Name: לימודי ממוקדות באמצעות פנים בלוק טורי וקרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: למד פרוטוקול משולב לזיהוי אזורים ייחודיים בדגימות ביולוגיות מורכבות באמצעות מיקרוסקופיית סריקה אלקטרונית תלת-ממדית. השיטה מדגימה שורשי Arabidopsis thaliana לחקר מבנים תאיים מורכבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הציוד עבור כרך EM סופק על ידי מענק נדיב מממשלת פלנדריה.

<ol><li>Linberg, K. A., Fisher, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrastructural+study+of+interplexiform+cell+synapses+in+the+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">An ultrastructural study of interplexiform cell synapses in the human retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 243, 561-576 (1986).</li>
<li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+third+dimension%3A+volume+electron+microscopy+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li>
<li>Leighton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEM+images+of+block+faces%2C+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+%E2%80%93+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – A technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. (pt 2), 71-76 (1981).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three+dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 11, 329(2004).</li>
<li>Heymann, J. A., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site+specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Site specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).</li>
<li>Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR Methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. V7_01_10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol">https://ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol</a> (2019).</li>
<li>Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+and+digital+imaging+technology+reduce+turnaround+times+for+diagnostic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastructural+Pathology%22%5BJournal%5D)">Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy.</a> Ultrastructural Pathology. 27 (3), 187-196 (2003).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+EM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Developing 3D EM in a broad biological context.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Vanslembrouck, B., Kremer, A., Pavie, B., van Roy, F., Lippens, S., van Hengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+intercalated+disc+including+the+intercellular+junctions+by+applying+volume+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the intercalated disc including the intercellular junctions by applying volume scanning electron microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cell Biology. 149, 479-490 (2018).</li>
<li>Russel, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li>
<li>Sommer, C., Strähle, C., Köthe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+Interactive+Learning+and+Segmentation+Toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Eighth+IEEE+International+Symposium+on+Biomedical+Imaging+%28ISBI%29.+Proceedings%22%5BJournal%5D)">ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit.</a> Eighth IEEE International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI). Proceedings. , 230-233 (2011).</li>
<li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+Image+Browser%3A+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), e1002340(2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

מיקרוסקופ אלקטרוני של אמצעי אחסון הוא מאתגר יותר וזמן רב יותר מאשר המקובלת SEM או TEM. בגלל הצורך להכתים רקמות או תאים בגוש, שלבי העיבוד חייב להיות מספיק זמן כדי להבטיח חדירה של ריאגנטים לאורך המדגם. שימוש באנרגיה מיקרוגל כדי להקל על החדירה גורמת לעיבוד קצר יותר, יעיל יותר ומשפר את הצביעת. מאחר וההכנה עבור EM היא הרבה יותר מחמירה מאשר עבור מיקרוסקופ אור כל הפתרונות ריאגנטים חייב להיות מבוקרת איכות בקפדנות. שינויים ב-pH, טונגניות, השימוש של ריאגנטים טמא, והקדמה של מזהמים עקב טכניקה ירודה יכול להיות כולם השפעות מזיקות על התמונה הסופית.
אמצעי אחסון EM מחייב גם פרוטוקולים מותאמים אישית עבור כל סוג דגימה שונה. רקמות מממיות מסוגים שונים: צמחים, תאים בודדים כגון שמרים, טריאנוזומים, בעלי כליות וכו ', כולם זקוקים לווריאציות משלהם כדי להשיג תוצאות אופטימליות. קיבוע וכתמים חייב להיות מתוכנן כדי לשמר את השלמות המבנית ולשמור את המדגם קרוב שלה בvivo מורפולוגיה ככל האפשר. קיבוע של רקמות בטמפרטורה פיזיולוגית, pH ו-גמישותו היא קריטית כדי להפוך את המדגם כמו חיים כמו שהוא יכול להיות. בלחץ גבוה הקפאת (hpf) של דגימות עשוי לסייע לשמר מצב חיים כמו יותר, (או אולי רק להניב חפצים שונים), אבל עבור אחרים מאשר תאים ורקמות דק מאוד hpf ייכשל כמו קרח אינדקטור יכול להיווצר רק בכמויות קטנות. לכן עבור שאלות רבות קיבעון כימי הוא האפשרות היחידה. לא משנה אם הקיבעון הוא HPF או כימי, בכל ניסוי EM התוצאות המבבניות צריך להיות בזהירות לעומת תוצאות דומות של תא חי או הדמיה רקמות כדי לראות אם הם עקביים. הצביעת חייב להיות ממוטבת גם בהתחשב בשאלה הספציפית שצריך לקבל תשובה ואת הפרוטוקול שישמש להדמיה של התמונות הדיגיטליות.
