Name: מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: למדו שיטת מדידת פעילות ציטראט סינתאז ב-Drosophila melanogaster ללא בידוד מיטוכונדריה. פרוטוקול צביעה יעיל לכימות מסת מיטוכונדריה שלמה בדגימות ביולוגיות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי המענקים מן הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (31401013 ו 31471010), ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי, שנגחאי Pujiang התוכנית (14PJ1405900), והקרן למדעי הטבע של שנגחאי (19ZR1446400).

1. צביעת מטריקה ציטראט ושיטת הפעילות של ד. מלאנוגסטר16
<ol><li>לאסוף 10 זבובים מבוגרים עבור כל דוגמה. לאסוף דגימות לפחות טרילקאט עבור כל גנוטיפ.</li>
	<li>להכין 500 μL של מאגר החילוץ קר קרח המכיל 20 מ"מ HEPES (pH = 7.2), 1 מ"מ EDTA, ו 0.1% טריטון X-100 במבחנה בתוך 1.5 mL עבור כל מדגם.</li>
	<li>מבוגר מורדם זבובים עם CO2 על משטח הרדמה ולבודד את הרקמות הרצויות. כדי לבודד את התצירים הבוגרים לטוס, למשל, לתקן את הטורצירים לטוס על ידי זוג מלקחיים, ולאחר מכן לבודד את בטנם לעוף על ידי חיתוך לאורך הגבול של בית החזה והבטן באמצעות זוג מספריים. לאסוף את ת'ורקס לטוס עבור השריר שריר ציטראט סטנדרטים הפעילות. הערה: לקבוע את המשקל הטרי של הרקמה בשלב זה אם להשתמש בו כדי לנרמל את פעילות ציטראט וסטנדרטים.</li>
	<li>העברה 10 מבוגרים לטוס thoraxes כדי 100 μl של מאגר החילוץ קר הקרח באופן מיידי והמגון עם כתש על הקרח. כדי לשמור את הדגימות קרח קר, המגון לסדר את הדגימות עבור 5-10 s על הקרח, אז יש את הדגימות לשבת על הקרח עבור 5 s, ולחזור עד שכל הרקמות בצינור הם הומוגניים לחלוטין. הערה: הקלטת את השפופרת, בדוק את ההומוטים כדי לוודא שאין קרישי דם במגון ושהרקמות בצינור הן הומוגניים לחלוטין. כל הטיפולים לדוגמה צריך להתבצע על קרח.</li>
	<li>קח 10 μL של כל מדגם הומוגניים בצינור חדש עבור מדידת תוכן חלבון. שמור את הדגימות. למדידת חלבון על הקרח הערה: ניתן להקפיא את דגימות החלבון ולאחסנו ב-80 ° c לניתוח מאוחר יותר. ריכוזי החלבון משמשים כפרמטר פנימי לנורמליזציה של פעילויות ציטראט סינתאז.</li>
	<li>הוסף 400 μL של מאגר החילוץ קר קרח לכל מדגם שנותר כדי להפוך את הנפח הכולל של 500 μL. Mix היטב על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה לפחות 5x, הימנעות היווצרות בועה. עבור כל תגובה, להוסיף 1 μL של תא מדולל ליפוסט כדי 150 μL של פתרון התגובה טרי מוכן (20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM DTNB, 0.3 m מילימטר מיקרומטר, 1 מ"מ חומצה אוקאלואצטט). מערבבים ביסודיות ובאופן מיידי על ידי ליטוף בעדינות, הימנעות היווצרות בועה. למדוד את ספיגת ב 412 ננומטר כל 10-30 s עבור 4 דקות ב 25 ° c באמצעות קורא צלחת מסוגל למדוד ספיגת בשנת 412 nm במרווחי זמן מינימלי של 10 s. הערה: שנה את העצה לפני ליטוף מגיב שונה ולהימנע להרכיב בועות בבארות. ערבוב לא שלם של הריאגנטים עלול לגרום וריאציות במידות. שיטת הפעילות הציטראט הקיימת צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר מיד לאחר איסוף הדגימות, מאחר שניתן להשתמש באותה שיטת לכמת מסה מיטוכונדריאלי שלמה. מאגר התגובות צריך להיות מוכן מיד לפני השימוש ולא צריך להיות מאוחסן.</li>
	<li>התוויית נתונים כדחיסות אופטית (OD) ספיגת (abs) (ציר Y) לעומת זמן (בדקות) (ציר X). לאחר מכן חשב את השיפוע עבור החלק הליניארי של העקומה, כאשר קצב התגובה מ <img src="/files/ftp_upload/59454/59454eq1.jpg"> לחלק את הערך על ידי ריכוז החלבון לדוגמה כדי לנרמל את הפעילות הציטראט סינתאז. הפעילות הציטראט מחושבת כ <img src="/files/ftp_upload/59454/59454eq2.jpg"> הערה: ניתן למדוד את ריכוז החלבון לדוגמה על-ידי ערכת שיטת ריכוז חלבון.</li>
</ol>

