יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון
5 באפריל 2019
פרוטוקול זה מתאר השימוש כרומטוגרפיה גבוהה-ירידה לפרטים-יונים עם פיזור אור רב זווית נחישות המוני טוחנת מדויק של חלבונים, חלבונים מתחמי פפטידים במדגם הטרוגנית. שיטה זו היא ערך להערכת איכות, כמו גם באשר אפיון oligomers מקורית, מטען גרסאות ודוגמאות מעורב-חלבון.
פרוטוקול זה מציג MALs חילופי יון, שיטה חדשנית לבקרת איכות חלבון ואפיון, בקרת איכות חיונית עבור עקביות ושלמות של תוצאות במחקר מדעי החיים ופיתוח מוצרים פרמצבטיים. Ion-exchange MALS קובע טוהר חלבון, מצב אוליגומרי, הומוגניות, זהות, קונפורמציה, מבנה, שינויים שלאחר התרגום, ומאפיינים אחרים. המדידות אינן הרסניות והן נעשות בפתרון בתנאי מאגר כמעט פיזיולוגיים.
שיטה זו קובעת במדויק מסה טוחנת של חלבונים או פפטידים, המצב האוליגומרי, ואת מידת ההטיה, למשל, גליקופרוטאינים. זה יכול להיות מיושם גם על חלבוני קרום. IEX מפרידה בין מקרומולקולים באמצעות טעינת פני השטח שלהם.
חילופי אניון, AIEX וחילופי יון, CIEX, מטריצות נקשרות גרסאות טעונות באופן שלילי וחיובי, בהתאמה. עם הפרדה עדין בין אוכלוסיות חלבון שחולקים מסה או צורה קרובה יחסית, IEX-MALS קובע בהצלחה את המסה הטוסורה של כל מצב חלבון בדגימה של תערובת. כדי להתחיל, השתמש במסנן 0.1 מיקרומטר כדי לסנן את כל הריג'ים, כולל מאגרי הכביסה והאלוטיון.
סנן את 50 עד 100 המיליליטרים הראשונים של המאגר לבקבוק פסולת כדי למנוע חלקיקים מהמסנן היבש. בבקבוק נקי וסטרילי שנשטף ביסודיות במים מסוננים וכתר כדי למנוע כניסת אבק, סנן את שאר המאגר. עם חיץ טריס pH-8 ונתרן כלוריד 50 מילימולאר, לדלל מדגם BSA לשישה מיליגרם למיליליטר כך pH וכוח יוני יאפשר מחייב לעמודת חילופי יונים.
השתמש במזרק כדי להזריק לפחות 0.3 עד 0.5 מיליגרם של BSA לעמודה של מיליליטר להשגת ניתוח MALS באיכות טובה. להתחלת ניסוי MALS לחילופי יון, פתחו את New, Experiment from Method בתוכנת MALS ובחרו בשיטה המקוונת מתווית שיטות המערכת של פיזור האור. אם מודול DLS זמין ויש לרכוש נתוני DLS, בחר את השיטה המקוונת מתוך תיקיית המשנה פיזור אור, עם QELS.
כדי להגדיר את הפרמטרים, תחת המקטע תצורה, הגדר תחילה את קצב הזרימה של הריצה במקטע משאבה כללית לקצב הזרימה המשמש ב- FPLC כ- 1.5 מיליליטר לדקה. תחת המקטע ממס, הזן או אמת את פרמטרי המאגר. תחת סעיף מזרק, הזן את שם החלבון כמו BSA, מדד שבירה תוספת קבועה כמו 0.185 מיליליטר לגרם, ואת מקדם הכחדת UV באורך הגל של 280 ננומטר כמו 0.66 ליטר לגרם לס"מ.
בכרטיסיה דגימה, הזן את הריכוז של דגימת החלבון כמו שישה מיליגרם למיליליטר, ולאחר מכן להכניס את נפח המדגם להזרקה כמו 170 microliters גם כן. תחת המקטע שגרות, בכרטיסיה אוסף בסיסי, בחר בתיבת הסימון גורם מפעיל בהזרקה אוטומטית והגדר את משך הריצה ל- 70 מיליליטר כך שאיסוף הנתונים יימשך לפחות חמש דקות לאחר שהמילוי ההדרגתי יגיע לערך הסופי שלו. לאחר מכן, בתוכנת FPLC, צור ניסוי חדש בכרטיסיה עורך שיטות.
