אנחנו לעומת laminin נגזר התא האנושי, fibronectin, קולגן IV ו מאתר נגזר BMM כמו ציפוי הוספה. רק קולגן הרביעי נתמך היווצרות של יציבה, לטווח ארוך (עד 4 שבועות) enteroid/colonoid confluent monolayers (דמויות 1-2). כתמים קטנים של גדילה דמוי טפט התקבלו על כל אחד מטריצות אחרים שנבדקו, אולם אזורים אלה נכשל להתקדם confluency. השתמש של קולגן אנושי הרביעי פונדקאית ECM יש מספר יתרונות. BMM נגזר מן Engelbreth-הולם-נחיל ועובדיו סרקומה מאתר התאים אינם ממקור אנושי, ואילו קולגן אנושי הרביעי הוא זמין מסחרית, בדרך כלל חסכונית יותר. בנוסף, BMM היא תערובת מורכבת של חלבונים עם השתנות הטבועה, עשויים להכיל גורמי גדילה מופרש על ידי סרקומה להשפיע על ביטוי גנים. 23
אינטראקציות בין תאי אפיתל המעי ECM הבסיסית בפיצוי אפיתל המעי עדיין שהיישום מובנת. המשמעות של קולגן הרביעי, אבל לא laminin, כמו ליגנד אדהזיה colonocytes אנושי24 , וריח של קריפטה מעיים תאים אפיתל פיצוי25 כבר הציע באמצעות נוגדנים נגד קולגן הרביעי שמנעה קובץ מצורף . הביע בשחלה אפיתל β1-אינטגרין מופיע להיות חשובה עבור אינטראקציה ECM, כפי נוגדן ספציפי β1-אינטגרין חסם משמעותי הידבקות של colonocytes להקליד הרביעי קולגן. 24 בעוד קולגן הרביעי מספק ECM אמין עבור enteroid/colonoid טפט היווצרות על מוסיף, אפיתל שיפוץ של ECM לאורך זמן לא עדיין הוערך במודל זה, וגם יש את ההשפעה של תערובות ECM יותר מורכב ויותר מוגדרים של קולגן הרביעי, laminin ו- fibronectin.
Enteroids/colonoids האנושי בתבנית חד שכבתי (דמויות 1-4) להפעיל מניפולציות, דיגום זה יהיה מסורבל או בלתי אפשרי להשיג באמצעות תרביות 3D matrix-מוטבע. Enteroids תלת-ממד/colonoids משתנים בגודלם, מבנה, נפח luminal, ובכך microinjection של חיידקים או מולקולות קטנות קשים במדויק quantitate. בנוסף, בניגוד monolayers (טבלה 1), תרבויות 3D למנוע גישה ישירה שני luminal ו- basolateral למשטחים למדוד יונים, חומרים מזינים, ציטוקינים או על ידי גורמים הקשורים תהליכים הפיזיולוגיות או pathophysiologic . Confluency (ספרות 1-2) הוא אחד המאפיינים העיקריים של enteroid/colonoid חד שכבתי הכרחי עבור הקמת לא רק מעברי הצבע הפיזיולוגיות של חומרים מזינים, יונים, אחרים מקרומולקולות,16 אבל גם יוצר המכשול נכונה בין luminal microbiota mesenchymal/החיסון סטרילי מאוכלס תא סביבות serosal. אלו היבטים חשובים לשקול עבור מחקרים עתידיים המשלבים monolayers enteroid/colonoid עם סוגי תאים mesenchymal, המערכת החיסונית או עצביים לבנות מודלים פיזיולוגי מורכב יותר.
ציין מגבלות של תרבות תא הוספה המודל המתואר כאן כוללים חוסר כוחות פיזיים כגון גזירה נוזלים ודחיסת מכני מתיחה / (הפריסטלטיקה), היעדר סביבה אנאירובית הפסגה מנוסים בדרך כלל על ידי מעיים epithelia ויוו. רכיבים אלה יש פוטנציאל יטופל עם פלטפורמות microphysiological מתוחכמים יותר,26 , אבל הם גם לדרוש הוצאות נוספות, ציוד ומומחיות ליישם. תרבויות 3D והן חד שכבתי הם גם ללא אינטראקציות עם או תרומות microbiome מעיים של אוכלוסיית תאי סטרומה, המערכת החיסונית אלא אם רכיבים אלה מתווספים בכוונה.
יישומים עתידיים של טפט enteroid/colonoid על קולגן תאים מצופים הרביעי תרבות מוסיף עשויים לכלול מחקרים אחרים של אינטראקציה חיידקים פתוגניים או commensal, ספיגת תרופה או חומר מזין, רעילות, חילוף החומרים, הפונקציה מכשול, פונקציונלי שיפור על ידי תרבות משותפת עם סוגי תאים מעיים נוספים. הערכות יכולה להיעשות לא רק בתוך epithelia של תורמים בריא, אלא גם מאנשים עם מוטציות גנטיות או הפרעות במעיים, בתנאי הפנוטיפים ויוו נקבעו יישמרו ב- ex-vivo enteroid/colonoid תרבות.