<ol><li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells%3A+The+Discerning+Killers%21%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!</a> Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).</li>
<li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li>
<li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals%3A+Untangling+the+knot%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li>
<li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction%2C+oxidative+stress%2C+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death & Disease. 5, e984(2014).</li>
<li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li>
<li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrate+synthase%3A+structure%2C+control%2C+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li>
<li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
<li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel%2FdPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).</li>
<li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spargel%2FdPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li>
<li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1%2FSpargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li>
<li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li>
<li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster%3A+oxidative+stress%2C+mitochondrial+activity%2C+and+survivorship%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li>
</ol>

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

מחקרים מטבולית באמצעות Drosophila ילה כמודל חייב לקחת בחשבון את הרקע הגנטי, דיאטה, ותחזוקה של מניות של זבובים18. כדי למנוע את ההשפעות של רקעים גנטיים שונים על המדידה של פעילות ציטראט סינתז, זנים שונים של דרוסופילה צריך להיות מוצלב למתח שליטה עבור 10 דורות. הרקע הגנטי של כל הזנים Drosophila ילה בשימוש בניסויים שלנו הוא w1118, אז השתמשנו w1118 כפקד. באופן כללי, אנו חושבים w1118 הוא שליטה טובה, כפי שהוא הרקע הגנט...

המיטויום הם הידועים ביותר כארגון הפקת כוח ברוב האורגניזמים איקריוטית, אשר מייצרים את מטבע האנרגיה, ATP, דרך מחזור חומצה tricarboxylic (כלומר, מחזור קרבס) וזירחון חמצוני. המיטומטר מצאו גם לשחק תפקידים חשובים הרבה תהליכים פיזיולוגיים אחרים, כגון רגולציה של אפופטוזיס1, Ca2 + הומאוסטזיס2,3, מינים חמצון תגובתי (ROS) דור4, ו-רשתית פלזמית רשתית (ER)-התגובה הלחץ5. תפקוד מיטוכונדריאלי יכול להשפיע על כל איבר בגוף בכל גיל והוא גורם עיקרי של חילוף החומרים, ההזדקנות6, מחלות ניווניות7. המיטו, שלמים הם המכונה הקשורים לתפקוד מיטוכונדריאלי. לפיכך, כימות נאותה של מסה מיטוכונדריאלי שלם חשוב מאוד להערכת פונקציה מיטוכונדריאלי8. ציטראט סינתאז, האנזים הגבלת קצב בשלב הראשון שלמחזור חומצהtricarboxylic מקומי מותאם מטריצה מיטוכונדריאלי בתוך התאים איקריוטית, ולכן ניתן להשתמש בתור סמן כמותי לנוכחות של המסה מיטוכונדריאלי שלם9,10. פעילות ציטראט סינתאז יכולה לשמש גם כגורם נורמליזציה עבור חלבונים מיטוכונדריאלי שלמים11,12.
זבוב הפירות, דרוסופילה מלאנוסטר, היא מערכת מודל מעולה לחקר תפקוד מיטוכונדריאלי, כמו מולקולות ומסלולים רבים הפועלים תפקידים מרכזי במיטו, שנשמרים בפועל מדרוסוהילה לבני אדם13,14,15. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיטה מהירה ופשוטה למדידה של פעילות ציטראט ומדידה באמצעות שיטת הצביעה בשיטת דרוזוהילה הומוכטים16 בפורמט 96 לצלחת היטב. בתוך שיטת הפעילות הציטראט, הציטראט של העור בדרוזואז , מזרז את התגובה של הקוקלואצטט באמצעות קוקסיל (coa) כדי ליצור את ה-coa הציטראט-SH ו-H+. CoA-SH מגיב לאחר מכן 5, 5 '-dithiobis-(2-החומצה בנזועית) (DTNB) כדי ליצור מוצר צבעוני, 2-ניטרו-5-thiobenzoate (TNB), אשר ניתן למדוד בקלות spectrophotometrically ב 412 nm. פעילות ציטראט סינתאז יכול להיות משתקף על ידי שיעור ייצור הצבע.