לאחר שני מערכת SBF-SEM ו פרפור בסמיכות הוא יתרון גדול בניסויים רבים. השדה הגדול של תצוגה גבוהה X, רזולוציה Y של SBF-SEM הופך מבנים בודדים/תאים/אירועים ישירה ומספק כללית מרחבית של תאים ברקמות. בנוסף, יכולתה לאפשר הדמיה באמצעות מדגם Z היא רבת עוצמה; עם זאת, שחזורים הדורשים פירוט גיאומטרי עדין יכול להיכשל או לייצר חפצים באמצעות טכניקה זו בשל הvoxels לא איזוטרופי שהוא מחולל. פרפור הוא מוגבל על ידי הפיזיקה של התהליך לשדה הדמיה קטן יותר אבל הרזולוציה 3D שלו מספיקה עבור שחזורים מדויקים מאוד. שילוב שתי הטכניקות הוא פשוט כמו דגימות יכול לעבור מ-SBF-SEM אל פרפור ללא עיבוד או הכנה נוספת. אנו מכירים בכך שהשימוש ב-SBF-SEM עבור חיפוש דרך מדגם כדי למצוא אזור מסוים הוא שימוש יקר מאוד בכלי הרבה יותר מוכשר. עם זאת, היכולת לראות באופן מיידי את פני הבלוק החדש ולקבוע אם הROI הגיע הוא יתרון גדול. בנוסף, את החלופות של שימוש בסעיפים סידוריים חצי דקה (0.5 μm) מקטעים LM יכול להסיר מבנים קטנים לפני שהם מזוהים, ובדיקת בלוק באמצעות מקטעים TEM יחיד אשר צריך לגזור, לשים על רשת ולאחר מכן מוצג TEM יקר באותה מידה אינו כמו יעילה כשיטה המוצגת.
מאחר שקיימות תוכניות רבות לפלח ולעיבוד הנתונים, והצרכים של מבנה נתון לא מוגשים בדרך כלל על-ידי יישום יחיד, לא ניתן להציע זרימת עבודה סטנדרטית. כמה מבנים פשוטים עשויים להיות מחולקת עם אלגוריתם סף אם הם נופלים בתוך ערכי סולם אפור צר מאוד. מבנים עצביים יכולים להיות semi-באופן אוטומטי מקוטע באמצעות תוכנית כגון Ilastik11 אבל זה יהיה פחות שימושי בצורה אקראית או מורכבת יותר בצורת אורגלים כגון ER. תמונת מיקרוסקופיה דפדפן היא תוכנית גמישה מאוד שיכולה ליישר, פלח, ולעבד נתונים EM הנפח, אך דורש אינטראקציה משמעותית משתמש12. ככלל הזמן הדרוש כדי להמחיש באופן דיגיטלי את התוצאות יעלה במידה רבה את הזמן להכנת המדגם והדמיה.
טכניקות ה-EM של אמצעי אחסון פתחו את הממד השלישי לניתוח בדיקת אולטרה-מבנית. שיטות אחרות של קבלת 3D EM יש מגבלות בנפח שלהם (הטומוגרפיה TEM), או היעילות שלהם (סעיף סדרתי TEM). למרות ששיטות הנפח הרב ביותר מורכבות ויקרות ליישום במעבדות בודדות, מספר מתקני הליבה המשותפים המציעים אותם גדל ומספר סוגי המדגם שנוצר בהצלחה הגדילו את התמונה במהירות. עבור אלה עם שאלה ספציפית ורקמות מסוים זה סביר להניח שמישהו יוכל להציע ייעוץ והוראות על ההכנה וההדמיה. ניתן לשפר את הציוד האלקטרו-ממדי כדי לכלול את הקיבולת לטיפול בדגימות גדולות יותר ב-SBF-SEM וביכולת הטחינה הגדולה יותר עם ה-פרפור. תוכנה אשר מסוגלת לחלק את המבנים של עניין בצורה אוטומטית יותר יהיה לפשט במידה רבה את תהליך ניתוח הנתונים ושיפורים במהירות המחשוב תפחית את הזמן הדרוש כדי לעשות זאת. למרות המגבלות הנוכחיות שלה, אמצעי האחסון EM הוא עדיין כלי שימושי ושילוב SBF-SEM ו פרפור-SEM מספק זרימת עבודה יעילה לזיהוי אירועים נדירים והדמיה שלהם ברזולוציה גבוהה.