Organoids מעיים, enteroids ו- colonoids הובילו להתקדמות רבות להבנת התנהגות תאי גזע, מעיים, הפונקציה מכשול/תחבורה ופיתוח התמיינות. 1 . אולם, תרבות 3D מגביל המחקר של המארח פתוגן-אפיתל אינטראקציה כי לומן אינם נגישים ישירות חיידקים או התקפה אלימה גורמים אלא אם המבנים סגורים. נתונים microinjection. 2 , 3 . בנוסף, מופרש חומרים כגון מולקולות קטנות, חלבונים, או ריר לא ניתן לטעום בקלות מתרבות 3D לניתוח במורד הזרם. ההשפעה של סוכני פתוגניים על מחסום האפיתל פונקציה4 ויון תחבורה5 יוערכו בתרבות תלת-ממד באמצעות צבעי פלורסנט, מיקרוסקופיה זמן לשגות, אבל monolayers גדל על תרביות רקמה חדיר תומך נתונות שיטות נוספות כגון TER מדידה ורישום קלאמפ קאמרית/מתח Ussing. 6 , 7
פרסומים רבים תיארו פרוטוקולים עבור תרבות 2D או טפט של enteroids/colonoids. חומרים שנמצאו כדי לקדם תאים אפיתל מצורף כוללים קולגן hydrogels, ג'לטין 0.1%8,9 ,10 דק-שכבה מאתר קרום המרתף סרקומה-derived מטריצה (BMM),11,12, 13 ו קולגן אנושי הרביעי. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 זריעת גישות לכלול מכני פיצול על-ידי pipetting6,14,15 ו/או דיסוציאציה של גורמים אדהזיה התא באמצעות טריפסין,10,11 dispase,13 או EDTA. 9 כמה פרוטוקולים להשתמש תרביות רקמה שאינו נקבובי plasticware זריעה, אבל זו מגבילה את הגישה basolateral, אז מרבית היישומים תלויים מוסיף חדיר תרביות רקמה. תיעוד של טפט confluent יציבה היווצרות ותחזוקה משתנה מאוד בין הפרסומים. בנוסף, יצירות מדיה בהתפתחותם התרבויות האנושיות משתנים בין הקבוצות השונות ולהמשיך להתפתח כאשר חוקרים יותר לאמץ ולהתאים את המתודולוגיה כדי להתאים את היישום שלהם ואת המשאבים הזמינים.
כדי לטפל המגבלות של תלת-ממד תרבות אפיתל המעי במחקרים אינטראקציה פתוגן-פונדקאי, אנו מציגים עבור המרת תלת-ממד אנושי enteroids או colonoids טפט פרוטוקול ששונה. לאחר השגת confluency במצב לא בשלה כמו קריפטה, נסיגה של גורמי גדילה WNT3A, RSPO1, את מעכבי A-83-01 ו- SB 202190 מוביל בידול נציג של סיסי מעיים קטן או משטח אפיתל המעי הגס. אנו מתארים את מטריקס אידיאלי, קולגן אנושי הסוג הרביעי, כדי להרגיע את הכיסויים ולקבל שברים enteroid או colonoid אחיד עבור ציפוי. נדגים את פרוטוקול זה מייצר של טפט confluent עם גבוה TER. Colonoid monolayers מפרישים ריר סמיך הפסגה שכבה, ומאפשר ללימודים לשעבר vivo של פתוגן-ריר אינטראקציה באמצעות immunoblotting או immunostaining. גם מתואר הליך קיבוע ששונה כדי לשמר את שכבת הריר חוקן עבור immunostaining. שיטה זו שואפת לספק מודל צייתן ללמוד את האינטראקציות פתוגן-פונדקאי מעיים המוקדם על זיהום.