לניסוי הראשוני, צור שיפוע ליניארי של מלח או pH, ואילו עבור השיטה האופטימלית ליצור שיפוע ספציפי יותר או תוכנית צעד אחר צעד על פי כתב היד. כלול אות דופק בשיטה שתפעיל איסוף נתונים בתוכנת MALS. לאחר מכן, לפתוח את שסתום המשאבה, ולשטוף עם 0.5-טוחן נתרן הידרוקסיד כדי להסיר זיהומים כבולים בחוזקה, ואחריו לשטוף חיץ נטרול.
לאחר מכן, לשטוף את העמודה עם טריס חיץ pH שמונה, שסתום A עם חיץ כביסה, ואת שסתום B עם חיץ אלוטיום. השתמש במאגר הכביסה עם ריכוז המלח הנמוך ככביסה סופית כדי לשטוף את העמודה, כדי לאפשר את כריכת החלבון למטריצת העמודים. לפני הזרקת הדגימה, לאחר הכביסה, ובסוף האלוטיון, יש לייצב את בסיס פיזור האור כדי להבטיח רעש נמוך ודילול טהור לחלוטין.
בעזרת מזרק, מניחים את דגימת החלבון בלולאה. התחל את הניסוי תחילה בתוכנת MALS על ידי לחיצה על לחצן הפעל ולאחר מכן בתוכנת FPLC. הנתונים ייאספו לאחר קבלת אות הדופק ממכשיר FPLC באמצעות גלאי MALS.
אם ה- MALS של חילופי היונים מבוצע באופן ידני עם מצב זרימה רציף במקום עם שיטה עצמאית, החל את אותם פרמטרים של הריצה והוראות כפי שתואר קודם לכן. לאחר אימות והפעלה של השיטה הסופית, בצע בדיוק את אותה שיטה באמצעות הזרקה ריקה על-ידי טעינת מאגר במקום הדגימה. חשוב כי התזמון בין הדופק להזרקה אוטומטית לבין שיפוע הריצה הריקה זהה לזה של הריצה לדוגמה.
כדי להתחיל בניתוח, תחת המקטע הליכים בתוכנת MALS, השתמש בכרטיסיה Despiking וברמה Normal כדי להחליק את הכרומטוגרמות. אם הם מציגים הרבה רעש, להגדיר את הרמה כבד. בתצוגה בסיסית, הגדר את קו הבסיס עבור כל האותות, כולל גלאי LS, UV ו- RI.
בתצוגה פיקס, הגדר את הפסגות לניתוח. ודא את הערכים הנכונים של מקדם ההכחדה של ערך ההפרש הקבוע של RI dn/dc ו- UV עבור החלבון מתחת לכל שיא. תחת המסה והרדיוס Molar מתצוגת פיזור אור, לנתח את המסה הטהבה ואת הרדיוס באמצעות מודל Zimm ו להתאים מידה של אפס.
אם QELS זמין, תחת התצוגה Rh מ- QUELS, התבונן בערכי Rh ובאיכות מתאים לפונקציית המתאם. אות RI משתנה באופן משמעותי במהלך ריצת MALS חילופי יון עקב הגידול בריכוז המלח. כדי להחסיר את אות הבסיס מההזרקה הריקה, פתחו הן את ניסויי החלבון והן את ניסויי ה-MALS הריקים של חילופי היונים.
לחצו לחיצה ימנית על שם ניסוי החלבון, בחרו 'החל שיטה' ובחרו בתיקייה 'חיסור בסיסי' מ בתיבת הדו-שיח של הקובץ. בחר את השיטה המקוונת לניתוח מסה מוטחנת סטנדרטית. תחת התצוגה חיסור בסיסי, לחץ על ייבוא ריק כדי לייבא את האותות של הריצה הריקה.
תחת מכשירים, לבדוק את כל הגלאים כדי לחסר. כדי לכייל את מערכת ה-MALS של חילופי היונים עם מונומר BSA, תחת תצוגת פרוצדורות ותצורה, יישר את הפסגות. תחת תצוגת נורמליזציה, הזן 3.0 ננומטר כערך Rg כדי לבצע נורמליזציה.
לאחר מכן, תחת הרחבת Band באותה כרטיסיית תצורה, בחר את השיא ולהשתמש בלחצן בצע התאמה כדי להתאים את אותות UV ו- LS לאות RI. גרף התוצאות מוצג בתצוגה 'התאמת תוצאות'. שנה את סרגלי הציר ופרמטרי תרשים אחרים על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על הגרף, בחירה באפשרות עריכה ולאחר מכן לחיצה על לחצן מתקדם.