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה עבור המיקוד היעיל של מיקרוסקופית אלקטרונים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה (EM) לאזור ספציפי של ריבית (ROI). מאז ראשיתה בשנות ה -30, EM הייתה טכניקה דו מימדית במהותה. התמונות הראשונות שפורסמו היו של רקמות או תאים שלמים, אבל במהרה נתן את הדרך למקטעים שנחתכו ביד באמצעות ultramicrotome והתמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM). TEM מייצרת מיקרוגרפים ברזולוציה גבוהה מאוד, שאפילו הקטנים ביותר של מבני הסלולר הם ברורים להבחין. עם זאת, את הקטע של הסעיף הדרוש כדי הרקמה להיות התמונה על ידי קרן האלקטרונים עשה מידע בממד Z מינימלי. מאחר שתאים הם מבנים תלת-ממדיים, יש להסיק אינטראקציות בין מבני תאים ומשטחי תאים מנתונים מוגבלים. זה העלה את הפוטנציאל לפרשנות, במיוחד במבנים שהיו מורכבים. כמה מיקרוסקוסטים הצליחו להשיג מבנים תלת-ממדיים מדויקים יותר על-ידי תאים ורקמות בעלי מבנה טורי ולאחר מכן לשחזר אותם בדקדקנות מתמונות TEM בודדות1. זה היה תהליך אינטנסיבי מאוד לעבודה ולפני הופעתו של דימות דיגיטלי ועיבוד המחשב התוצאות היו גם קשה לדמיין. בשנים האחרונות הוצגו שתי טכניקות אשר הפכו באופן קולקטיבי המכונה אלקטרון מיקרוסקופ עוצמה (הכרך EM)2 שהפכו אותם בשלושה ממדים נגישים למעבדות יותר.
הרעיון של קבלת ערימת תמונות מבלוק מוטבע בתוך מיקרוסקופ אלקטרונים ניתן לעקוב חזרה 1981 כאשר סטיב לייטון ואלן קוזיריאן בנתה מיקרוטומה זעירים והניח אותו בחדר של מיקרוסקופ אלקטרון סריקה3 (sbf-SEM) . אב-טיפוס זה הועתק והשתפר לאחר 23 שנים על ידי Denk ו הורסטמאן4 ולאחר מכן ממוסחר. בערך באותו זמן מדענים ביולוגיים הפכו להיות מודעים לטכנולוגיה אחרת המשמשת בעיקר במדעי החומרים, קרן יון ממוקדת. טכניקה זו משתמשת קרן יון מסוג כלשהו (גליום, פלזמה) כדי להסיר כמות קטנה מאוד של חומר המשטח מתוך מדגם (פרפור-SEM)5. שתי הטכניקות מעסיקים בעקבות הדמיה המספקת סדרה של תמונות אשר ניתן לשלב לתוך X, Y, Z, מחסנית. שתי הטכניקות מספקות מידע תלת-ממדי, אך בקשקשים ברזולוציה שונים. SBF-SEM מוגבל על ידי המאפיינים הפיזיים של סכין היהלומים כדי פרוסות דק יותר 50 ננומטר עבור הדמיה סדרתית ארוכה פועל; אולם גודל הבלוק לדוגמה שניתן לשנות הוא גדול, עד 1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ. בשל פורמט גדול של רכישה דיגיטלית של האחורי מפוזרים גלאי אלקטרון (32k x 32k פיקסלים) המקבל אות מפני הבלוק , גודלי פיקסלים של תמונה יכולים להיות קטנים כמו ננומטר אחד. התוצאה היא שאינו איזוטרופי voxels שבו הממד X, Y הוא לעתים קרובות קטן יותר Z. בגלל הדיוק של קרן יון, פרפור-SEM יש את היכולת לאסוף תמונות עם isotropic voxels ≤ 5 ננומטר. עם זאת, האזור הכולל שניתן לדימות הוא קטן למדי. טבלת סיכום של דוגמאות וכרכים שונים התמונה עם שתי הטכניקות פורסמה בעבר3.