<table><tbody><tr><td>2-אמינו-2-(הידרוקסימתיל)-1,3-פרופנדיול</td><td>סיגמא</td><td>T4661</td><td>בסיס טריס, רכיב של מאגר ליזה</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>מעכב טוקריס</td><td>2939</td><td>ALK4/5/7</td></tr><tr><td>חומצה אצטית, קרחוני</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A38</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>רכיב של מדיום גידול</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td>בדיקה פלואורסצנטית לקוקטייל</td></tr><tr><td>אנטיביוטי/אנטי-פטרייתי</td> F-actin <td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td>פרימוצין (100x)</td></tr><tr><td>B27, 50x</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>רכיב של מדיום גידול</td></tr><tr><td>תרבית תאים מוסיף</td><td>קורנינג</td><td>3470</td><td>טרנסוול, קרום PET, 0.4 &mu; m נקבוביות, צלחת 24 בארות</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>GSK3&beta; מעכב</td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td><td>Life Technologies</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV, משליה אנושית</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td><td>Trevigen</td><td>3700-100-01</td><td>Depolymerizes מטריצת</td></tr> <tr><td>קרום הבסיסEnterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)</td><td>מעבדת קאפר, אוניברסיטת מרילנד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אפיתל וולטוממטר</td> מכשירים <td>מדויקים עולמיים</td><td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודה של וולטוממטר אפיתל</td> World <td>Precision Instruments</td><td>STX3</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli זן HS</td><td>Kaper מעבדה, אוניברסיטת מרילנד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול, מוחלט</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave הרכבה בינונית</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td>להרכבת קרום הכנס על שקופית מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 מ"מ</td></tr><tr><td>HEK293T/Noggin-Fc קו תאים</td><td>מעבדת ואן דן ברינק, מכון Tytgat לחקר</td><td></td> הכבד והמעיים <td>לייצור קו</td></tr><tr><td>תאים בינוני HEK293T/RSPO1-Fc-HA ממוזג</td><td>Noggin Trevigen</td><td>3710-001-K</td><td>לייצור מדיום מותנה Rspondin-1</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>רכיב של מדיום גידול</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1R צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר</td><td>75004250</td><td></td>מדעי</tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>פלואורסצנטי צבע גרעיני</td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמלי אנושי (EGF)</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-01M</td><td>רכיב של מדיום גידול</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>רכיב של מאגר ליזה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור תרבית תאים הפוכה</td><td>אולימפוס</td><td>CKX51</td><td></td></tr><tr><td>LB מרק</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים L-WNT3A</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td>לייצור מדיום מותנה Wnt3a</td></tr><tr><td>מטריג'לגורם גדילה מופחת</td><td>קורנינג</td><td>356231</td><td>מטריצת ממברנת הבסיס לתרבית תלת מימד</td></tr><tr><td>מגרד תאים מיני נוגדן</td><td>United BioSystems</td><td>MCS-200</td><td></td></tr><tr><td>MUC2, עכבר חד שבטי</td><td>Abcam</td><td>ab11197</td><td>השתמש ב-1:100 לצביעה חיסונית, 1:500 לאימונובלטינג</td></tr><tr><td>MUC2 shRNA חלקיקים לנטי-ויראליים</td><td>GE Dharmacon</td><td></td><td>RHS4531-GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583</td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>Grant Instruments</td><td>PSU-10i</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין, 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>רכיב של מדיום גידול</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח קורנינג</td><td>21-031</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור בדיקה עם מיקרוטיפ</td><td>ברנסון אולטרסאונד</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז לתאי יונקים</td><td>סיגמא</td><td>P8340</td><td>רכיב של מאגר ליזה</td></tr><tr><td>SB 202190</td><td>Tocris</td><td>1264</td><td>p38 מעכב MAPK</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>רכיב של מאגר ליזה</td></tr><tr><td>נתרן דקסויכולולט</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>רכיב של מאגר ליזה</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>רכיב של מאגר ליזה</td></tr><tr><td>TrypLE Express, 1x</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>טריפסין, לעיכול שברי אנטרואיד/קולונואיד</td></tr><tr><td>נוגדן וינקולין, ארנב חד שבטי</td><td>Abcam</td><td>ab129002</td><td>השתמש ב-1:1000 לאימונובלוטינג</td></tr><tr><td>מים, דרגת תרבית רקמות, קורנינג מסונן סטרילי</td><td></td><td>25-055</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>מעכב Tocris</td><td>1254</td><td>RhoA/ROCK</td></tr></tbody></table>

monolayers colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, commensals אפיתל המעי מארח

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

תלת-ממדי (3D) enteroid או colonoid התרבויות האנושיות נגזר מתאי גזע הבסיס קריפטה נכון להיום הדגם המתקדם ביותר ex-vivo של האפיתל במעי. בשל מבנים סגורים שלהם משמעותית התומכים מטריצה חוץ-תאית, 3D תרבויות אינן אידיאלי ללימודי פתוגן-פונדקאי. Enteroids או colonoids יכול להיות גדל ככל monolayers אפיתל על קרום חדיר תרביות רקמה כדי לאפשר מניפולציה של שני luminal ו- basolateral תא משטחים ונוזלים הנלווה. נגישות משטח luminal משופרת זו מקלה על מידול וקרקע אפיתל אינטראקציות כגון היכולת משפילים ריר של enterohemorrhagic e. coli (EHEC) על אפיתל המעי הגס. שיטת הפיצול תרבות 3D טפט זריעה, transepithelial מדידות התנגדות חשמלית (TER) כדי לעקוב אחר ההתקדמות לקראת confluency ובידול מתוארים. בידול חד שכבתי Colonoid מניב ריר המופרש שניתן ללמוד על ידי טכניקות immunofluorescence או immunoblotting. באופן כללי יותר, monolayers enteroid או colonoid לאפשר פלטפורמה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית להעריך את אוכלוסיות תאים מסוים עשויות להיות ממוקדות על ידי פתוגניים או commensal microbiota.