<table><tbody><tr><td>2-[4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיניל]חומצה אתנסולפונית (HEPES)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td> V900477-2-אמינו-2<td></td></tr><tr><td>-(הידרוקסימתיל)-1,3-פרופנדיול (בסיס טריזמה)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>V900483</td><td></td></tr><tr><td>אצטיל-CoA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2181</td><td></td></tr><tr><td>חומצה דיתיו-ביס-ניטרובנזואית (DTNB)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>Oxaloacetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>גלולה עלי</td><td>Sangon</td><td>F619072</td><td></td></tr><tr><td>גלולה עלי מנוע</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y10</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>BioTek</td><td>Eon</td><td></td></tr><tr><td>חלבון BCA ערכת בדיקה</td><td>Beyotime</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>WPI</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סנגון</td><td>A110694-0100</td><td></td></tr></tbody></table>

מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

המיטוa לשחק את התפקידים הבולטים ביותר בחילוף החומרים הסלולר על ידי הפקת ATP באמצעות זרחון חמצוני ויסות מגוון של תהליכים פיזיולוגיים. תפקוד מיטוכונדריאלי הוא הגורם העיקרי של מספר מחלות מטבולית וניווניות. המיטו, שלמים הם קריטיים. לתפקוד התקין שלהם האנזים ציטראט סינתאז מקומי במטריקס מיטוכונדריאלי ולכן ניתן להשתמש בו כסמן אנזים כמותי של מסה מיטוכונדריאלי שלמה. בהינתן כי מולקולות ומסלולים רבים כי יש פונקציות חשובות במיטויום הם שימור מאוד בין בני אדם, Drosophila ילה, וכי מערך של כלים גנטיים רבי-עוצמה זמינים בדרוזוהילה, drosophila ילה משמש מערכת מודל טובה ללימוד תפקוד מיטוכונדריאלי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מדידה מהירה ופשוטה של פעילות ציטראט סינתאז ברקמות הומואכל מזבובים מבוגרים מבלי לבודד המיטו,. פרוטוקול זה מתאים גם למדידת פעילות ציטראט וסינתאז בזחלים, בתאים מתורבתים וברקמות היונקים.

איור 1 מציג דוגמה של עקומות קינטית לספיגת OD ב 412 ננומטר לאורך זמן שהושג באמצעות היישום המקביל של הפעילות הציטראט למדוד את מדידת הרקמה בבית החזה. ידוע היטב כי PGC-1α הוא וסת מאסטר של biogenesis מיטוכונדריאלי. PGC-1α שימור מבחינה פונקציונלית בין דרוזוהילה ובני אדם. דרוסופילה RNF34 (dRNF34) הוא מהווה E3 אוביקוויב ליגאז עבור drosophila ילה pgc-1α, dpgc-1, ומקדם השפלה חלבון dpgc-117. מיקרוסקופ אלקטרוני ...

אנו מציגים פרוטוקול לצורך שיטת הצביעה של פעילות ציטראט ומטריקה לכימות של מסה מיטוכונדריאלי שלמה ברקמת דרוזוהילה .