כדי לקבל אפשרויות תצוגה נוספות, בחר בכרטיסיה גרף EASI, ובחלק העליון של החלון בתפריט הנפתח תצוגה, בחר תוצאות מסה טוחה או Rh Q.All, כולל מסה טוחנת, רדיוס, רמת טוהר ואחרות זמינות בתצוגה דוח תחת המקטע תוצאות. השתמש בלחצן מעצב הדוחות כדי להוסיף תוצאות או פרמטרים נוספים, כמו גם איורים, לדוח. בניסוי זה, BSA נותח על MALS חילופי יון באמצעות עמודה אנליטית חילופי אניון.
הכרומטוגרמות הציגו את ה-UV ב-280 ננומטר, פיזור אור בזווית של 90 מעלות, מדד השחזור ועקומות המוליכות יחד עם המסה הטוחנת של כל שיא. שיפוע ליניארי רחב המורכב מ-30 כרכים של טורים מ-75 מילימולרים עד נתרן כלוריד 350 מ"ל הפריד בין מונומרים של BSA לבין דימרים ואוליגומרים גבוהים יותר. ניתוח MALS במורד הזרם הביא מסה טוחן מונומר מחושב של 66.8 קילודלטונים מסה טוחן עמום מחושב של 130 קילודלטון.
בהתבסס על מוליכות החיץ בפסגות האלוטות, שיפוע שונה לתוכנית אחרת, צעד ארוך של נתרן כלוריד 175 מילימולר, ואחריו שיפוע ליניארי מ 175-מילימולר ל 500 מילימטר נתרן כלורי. ההדרגה החדשה שיפרה מאוד את הרזולוציה והפיקה הפרדה מצוינת בין מונומר BSA לבין מינים אוליגומריים גבוהים יותר. תוכנית צעד חכם של 200 מילימולר ו 250 מילימולר נתרן כלורי הוחל להתמקד גם על מינים אוליגומריים גבוהים.
זה הביא להפרדה מצוינת בין מונומר BSA, עמום, ו trimer. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כגון ספקטרומטריית מסה, פעילות SDS-PAGE ובדיקות יציבות בכל משתנה המופרד על ידי חילופי יון כדי לזהות ולאפיין עוד יותר כל אחד מהם. מצאנו כי MALS חילופי יון מרחיב את כוחו של ניתוח MALS לדגימות שלא ניתן לנתח באופן מלא על ידי SEC-MALS.
הפרדה לפי תשלום פותרת מינים שונים המשתקים ב-SEC.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג כרומטוגרפיית חילוף יונים עם פיזור אור רב-זוויתי (IEX-MALS) לקביעה מדויקת של המסה המולרית של חלבונים ופפטידים. שיטה זו חיונית לבקרת איכות ולאפיון במדעי החיים ובפיתוח תרופות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביוכימיה
- ניתוח חלבונים
- פיתוח תרופות
רקע
- IEX-MALS היא שיטה חדשנית להערכת איכות חלבונים.
- היא קובעת תכונות שונות כגון טהרה ומצב אוליגומרי.
- השיטה אינה הרסית ופועלת בתנאים פיזיולוגיים.
- ניתן להשתמש בה לניתוח של תערובות מורכבות של חלבונים ופפטידים.
מטרת המחקר
- לספק שיטה מהימנה לאפיון חלבונים.
- להבטיח עקביות ושלמות בתוצאות המחקר.
- להקל על ניתוח של גליקופרוטאינים וחלבוני ממברנה.
שיטות ששימשו במחקר
- כרומטוגרפיית חילוף יונים מפרידה חלבונים על בסיס מטען פני).
- פיזור אור רב-זוויות מודד מסה מולרית בתמיסה.
- ההכנה הניסיונית כוללת סינון ריאגנטים והכנת בופרים.
- איסוף הנתונים כולל הגדרות תוכנה ספציפיות לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- השיטה קובעת במדויק את המסה המולרית ואת המצבים האוליגומריים.
- היא מפרידה ביעילות אוכלוסיות של חלבונים בעלי מאפיינים דומים.
- ייצוב קו הבסיס חיוני לקבלת נתונים מהימנים.
- ניתן לנתח את התוצאות עבור תכונות שונות של חלבונים.
מסקנות
- IEX-MALS הוא כלי בעל ערך לאפיון חלבונים.
- השיטה משפרת את בקרת האיכות בתרופות ביולוגיות.