הכנה לרקמת הדיסק האלקטרומגנטי קשה יותר מאשר עבור התקן TEM או SEM, משום שדגימות חייבות להיות מוכתמות כדי לספק יצירת אותות נאותים ב-SEM. לעתים קרובות, התקנים צריכים להיות ממוטבים לא רק עבור סוג הרקמה מסוים אלא גם עבור הוספה ניגוד מבנים סלולריים מסוימים כדי להפוך זיהוי ושחזור קל. הפרוטוקול המשמש כאן מבוסס על תקן NCMIR6. כתמים נוספים בדרך כלל פירושו שלבי פרוטוקול נוספים. כך עבור נפח EM, פרוטוקולים סטנדרטיים צריך להיות מורחב כדי להבטיח זמן מספיק עבור ריאגנטים לחדור את המדגם. מיקרוגל בסיוע בעיבוד יכול להפחית את הזמן הדרוש עבור כתמים משעות לדקות והופך לדוגמה EM נפח ההכנה יעיל יותר7. שיטה זו ישימה לכל סוגי תא ורקמות8 ולשאלות המחקר שבו החוסר ההומוגניות של הרקמה עושה דגימה של אזור מסוים חיוני9.
לאחר מקבל מחסנית נתונים ניתן ליישר את המבנים של עניין מחולק משאר הנתונים והמודל ב-3D. למרות אוטומציה של הדמיה פרוסות רבות של רקמה הפכה את רכישת התמונה פשוטה יחסית, תהליך של שחזור דיגיטלי והמחשה של הנתונים היא משימה גוזלת זמן. תוכנה למטרה זו עדיין אינה משולבת ואינה אוטומטית לחלוטין. מאז הרבה מהעבודה המוקדמת באמצעות אמצעי האחסון EM הונחה לקראת מדעי המוח, הטכניקות לצביעת והוספת מבנים באופן דיגיטלי כגון אקסונים הוא די מתקדם לעומת תאים אחרים ואורגלים. בעוד הספרות על רקמות אחרות שאינן נוירואליות גוברת במהירות, מבנים לא ליניאריים או לא סדיר דורשים קלט ידני יותר.
השימוש הן ב-SBF-SEM ו-d-SEM היא גישה שימושית עבור פילוח והדמיה ספציפיים, לא הומוגנית, רקמות מבנים ברזולוציה גבוהה ב-3D. שילוב זה עם המיקרוגל בסיוע עיבוד רקמות כי במידה מרבית מקטין את הזמן הדרוש להכנה לדוגמא. יחד זרימת עבודה זו תהפוך ליצירת נתונים ברזולוציה גבוהה isotropic voxel התמונה של מבנים משובחים תהליך יעיל ומהיר יותר.

<table><tbody><tr><td>3View 2XP</td><td>Gatan</td><td>NA</td><td>אולטרה-מיקרוטום בתא עבור מאגר</td></tr><tr><td>קקודילאט SBFI פתרון 0.2M</td><td>EM Sciences</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>שרף אפוקסי מוליך (עבודות מעגלים)</td> <td>רכיבי RS</td><td>496-265</td><td></td></tr><tr><td>דיאטום היסטו 4.0 מ"מ סכין יהלום</td><td>EM Sciences</td><td>40-HIS</td><td></td></tr><tr><td>טבלית דיגיטציה</td><td>Wacom</td><td>DTV-1200W</td><td>לא </td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף</td> זמינים יותר <td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>עובש הטבעה שטוח</td><td>EM Sciences</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד 25% תמיסה</td><td>EM Sciences</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>משקל MW גבוה חומצה טאנית</td><td>EM Sciences</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>עופרת ציטראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>22861</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד 4% תמיסה</td><td>EM Sciences</td><td>19170</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Biowave Pro +</td> <td>Ted Pella</td><td>36700</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פרוציאניד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>Quorum Q150T ES ציפוי מקרטע</td><td>Quorum Technologies</td><td>27645</td><td></td></tr><tr><td>Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome</td><td>NA</td><td>NA</td><td>כבר לא זמין</td></tr><tr><td>נתרן קקודילאט 0.2M</td><td>EM Sciences</td><td>11653</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שרף דורבנים</td><td>EM Sciences</td><td>14300</td><td></td></tr><tr><td>אורניל אצטט</td><td>EM Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