התרבויות האנושיות enteroid ו- colonoid גדל כמו מבנים תלת-ממדיים, ולאחר מכן הפומבית, מקוטעת עבור ציפוי קולגן אנושי תא מצופים הרביעי תרבות מוסיף. ההתקדמות של היווצרות חד שכבתי מנוטר בקלות על בסיס יומי באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר, immunofluorescence מכתים (איור 1), ועל -ידי על עלייה מתמדת ב transepithelial ההתנגדות החשמלית (TER) (איור 2), אשר משקפת החדירות של צמתי צר יונים ו בקורלציה עם טפט confluency. TER של מוסף 24-ובכן ריק הוא כ 50-100 Ω·cm2, כשמגיעים confluency עולה בערך 400-500 Ω·cm2. כל התאים אפיתל confluent monolayers מחוברים באמצעות קומפלקסים מהחיבור שזיהה את הטבעת F-אקטין הפלייבק תא (איור 1). Monolayers בתקשורת מלאה פקטורי גדילה מייצגים האפיתל כמו קריפטה proliferative המורכבת בעיקר מ פעיל חלוקת תאים המשלבים את nucleoside אדו אנלוגי (איור 2). נסיגה של גורמי גדילה WNT3A ו- RSPO1 מקדם בידול, המוביל אל תרבויות כמו סיסי חסרי תאים מתרבים. Monolayers הבדיל מכילים enterocytes (enteroids) או colonocytes (colonoids) ולפתח תאים אפיתל המעי מיוחדים כמו הוכח בתרבויות תלת-ממד,18 כולל תאי גביע ו- enteroendocrine. 15 Differentiated monolayers גם להדגים גידול משמעותי טר (Ω·cm &gt; 10002) (איור 2), המציינת את צמתי צר בוגרת.
פיזיולוגיה אנושית רגילה, השכבה אפיתל המעי מפריד בין החומרים המזינים ואת הרווח luminal מועשר חיידק מהסביבה serosal סטרילי. האפיתל בחוזקה מסדיר את צולבות לדבר בין שני תאים אלה. Monolayers Enteroid, colonoid לשמר את מאפיין חשוב מידור זה כפי שמוצג במסגרת הניתוח פרוטיאומיה מבנית טבלה 1- יש הבדלים ניכרים בין הרכב החלבון בהפסגה, basolateral ממוזגים מדיה שנאסף monolayers enteroid הבדיל. גישה אל שני הצדדים הפסגה, basolateral מאפשר איסוף של שני supernatants באופן תלוי זמן למדידת דיפרנציאלית הפרשת מולקולות אחרות כגון ציטוקינים נוגדנים. 15 , 17
Monolayers הם דגמים נוחים מאוד לשחזור כדי לזהות השינויים בביטוי חלבונים באמצעות immunoblotting ו- immunostaining. לפיכך, שינויים ב mucin 2 (MUC2) ביטוי shRNA נוקאאוט (KD) ניתן להבחין באמצעות שתי טכניקות (איור 3). התמרה חושית shRNA מתבצע על 3D colonoids ומתוחזק בתקשורת הבחירה אנטיביוטי. לאחר אימות של KD, colonoids יכול להיות באופן רציף נשמר כמו תרבויות 3D ו/או מצופה כמו monolayers למטרות ניסוי. יתר על כן, MUC2 KD אינה משפיעה על היעילות של היווצרות חד שכבתי לעומת הקו הורים colonoid פראי סוג. אוסף של monolayers עבור immunoblotting הוא פשוט דומה לפרוטוקולים המתוארות עבור שורות תאים אדנוקרצינומה-derived האפיתל אנוש. בדרך כלל, כ 50 µg או יותר של חלבון הכולל יכול להיות מופק טפט תוצרת הוספה2 ס מ 0.33 יחיד. כפי שמוצג באיור3, MUC2 בקושי שקיימים ב- monolayers colonoid (לעוד) WT מובחן אבל מאוד מתבטאת הבדיל WT (DF) monolayers. MUC2 נמצא מתחת לרמה של זיהוי ב- monolayers colonoid transduced עם MUC2 shRNA אוד ו- DF.
חשוב לציין, monolayers הם מודל מתאים ללמוד אינטראקציות מארח-מיקרוביאלית בפני השטח הפסגה של epithelia. Colonoid monolayers טופס המצורף MUC2-חיוביות ריר שכבה עבה על בידול אשר לא חילחלו בקלות על-ידי commensal e. coli HS חיידקים (איור 4), הדומה מה הוצע במעי הגס אנושי נורמלי. 19 . אולם, enterohemorrhagic e. coli (EHEC), חוקן פתוגניות, הוכח יש את היכולת להרוס את השכבה מועשר MUC2 ריר המצורף כדי להגיע אל פני השטח הפסגה של האפיתל (איור 4). 14 , 20 MUC2 הנותרים קיים רק בתוך התאים בגביע.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig1.jpg"> איור 1: הקמתה של האדם enteroid/colonoid monolayers. (א) דוגמה colonoid קטעים לאחר פירוק BMM ו- trituration. (B) דוגמה הוספה מיד לאחר ציפוי שברי colonoid. קנה המידה של בר (A-B) = 200 μm. נציג הטלה בעוצמה מרבית (C) (D) קונאפוקלית אופטי Z-סעיף עם ההשלכות orthogonal המתאימים מראים קטעים colonoid נזרע על גבי טופס מסננים מצופי הרביעי קולגן אנושי כמה איים חד שכבתי 2-4 ימים לאחר זריעה. אזורים ללא תא (כוכבית) ניתנים לזיהוי על ידי העדר של שני גרעיני (Hoechst 33342, כחול) ו- F הפסגה-אקטין (phalloidin, ירוק) צביעת C וד נציג הטלה בעוצמה מרבית (E) והן (נ) קונאפוקלית אופטי בסעיף המתאים לתוכניות orthogonal יציג של טפט confluent colonoid עם משטח רציף הפסגה זוהה על ידי F-אקטין immunostaining כ- 1-בשבוע שלאחר זריעה. (G) בהגדלה של הטלה בעוצמה מרבית נציג ו סעיף אופטי קונאפוקלית (H) עם ההשלכות orthogonal המתאים להראות כי התאים confluent colonoid monolayers טופס על perijunctional F-אקטין טבעות (חץ לבן), גבול מברשת הפסגה ילדותי (ראשי חץ צהוב). קנה המידה של בר (C-H) = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig2.jpg"> איור 2: הערכה של בידול חד שכבתי enteroid/colonoid. (א) אדו (אדום) התאגדות מדגים אובדן הדרגתי של התפשטות במהלך jejunal חד שכבתי בידול. מידות TER הממוצע (B) confluent jejunal monolayers במדיום הרחבה או בידול. קווי שגיאה מייצגים ב- SEM אוד, מובחן; DF, הבדיל. המספרים תואמים ימים תחת התנאי שצוין; UD1 היה היום הראשון של confluency, כ 1 שבוע לאחר זריעה. (ג) monolayers jejunal אוד יש רחבה, קצר יותר תאים גבול מבוגרים פחות המברשת מבוססת-אקטין הפסגה מאשר DF