כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

בפרוטוקול זה, אנו יכולים לזהות את האינטראקציות בין חלבונים ל- DNA, ולחשוף את ויסות שעתוק של הגן. זה עוזר להבין את המנגנונים המולקולריים בתאים. אנו משנים את הפרוטוקולים הקיימים מראש ולאחר מכן קובעים פרוטוקולי תדאה ברורים וברורים יותר.

אתה פשוט בצע את הפרוטוקול מהשצעד הראשון, כך ההתרגם יכול להיעשות בהצלחה. להכנת כרומטין מקושר, במכסה המנוע של אדים, הוסיפו ארבעה מיליליטר של 1%VCaP תא תרבות מדיה ו 0.229 מיליליטר של 18.5% PFA לצלחת שישה סנטימטרים. בעדינות מערבל את המנה כדי להפיץ את PFA באופן שווה.

דגירה בטמפרטורת החדר בדיוק 10 דקות. לאחר מכן, מוסיפים 0.47 מיליליטר של תסנובת גליצין 1.25 טוחן לצלחת, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי לעצור הצלבה נוספת. לאחר שטיפת התאים על פי כתב היד, לגרד את התאים ולהעביר את ההשעיה התא צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה הצינור עם המתלה התא ב 3, 000 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשחזר את גלולת התא. השתמש פיפטה כדי להסיר לחלוטין את PBS. רשום את מספר התא לצינור, ואחסן את גלולת התא במינוס 80 מעלות צלזיוס.

כדי לבצע תות תא, תחילה להפשיר את כדורי תא VCAP המאוחסנים על קרח. הוסף 300 microliters של מאגר תות התא ChIP מוכן בתוספת PIC לכל צינור, ו resuspend גלולה ביסודיות. מערבולת הצינור במשך 15 שניות, ו דגירה ההשעיה על קרח במשך 10 דקות.

צנטריפוגה ב 9, 000 פעמים g במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לחלוטין, ולהוסיף 300 microliters של מאגר עיכול MNase כדי לעכל מחדש את גלולה. לדלל MNase עם חיץ עיכול MNase בצינור 1.5 מיליליטר להניב 50 יחידות ג'ל למיקרוליטר.

מוסיפים את MNase מדולל ההשעיה, ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס בדיוק 10 דקות. הגדר את הערבוב על ידי היפוך כל 2 1/2 דקות. כדי לסיים את עיכול MNase, להוסיף 30 microliters של EDTA 0.5-טוחן ב pH שמונה, ומערבולת לזמן קצר.

לאחר הדגירה במשך חמש דקות על קרח, צנטריפוגה ב 9, 000 פעמים גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לחלוטין, ולתלות מחדש את גלולה ב 300 microliters של מאגר דילול ChIP מוכן בתוספת PIC. לאחר מכן, על sonicator מצויד בדיקה microtip, להגדיר את תנאי sonication משרעת שתיים, זמן מעובד 15 שניות, דופק על חמש שניות, ואת הדופק כבוי 30 שניות.

Sonicate ההשעיה על קרח. צייר מיקרוליטר אחד של ההשעיה, ונקודה על זכוכית שקופית. תחת מיקרוסקופ, להתבונן כדי להבטיח כי מבנה התא הוא כמעט שבור.

צנטריפוגה הצינור ב 9, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר. שמור 20 microliters של כרומטין מתעכל בצינור בורג 1.5 מיליליטר להמשך טיפול, ולאחסן את השאר במינוס 80 מעלות צלזיוס. ראשית, בכל צינור בורג 1.5 מיליליטר, להוסיף 75 microliters של מים, ארבעה microliters של חמישה כלוריד נתרן טוחן, ומיקרוליטר אחד של proteinase K.To להסיר crosslinking בין חלבון ל- DNA, להוסיף 20 microliters של כרומטין מתעכל מכל מצב עיכול MNase לצינור בורג.

סוגרים את המכסה בחוזקה, מערבבים לחלוטין, ומודרים את הצינור ב 65 מעלות צלזיוס לילה. בבוקר, לאחר צנטריפוגה הצינור ב 2 עד 3, 000 פעמים גרם במשך כמה שניות, להוסיף 100 microliters של PCI. וורטקס במרץ כדי ליצור אמולסיה.

צנטריפוגה הצינור שוב במהירות מקסימלית במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו שני צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר לכל תנאי. הוסף 100 מיקרוליטרים של PCI לצינור אחד.

הוסף 10 microliters של אצטט נתרן שלוש טוחנות ב pH 5.2 ושני microliters של גליקוגן לצינור אחר. מהצינור שנלקח מהצנטריפוגה, צייר בזהירות את השלב העליון המכיל DNA, והוסף אותו לצינור המכיל PCI. מערבולת במרץ, צנטריפוגה הצינור במהירות המרבית במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, להעביר את השלב העליון לצינור המכיל נתרן אצטט וגליקוגן שהוכן בעבר. מוסיפים 250 מיקרוליטרים של אתנול, ומערבבים לפי היפוך. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

צנטריפוגה הצינור במהירות מקסימלית במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אשר את כדורי בתחתית הצינור. בזהירות להסיר את supernatant כדי לא להפריע את גלולה, ולהוסיף 500 microliters של 70% אתנול.