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

דרוסופילה משמשת כמערכת מודל טובה לחקר תפקוד המיטוכונדריאלי. כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות סינתאז ציטראט ברקמות הומוגניות מזבובים בוגרים. פרוטוקול זה אינו דורש בידוד של המיטוכונדריה.הוא מהיר ופשוט והוא מתאים למדידת פעילות סינתאז ציטראט בזחלים, תאים מתורבתים ורקמות יונקים. התחל על ידי איסוף זבובים למבוגרים עבור כל מדגם, הקפד לאסוף לפחות דגימות טריפליקאט עבור כל גנוטיפ. הכינו 500 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי קר כקרח עם 20 מילימולרים HEPES, EDTA מילימולר אחד ו-0.1% טריטון X-100 במבחנה של 1.5 מיליליטר לכל דגימה.מרדים את זבובי המבוגר עם פחמן דו חמצני על משטח הרדמה. כדי לבודד את בית החזה, לתקן אותם עם זוג מ forceps ולבודד את הבטן זבוב על ידי חיתוך לאורך הגבול של בית החזה והבטן עם זוג מספריים. לאסוף את בית החזה לטוס עבור פעילות סינתאז ציטראט.מעבירים 10 בית חזה זבובים למבוגרים ל-100 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי קר כקרח מיד ומפיצים אותם עם עלה על הקרח. שמור את הדגימות קרות על ידי הומוגניזציה במשך חמש עד 10 שניות על קרח, לתת להם לשבת על קרח במשך חמש שניות, ואז לחזור עד שכל הרקמות הומוגני לחלוטין. Aliquot 10 microliters של כל מדגם הומוגני לתוך צינור חדש למדידת תוכן חלבון, שמירה על צינורות אלה על קרח גם כן.הוסיפו 400 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי קר כקרח לכל דגימה שנותרה לנפח כולל של 500 מיקרוליטרים ופיגט למעלה ולמטה כדי לערבב. עבור כל תגובה, יש להוסיף מיקרוליטר אחד של ליסק תאים מדולל ל-150 מיקרוליטרים של פתרון התגובה הטרי. מערבבים היטב על ידי צינורות בעדינות, הקפדה על הימנעות היווצרות בועה, ולאחר מכן להשתמש בקורא צלחת כדי למדוד את הספיגה ב 412 ננומטר כל 10 עד 30 שניות במשך ארבע דקות ב 25 מעלות צלזיוס.התווה את הנתונים כספיגה לאורך זמן ולאחר מכן חשב את השיפוע עבור החלק ליניארי של העקומה. לבסוף, לחלק את קצב התגובה או השיפוע על ידי ריכוז החלבון מדגם לנרמל את פעילות סינתאז ציטראט. ההשערה הייתה כי הפלה של dRNF34 בשריר Drosophila יגדיל את פעילות ציטראט המיטוכונדריאלי סינתאז בעוד נוקאאוט של dPGC-1 יהפוך עלייה זו.קצב אנזימטי ליניארי ראשוני נקבע עבור כל בדיקה;מדרונות קווי המגמה מייצגים את שיעורי התגובה המקסימליים המקבילים לפעילויות הסינתאז המקסימליות של הגנוטיפים השונים. פעילויות הסינתאז המקסימליות של ציטראט חושבו מהעיקולים הקינטיים ונורמלו על ידי ריכוז החלבון. התוצאות הראו כי פעילות הסינתאז של בית החזה זבוב אכן גדל עם שריר ספציפי dRNF34 להפיל את הגידול היה הפוך על ידי שריר ספציפי dPGC-1 להפיל.כאשר homogenizing את המדגם, חשוב להטות את הצינור ולבדוק את homogenate כדי לוודא כי אין קרישי דם, כי הרקמות בצינור הם הומוגני לחלוטין. לאחר איסוף הדגימה, יש לבצע את כל הטיפולים לדוגמה על הקרח. המוצ"ש של פעילות הסינתאז משמש לכימות מסה מיטוכונדרית שלמה.כימות נכון של מסה מיטוכונדרית שלמה חשוב מאוד להערכת תפקוד המיטוכונדריאלי.

a-colorimetric-assay-citrate-synthase-activity-drosophila

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

תסיסנית melanogaster היא מערכת גנטית התנהגותית מודל צייתן, שבו נעשה שימוש כדי להבין את הבסיס המולקולרי התאי של תהליכים ביולוגיים רבים חשובים יותר ממאה שנים 1. תסיסנית נוצלה היטב כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס הגנטי של ההתנהגות במהירות הבזק.