יום 5 jejunal monolayers. קנה המידה של בר (א, ג) = 50 μm. כל monolayers היו מתוארים לפחות שבוע אחד לאחר זריעה והיו confluent לפני תחילת בידול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig3.jpg"> איור 3: פראי סוג colonoids ו shRNA transduced נוקאאוט (KD) colonoids monolayers confluent בכל טופס. (א) להחליפן בתמונות של פראי סוג (WT) colonoid confluent האנושי טפט הבדיל במשך 5 ימים, (B) גדל באופן דומה monolayers נגזר MUC2 KD colonoid תרבויות. קנה המידה של בר (A-B) = 50 μm (ג) נציג immunoblot של תרבויות colonoid transduced עם shRNA מקושקשות או MUC2 shRNA מדגים כי השינויים בביטוי חלבונים עקב KD יכולה להיות quantitated על ידי immunoblot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig4.jpg"> איור 4: Enteroid/colonoid monolayers הם מודלים מתאימים ללמוד אינטראקציות מארח חיידק luminal. הטלה בעוצמה מרבית נציג (א) וסעיף אופטי אורתוגונלית של טפט colonoid מציגה את הפסגה MUC2-חיוביות ריר שכבת עבה שאינו חדיר ל e. coli HS (חץ שחור) בישיבה הליחה הפסגה השטח. טפט היה נגוע למשך 6 שעות עם6 10 cfu/mL HS. (B) הטלה בעוצמה מרבית נציג של טפט colonoid האנושית נגוע apically EHEC (106 cfu/mL, 6 שעות). קנה המידה של בר (A-B) = 50 μm. (ג) MUC2 immunofluorescence בעוצמה מדידות מראים ירידה משמעותית MUC2 monolayers colonoid נגועה EHEC לעומת שולט נגוע. קווי שגיאה מייצגים ב- SEM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>חלבון</td>
			<td>מספר גישה</td>
			<td>פפטיד שפע</td>
		</tr>
<tr>
<td>Basolateral מדיה</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>חומצת שומן מחייב חלבון, הכבד [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_001434.1</td>
			<td>1299</td>
		</tr>
<tr>
<td>profilin-1 [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_005013.1</td>
			<td>797</td>
		</tr>
<tr>
<td>קודמן אפוליפופרוטאין A-IV [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_000473.2</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>קודמן טפיל חוץ-ADP-ribosyltransferase 4 [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_066549.2</td>
			<td>633</td>
		</tr>
<tr>
<td>גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז isoform 1 [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_002037.2 (+1)</td>
			<td>616</td>
		</tr>
<tr>
<td>serotransferrin קודמן [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_001054.1 (+1)</td>
			<td>572</td>
		</tr>
<tr>
<td>ויטמין D-איגוד חלבון isoform 3 קודמן [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_001191236.1 (+2)</td>
			<td>567</td>
		</tr>
<tr>
<td>קטלאז [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_001743.1</td>
			<td>427</td>
		</tr>
<tr>
<td>קודמן isoform 1 אגרין [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_940978.2 (+1)</td>
			<td>377</td>
		</tr>
<tr>
<td>lactotransferrin isoform 1 קודמן [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_002334.2 (+1)</td>
			<td>262</td>
		</tr>
<tr>
<td>מדיה הפסגה</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>trefoil פקטור 3 קודמן [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_003217.3</td>
			<td>326</td>
		</tr>
<tr>
<td>trefoil פקטור 1 קודמן [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_003216.1</td>
			<td>304</td>
		</tr>
<tr>
<td>קרום המרתף ספציפיים הפאראן גופרתי פרוטאוגליקן הליבה חלבון isoform הקדמה [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_001278789.1 (+3)</td>
			<td>303</td>
		</tr>
<tr>
<td>isoform filamin-B 1 [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_001157789.1 (+2)</td>
			<td>240</td>
		</tr>
<tr>
<td>trefoil פקטור 2 קודמן [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_005414.1</td>
			<td>182</td>
		</tr>
<tr>
<td>שנמחקו ממאיר במוחו גידולים חלבון 1 isoform b קודמן [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_015568.2 (+3)</td>
			<td>169</td>
		</tr>
<tr>
<td>קרטין, סוג II 1 cytoskeletal [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_006112.3</td>
			<td>157</td>
		</tr>
<tr>
<td>צולבות הקישור חוטים שרירן-9 [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_002464.1</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>aminopeptidase N קודמן [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_001141.2 (+1)</td>
			<td>145</td>
		</tr>
<tr>
<td>קודמן אגרין [הומו ספיינס]</td>
			<td>NP_940978.2 (+1)</td>
			<td>112</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. רשימה חלקית של פפטידים המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם/כרומטוגרפיה נוזלית ב הפסגה ונוזלים basolateral לטעום מן הבדיל jejunal monolayers.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול התרבות האנושית enteroid או monolayers colonoid שיש להם פונקציה נפגע המחסום ללמוד אינטראקציות אפיתל-microbiota מארח ברמה התאית וביוכימי.