צנטריפוגה הצינור במהירות מקסימלית במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. מוציאים את העל-טבעי לחלוטין, ומייבשים את גלולת הכדור במשך כחמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של TE כדי להמיס את גלולה.

למדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV. לאחר הכנת כרומטין מתעכל, להפשיר את כל הדגימות על קרח. הוסף 1200 microliters של מאגר דילול ChIP מוכן בתוספת PIC כדי לדלל כרומטין מתעכל לריכוז של חמישה מיקרוגרם לכל 500 microliters.

הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של הכרומטין המעוכל המדולל לצינור בורג של 1.5 מיליליטר כדגימה לקלט. אחסן את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס. הוסף 500 מיקרוליטרים כל אחד הכרומטין מתעכל מדולל צינור בורג 1.5 מיליליטר כדגימה immunoprecipitation.

מוסיפים שני מיקרוגרם של נוגדן לכל צינור, וסגרו את המכסה. הדגירה את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס לילה עם ערבוב עדין על פלטפורמת נדנדה. בבוקר, להוסיף 30 microliters של חלבון כיתה ChIP G חרוזים מגנטיים לכל צינור.

דגירה הצינורות שוב בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים עם ערבוב עדין. לאחר מכן, לסובב את הצינור לזמן קצר בשתיים עד 3,000 פעמים g, ולמקם את הצינור במדף פוליאתילן המכיל מגנטים ניאודימיום למשך דקה אחת. לאחר מכן, הסר בזהירות את העל-טבעי על-ידי שאיפה.

לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של חיץ כביסה מורכב של מערכת החיסון עם מלח נמוך לכל צינור. בקצרה מערבולת הצינור כדי לפזר את חרוזים. דגירה הצינור בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות עם ערבוב עדין על פלטפורמת נדנדה.

חזור על הכביסה עם קומפלקס חיסוני מלח גבוה ותסביך חיסוני ליתיום כלורי על פי כתב היד. לאחר הסרת על-טבעי הנותר לחלוטין, להוסיף 150 microliters של חיץ אלוטיון לצינור. מערבולת הצינור כדי לפזר את חרוזים לחלוטין.

סוגרים את הכובע, ו דגירה הצינור ב 65 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. כדי לפזר את חרוזים ביסודיות, מערבבים על ידי היפוך כל חמש דקות. במהלך הדגירה, הכינו צינור בורג 1.5 מיליליטר, והוסיפו שישה מיקרוליטרים של נתרן כלורי חמישה טוחנים ושני מיקרוליטרים של פרוטאינאז K.Thaw מדגם קלט של 1% שהוכן בעבר על קרח.

הוסף 150 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון, שישה מיקרוליטרים של נתרן כלורי חמש טוחן, ושני מיקרוליטרים של proteinase K לדגימה קלט. לאחר הדגירה של הצינור המכיל חרוזים, להסתובב למטה. מניחים את הצינור במתלה מגנטי למשך דקה אחת, ומעבירים את העל-טבעי לצינור הברגים המכיל נתרן כלורי ומיקרופוטוגרפים של K.Representative של כדורי תאים מקושרים לפני ואחרי sonication מראים הבדלים ברורים.

ללא sonication, מבנה התא נשאר שלם, המציין כי הכרומטין קיים בגרעין. sonication קצר שובר את מבנה התא. כרומטין מקושר הוכן מתאים VCaP מתעכל עם כמויות שונות של MNase.

מבלי להוסיף MNase, דפוס מריחה עם משקל מולקולרי גבוה מאוד הופיע. התוספת של MNase נתנה דפוס סולם, מה שמראה כי MNase מעכל internucleosome. רק המצב שייצר שברי כרומטין עד 900 bp יכול להיחשב עיכול תקין, ואילו דפוס עיכול לא הולם מראה overdigestion בעיקר הביא ייצור mononucleosome.

דפוס העיכול של כרומטין בתאי VCaP מצביע על עיכול תקין של כרומטין. התפוסה הגבוהה ביותר של H3K4methyl3 נצפתה סביב 0.5 קילו-בבס וקילובאס אחד במעלה הזרם של AR-TSS. אזורים הממוקמים ב 19 קילו-בבס ושמונה kb במעלה הזרם ו 12 קילו-בוקס במורד הזרם של AR-TSS, עם זאת, היה תפוסה מועטה של H3K4methyl3, המציין כי אלה יכולים לשמש כאזורים שליליים.

קביעת מצב עיכול MNase היא החשובה ביותר. שמור על מספר תא, נפח חיץ וכמיית אנזים בכל ניסוי. יש לזהות את התנאי עבור כל סוג תא.

אנחנו יכולים לבצע רצף ChIP עבור תפוסה גלובלית של הגורמים לכידת קונפורמציה כרומטין כדי לקבוע את האינטראקציות בין נגעים גנומיים דיסטליים. שיטה זו יכולה לחשוף מנגנוני תהליך של התמלול. חקירה של ChIP היא כלי רב עוצמה לחקירת רגולציה שעתוק, אך היא מסורבלת ולא ניתנת לשחזור.

השיטה שלנו מעודדת חוקרים לבצע את הבדיקות באופן שגרתי וקל.