- היא מספקת תובנות לגבי מבנה חלבונים ומודיפיקציות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
כרומטוגרפיה של חילוף יונים המשולבת עם פיזור אור רב-זוויתי (IEX-MALS) מאפשרת הפרדה מדויקת ואפיון של מסה מולרית של וריאנטים של חלבונים שיוצאים יחד (co-elute) בשיטות של הפרדה לפי גודל, ובכך נותנת מענה לפער קריטי בבקרת איכות של תרופות ביו-פרמצבטיות. על ידי הפרדה של מינים אוליגומריים על בסיס מטען פני, IEX-MALS תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים של חלבונים טיפוליים ומגבירה את הביטחון החזוי בהערכות מוקדמות של כושר פיתוח (developability). שיטה זו מספקת ערך טרנסלציוני על ידי אספקת נתונים אורתוגונליים על טוהר, הומוגניות ומודיפיקציות לאחר תרגום בתנאים דמויי-פיזיולוגיים, ובכך היא מנחה ישירות את בחירת המועמד המוביל (lead selection) ואת אסטרטגיית הפורמולציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מצבים אוליגומריים של חלבונים ווריאנטים של מטען כדי להבהיר קשרי מבנה-תפקוד בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק נתונים כמותיים של מסה מולרית עבור מיני חלבונים בודדים בתערובות, ובכך תומך במסעות סריקה מונחי-השערה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מספק הפרדה ברזולוציית קו בסיס של אוכלוסיות חלבונים בעלות מסה או גודל דומים, המאפשרת כימות מדויק של מונומרים, דימרים ואוליגומרים גבוהים יותר.
- ערך תפעולי: יוצר פרופילי הפרדה מבוססי מטען הניתנים לשחזור ותואמים למערכות FPLC אוטומטיות לצורך אנליזה של וריאנטים בתפוקה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מעריך הומוגניות של חלבונים ומצב הצמדה (למשל, גליקופרוטאינים) בתנאי תמיסה השומרים על המבנה הטבעי (native conformation), ובכך תומך בבחינת היכולת לפיתוח פרה-קליני (developability).
- ערך תפעולי: מספק נתונים אורתוגונליים המשלימים ל-SEC-MALS, ובכך מגביר את הביטחון בעקביות בין סדרות ייצור במהלך פיתוח התהליך.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline)
שיטת IEX-MALS משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני ככלי לאפיון המבוצע לאחר הביטוי והטיהור הראשוניים, ובכך היא מאפשרת קבלת החלטות מושכלות לפני המעבר לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization) או למחקרי פורמולציה.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): תומכת בבדיקת היפותזות באמצעות הפרדה של וריאנטי מטען וצורות אוליגומריות שעשויות להשפיע על מעורבות המטרה (target engagement) או על יציבותה.
- סינון (Screening): מספקת פראקציות של חלבון מטוהר ומוכנות לבדיקה, בעלות מסה מולרית מוגדרת, עבור בדיקות קישור או פעילות בהמשך התהליך.
- אנליטיקה: מספקת נתוני מסה מולרית, רדיוס גירציה ומדדי טוהר ממגלי פיזור אור ומדדי מקדם שבירה לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי (Translational Research): מאפשרת רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפיון מאפייני איכות קריטיים כגון אגרגציה וגליקוזילציה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כשיטת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר, ישימה למגוון מטרות חלבוניות, כולל נוגדנים מונוקלונליים, אנזימים וחלבונים ממברנתיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי הבחנה בין מינים בעלי אלוציה משותפת באמצעות הפרדה מבוססת מטען וקביעה מוחלטת של המסה המולרית.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות של השיטה באמצעות הכנת באפרים סטנדרטית, ייצוב קו הבסיס ופרוטוקולים להפחתת רקע (blank subtraction).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת תובנות מוקדמות לגבי זיהומים הקשורים למוצר והטרוגניות קונפורמציונית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מועמדים מותאם סיכון, בהתבסס על אפיון אורתוגונלי של טוהר, מצב אוליגומרי ופרופילי וריאנטי מטען.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בchromatography, תאוריית פיזור אור וניתוח נתונים באמצעות התאמה למודל Zimm.
- תלוי בגישה למערכות FPLC המשולבות עם גלאי MALS, DLS ומדד שבירה (refractive index), יחד עם עמודות מתאימות (למשל, חילוף אניונים).
- מצריך סטנדרטיזציה בין צוותים עבור סינון באפר, הכנת דגימות ותכנות גרדיאנט כדי להבטיח שחזוריות.
- כולל שיקולי התאמה לתכונות חלבון שונות, כגון כיוונון pH וגרדיאנטים של מלח כדי להפריד וריאנטים ספציפיים של מטען.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בייצוב קו הבסיס ובחיסור Blank כדי לתקן סחף באות ה-RI במהלך גרדיאנטים של מלח.