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

תרבות אורגנואיד מעיים תלת מימדית מגבילה את המחקר של אינטראקציית אפיתל-פתוגן מארחת מכיוון שהלומן אינו נגיש ישירות לחיידקים או לגורמי ארסיות. בנוסף, חומרים מופרשים כגון מולקולות קטנות, חלבונים או ריר לא ניתן לדגום בקלות מתרבות 3D לניתוח במורד הזרם. כדי לטפל במגבלות אלה, אנו מציגים פרוטוקול שונה להמרת 3D דמויי אדם או קולונואידים למונולר.מונואיירים קולונואידים מפרישים שכבת ריר עבה ואפיקלית, המאפשרת מחקרי ויוו לשעבר של אינטראקציה פתוגנית-ריר. שיטה זו שואפת לספק מודל למתיחה כדי ללמוד את האינטראקציות המוקדמות ביותר בין מארחי מעיים לפתוגן בעת ההדבקה. מונוליירים קולונואידיים יאפשרו דרך חדשה ללמוד ביולוגיה ריר, אשר חשוב אינטראקציה מארח-פתוגן, מחקרי מיקרוביום, ומחלות מעי דלקתיות.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על איברים אחרים מפריש ריר כגון מערכת העיכול העליונה, מערכת הנשימה, ומערכת הרבייה הנשית. הדגמה חזותית תסייע למשתמש בשימור ריר במהלך צמיחת מונולייה ובמהלך הקיבעון לכשל חיסוני. הדגמת ההליך תהיה קרול דוקלדני, מדען צוות מהמעבדה שלנו.לאחר הדגירה את תרבות התאים הצפויה, שאפו את מדיום התרבות מהצלחת בת 24 הבאר והחלפו בתתא קציר קר כקרח אחד ל הבאר. השתמש מגרד תא מיני כדי לסלק ולשבור את גלולת מטריצת קרום המרתף. שים לב במיוחד לכל חומר ליד הקצוות היטב.לאחר מכן, להתסיס את הצלחת על שייקר מסלולית בערך 200 מהפכות לדקה בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 עד 45 דקות. השתמש פיפטה ערוץ יחיד P200 מצויד עצות מסנן סטרילי כדי triturate ההשעיה התא. לספק את ההשעיה התא בבקבוקון חרוט 15 מיליליטר.השתמש בקבוקונים מרובים אם נפח המתלים הכולל גדול משישה מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף לתוך הבקבוקון נפח שווה של מתקדם DMEM / F12 בינוני המכיל 10 מילימולרים HEPES, L-alanyl-L-גלוטמין דיפטיד, פניצילין-סטרפטומיצין. זה מדיום הכביסה.הפוך את הבקבוקון שלוש עד ארבע פעמים כדי לערבב. צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לפני ציפוי התא, לצייד את המכניסים מצופה אינקובטור תרבות רקמות לפחות 30 דקות.עבור כל הכנס להיות מצופה, חם מיליליטר אחד של מדיום התרחבות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהוסיף שני מעכבים. לאחר מכן, מוסיפים את התערובת ל בארות. שאפו את מדיום הכביסה מהצינור המכיל את גלולת התא והחלפו באמצעי הרחבה בנפח מספיק כדי להניב לפחות 100 מיקרוליטרים לכל הכנסה ותוספת.לאחר מכן, שאפו את פתרון הקולגן הרביעי מכל הכנס ושטפו פעמיים עם 150 מיקרוליטרים של מדיום הכביסה לכל הכנסה. פיפטה 600 מיקרוליטרים של מדיום התרחבות לחלל שמתחת לכל הכנסה. פיפטה 100 מיקרוליטרים של השעיית תא מהבקבוקון לכל הכנס.