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

סרטון זה מתאר בדיקה קולורימטרית למדידת בדיקת פעילות סינתאז ציטראט מיטוכונדריאלי הקיימת בהומוגנט הרקמה של דרוזופילה.

בדיקת פעילות ציטראט סינתאז: בדיקה קולורימטרית למדידת פעילות סינתאז ציטראט מיטוכונדריאלי בהומוגנט רקמות דרוזופילה

מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.

שיטה של ​​permeabilization של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות

מאמר זה מתאר שיטה למדידת חמצון דלק ב-Drosophila melanogaster שבה כמויות זעירות של מצעים מטבוליים ספציפיים המסומנים ברדיו מוזנות לזבובים. ה-CO2 הנשוף המסומן ברדיו שהוא מיוצר מחמצון דלק נאסף ונמדד.

מדידת ייצור פחמן דו-חמצני מן radiolabeled מצעים ב<em&gt; תסיסנית</em

בדיקת FEeder (CAFE) היא שיטה פשוטה, ידידותית לתקציב ואמינה ביותר לחקירת מנגנונים העומדים בבסיס צריכת מזון. בשימוש עם אורגניזם המודל הגנטי הרב-תכליתי Drosophila melanogaster, הוא מספק אמצעי רב עוצמה להשגת תובנות חדשות לגבי מנגנוני ויסות צריכת מזון.

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em&gt; תסיסנית</em

תחבורה יון הסלולר לעתים קרובות יכול להיות מוערך על ידי ניטור pH תאיים (pHאני). גנטית Encoded pH-אינדיקטורים (GEpHIs) לספק אופטי כימות תאיים pH בתאים ללא פגע. פרוטוקול זה פרטים כימות של החומציות תאיים באמצעות הסלולר שמחוץ לחיות-הדמיה של בקוריאנית Malpighian של דרוזופילה melanogaster עם pHerry, פסאודו-רציומטרי גנטית מקודד ה-pH-מחוון.

PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

הפרוטוקול מתאר של assay פשוט לזהות את הזחלים דרוזופילה melanogaster חווים היפוקסיה תחת רמות חמצן אטמוספרי רגיל. פרוטוקול זה מאפשר הזחלים שתקבעו יהיה מכובד של מוטאנטים אחרים שמראים פנוטיפים חופפים כגון והאתרי או צמיחה איטית.

וזמינותו נובר/למנהור עבור זיהוי של היפוקסיה ב הזחלים דרוזופילה melanogaster

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

אנו מציגים פרוטוקול למדידת צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . מנתח חילוף החומרים מנוצל עם פרוטוקול מותאם וממוטב. מיקרו-רקמת ריסון הינם המכריעים של פרוטוקול זה, היו עיצבת ויצרת במיוחד לשימוש שלהם ניתוח זה.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

פרוטוקול זה מתאר וזמינותו של phagocytosis ויוו ב מבוגרים דרוזופילה melanogaster לכמת פגוציט הכרה ואישור של זיהומים חיידקים.

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

ספירומטריה קולומטרית אידיאלית למדידת קצב חילוף החומרים של אורגניזמים קטנים. כאשר הותאם עבור Drosophila melanogaster במחקר הנוכחי, צריכת O2 שנמדדה הייתה בטווח שדווח עבור סוג בר D. melanogaster על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 לכל זבוב על ידי מוטנטים של ASK שהם קטנים יותר ופעילים פחות, הייתה נמוכה משמעותית מזו של ה-wildtype .

מדידת צריכת O2 בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית

למדו שיטת מדידת פעילות ציטראט סינתאז ב-Drosophila melanogaster ללא בידוד מיטוכונדריה. פרוטוקול צביעה יעיל לכימות מסת מיטוכונדריה שלמה בדגימות ביולוגיות שונות.

מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר

גלה סרטונים נוספים