מחזירים את הצלחת לאנקובטור תרבות הרקמה ומשאירים באין מפריע לפחות 12 שעות. הימנע מרעידות או הטיה חדה של הצלחת. לאחר הדגירה, מניחים את הצלחת על מיקרוסקופ אור ניגוד פאזה עם עדשה אובייקטיבית פי 2.5 עד פי 10.רענן עם מדיום תרבות ללא מעכבים להפסיק את הטיפול עיכוב. ממשיכים לרענן את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים עד להתבלבלות. הרם את מוסיף תרבות התאים מהצלחת של 24 הבאר עם מדפים או פינצטה עדינים.בזהירות להפוך על נייר רקמת מעבדה כדי להסיר את המדיום apical ולנגב נוזל חיצוני נצמד לתוספת. בצלחת חדשה של 24 בארות, טובלים את המכניסים בתמצית אחת עד שלוש של חומצה אצטית קרחונית ואתנול מוחלט במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, על הספסל, להפוך את הכנס על נייר טישו כדי להסיר את התיקון.מניחים את המכניסים במיכל פלסטיק מלא PBS 1X במשך 10 דקות כדי rehydrate התאים לפני שתמשיך עם פרוטוקולים immunostaining סטנדרטי. כדי לשמר, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך סביב ההיקף של קרום הכניסה. באמצעות מדפים, להעביר את הממברנה לשקופית מיקרוסקופ זכוכית.לאחר מכן, מוסיפים את מדיום ההרכבה ומדביקים כיסוי. בניסוי זה, תרבויות האדם enteroid ו קולונואידים גדלים כמו מבנים 3D, אז ניתק מקוטע עבור ציפוי על תאים מצופים קולגן אדם-IV מוסיף. ההתקדמות של היווצרות monolayer מנוטרת על בסיס יומי באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר וכתמים immunofluorescence.שברי קולונואידים המוזרעים על מסננים מצופים קולגן-IV אנושי יוצרים מספר איים מונוליים יומיים עד ארבעה ימים לאחר הזריעה. הן הקרנה בעצימות מרבית והן מקטע Z אופטי קונפוקלי עם התחזיות האורתוגונליות המתאימות מראים שאזורים נטולי תאים ניתנים לזיהוי על ידי היעדר כתמי F-actin גרעיניים ואפיקליים. מונוליאר קולונואידי קונפלונטי עם משטח אפיקלי מתמשך זוהה על ידי אימונו-אקטין F-actin כיום שבוע לאחר הזריעה.הגדלה גבוהה של הקרנה ייצוגית בעוצמה מקסימלית ומקטע אופטי קונפוקלי עם ההקרנות האורתוגונליות המתאימות מראות שתאים במונואלירים קולונואידיים קונבנציונליים יוצרים את טבעות ה- F-actin perijunctional וגבול מברשת אפית לא בוגר. התאגדות EdU מדגימה אובדן מתקדם של התפשטות במהלך ההידול המונווליאר jejunal. למונואים ג'ג'ונאליים מונואיריים בלתי מוישים יש תאים רחבים יותר, קצרים יותר, וגבול מברשת פחות בוגר המבוסס על אקטין, בהשוואה למונוליירים ג'ג'נאליים לאחר חמישה ימים של התבידול.פיצול הקולונואידים הוא קריטי. אם הקטעים גדולים מדי, הם לא יתחברו למסנן המפופה, אלא יתקנו מחדש לקולונואיד תלת-מימדי. הצגנו שיטה מותאמת לחקר ביולוגיה ריר על מונוטלים קולונואידים.מחקרים מארחים-פתוגנים אחרים יכולים להתבצע כדי להסתכל על האינטראקציה בין הפתוגן לבין פני השטח של המעי.

human-colonoid-monolayers-to-study-interactions-between-pathogens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול זה מתאר מודל microfluidic שיתוף תרבות לתרבות סימולטני מקומי של תאים וחיידקים אפיתל. מודל זה יכול לשמש חוקר את תפקידם של אותות מולקולריים שונים מסיסים על הפתוגנזה, כמו גם מסך האפקטיביות של זני חיידקים פרוביוטיים המשוערת.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

מקור: In, J. G. ואחרים. מונולאידים של קולונואידים אנושיים לחקר אינטראקציות בין פתוגנים, קומנסלים ואפיתליום מעי של המארח. J. Vis. Exp. (2019).הסרטון הזה מדגים את התהליך לגידול תאי אפיתל שמקורם במעי הגס על מערכת טרנסוול מצופה קולגן, ליצירת שכבה מונולקולית שמייצרת ריר שמדמות את מחסום המעי ומאפשרת מחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגן.

יצירת שכבת קולונואיד אנושית עם פונקציית מחסום לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן

תרבית האיברים ex vivo מאפשרת חקירה של תהליכים ביולוגיים בהקשר של ארכיטקטורת הרקמה השלמה. כאן, אנו מציגים שיטה של תרבית ex vivo של המעי הגס של העכבר, שניתן להשתמש בה כדי לחקור חסינות מולדת והגנה אנטי-מיקרוביאלית של המארח במעי.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; קולון איברי תרבות השימוש בו מארח אנטימיקרוביים ללימודי ביטחון

פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מחסום האפיתל חדירות בטיפול תרופתי בזמן אמת הבאים בהאדם organoids מעיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות התא מיקרוסקופ.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

כאן, אנו מתארים את ההכנה של מונו-שכבות אפיתל מעיים שמקורן באורגנואידים אנושיים לחקר תפקוד מחסום המעיים, חדירות והובלה. מכיוון שאורגנואידים מייצגים את התגובה המקורית של רקמת האפיתל לגירויים חיצוניים, מודלים אלה משלבים את היתרונות של יכולת ההרחבה של קווי התאים ואת הרלוונטיות והמורכבות של הרקמה הראשונית.

מונו-שכבת אפיתל שמקורה באורגנואידים: מודל במבחנה רלוונטי מבחינה קלינית לתפקוד מחסום המעי

בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד ליצור מונוליירים אפיתל ראשוניים של אפיתל ישירות מקריפטות מעיים. אנו מספקים גישות ניסיוניות כדי ליצור monolayers confluent על מסננים חדירים, monolayers confluent לריפוי פצעי גירוד ומחקרים ביוכימיים, ו monolayers דליל ונוח לניתוח כשל חיסוני.

דור של מונוליירים אפיתל המעי הגס הראשי מורין מקריפטות מעיים

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים המאפשרים מידול של אינטראקציות ספציפיות למעיים. מונו-שכבתי מעיים שמקורם באורגנוידים ותרבויות ממשק נוזלי אוויר (ALI) מאפשרות ליצור אפיתליה מובחנת היטב הנגישה הן מצדי הזוהר והן מצד בזולטר, בעוד שאורגנואידים מעיים הפוכים בקוטביות חושפים את הצד האפי שלהם והם נוחים לתפוקה גבוהה.

שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

אנו מתארים פרוטוקול המפרט את הבידוד של קריפטים המעי הגס מורין לפיתוח קולונואידים תלת ממדיים. לאחר מכן ניתן להתמיין באופן סופני בין הקולונואידים המבוססים כדי לשקף את ההרכב התאי של אפיתל המארח לפני קבלת אתגר דלקתי או הפניה להקמת חד-שכבה אפיתליאלית.

חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקות זיהום כדי לחקור היצמדות לשיגלה , פלישה ושכפול תוך תאי באמצעות קווי תאי אפיתל במבחנה .

ניתוח זיהום תאי אפיתל עם שיגלה

המחקר מציג שיטה לחקר זיהום חיידקי במבחנה באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע ברקמה. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל ולהבחין בין אורגנידים בשני ממדים, להדביק אותם ב-Escherichia coli פולשנית דבקה, ולהעריך קריאות מפתח, כולל פריצת מחסום אפיתליאלי, הדמיית זיהומים ותגובת RNA אפיתליאלית.

תרבית אורגנית דו-ממדית על תמצית פולשת או ממברנת בסיס לחקר אינטראקציות בין מארח לחיידקים

חקור אינטראקציות בין פתוגנים לאפיתל מעי באמצעות שכבות יחיד של קולונואידים אנושיים. פרוטוקול זה מאפשר חקר ביולוגיית רירית ואינטראקציות מארח-פתוגן ברמת התא והביוכימיה.

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

גלה סרטונים נוספים