לימודי ממוקדות באמצעות פנים בלוק טורי וקרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה יעילה ויעילה של דגימות תא או רקמה בשלושה ממדים ברמת הרזולוציה של המיקרוסקופיה אלקטרון. במשך שנים רבות מיקרוסקופ אלקטרוני (EM) נשאר טכניקה דו מימדית מיסודם. עם הופעתו של מיקרוסקופ סדרתי סריקה אלקטרונית טכניקות הדמיה (נפח EM), באמצעות קרן מיקרוטומה או ממוקדת משולבת או לחתוך לאחר מכן להציג רקמות מוטבעות, הממד השלישי הופך נגיש בקלות. בלוק סדרתי הפנים סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SBF-SEM) משתמשת באולטרה מיקרוטומה המצורפת לתא SEM. יש לו את היכולת להתמודד עם דגימות גדולות (1,000 יקרומטר x 1,000 יקרומטר) ותמונה שדות גדולים של תצוגה ב x קטן, Y פיקסל גודל, אבל הוא מוגבל בממד Z על ידי סכין היהלומים. קרן יון ממוקדת SEM (פרפור-SEM) אינו מוגבל ברזולוציה 3D, (isotropic voxels של ≤ 5 ננומטר הם השגה), אבל שדה התצוגה הוא הרבה יותר מוגבל. פרוטוקול זה מדגים זרימת עבודה לשילוב שתי הטכניקות כדי לאפשר מציאת אזורים בודדים של עניין (ROIs) בשדה גדול ולאחר מכן הדמיה של אמצעי האחסון שלאחר היעד ברזולוציה גבוהה isotropic voxel. הכנת תאים קבועים או רקמות תובענית יותר עבור טכניקות EM-volume עקב מנוגדים נוספים הדרושים ליצירת אותות יעילים הדמיה SEM. פרוטוקולים כאלה הם זמן רב ועבודה אינטנסיבית. פרוטוקול זה משלב גם המיקרוגל בסיוע עיבוד רקמות הקלה על חדירת ריאגנטים, אשר מפחית את הזמן הדרוש לפרוטוקול עיבוד מימים לשעות.

תמונות מ-SBF-SEM לספק סקירה של הרקמה, מתן תובנה לכיוון המרחבי של תאים וחיבורים בין-סלולאריים (איור 4A). הדמיה של פרפור שלאחר מכן על אזור חדש, אשר בדרך כלל אזור של עניין נקבע לאחר בדיקה של SBF-SEM לרוץ, מוסיף פירוט ברזולוציה גבוהה של תאים ספציפיים ו/או מבנים (איור 4B).
איור 4C , D להראות את ההבדל בעיבוד של שאינם איזוטרופי voxels של הנתונים sbf-SEM (איור 4c) ואת הנתונים איזוטרופי Voxels-Sem (איור 4c). עובי z המשמש ב-SBF-SEM פירושו שהרינדור מראה בבירור את הסעיפים, וכתוצאה מכך אפקט גרם מדרגות על פני השטח. בנתוני פרפור-SEM את 5 סעיפים ננומטר להבטיח כי הרינדור מופיע הרבה חלקים בודדים מתמזגים לתוך פני השטח לחלוטין.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig1.jpg"> איור 1: יצירת פנים הבלוק מתוך מדגם שרף מוטבע. (א) קצה שורש המוטבע בשרף. (ב) באמצעות להב גילוח שרף עודף נחתך משם עד בלוק של 0.5 mm2 נשאר. (ג, ד) הבלוק החתוך מודבק על סיכת מתכת ולאחר לילה בתנור, הצדדים של הבלוק מגזומים והמשטח מsmoothened עם סכין יהלום באמצעות בדיקת אולטרה-מיקרוטום. (ה) בתוך sbf-SEM, המדגם מונחה כך את פני הבלוק ואת ROI ניתן לזהות, סרגל קנה מידה = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig2.jpg"> איור 2: מתאם בין SBF-sem ופרפור-sem. סקירה תמונות של הפרצוף בלוק באמצעות SBF-SEM (A) ואת שקר-SEM (ב), סרגל קנה מידה = 5 μm. (ג, ד) זום על ההחזר. התיבה האדומה מתארת את האזור להיות בתמונה עם פרפור-SEM, סרגל קנה מידה = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig3.jpg"> איור 3: ערכת פרפור-SEM וצעדי הכנה. (א) ערכה המציגה את הכיוון של קרן פרפור, קרן SEM ומדגם. המדגם צריך להיות ממוקם לנקודה צירוף מקרים של קורות ו SEM להיות מסוגל טחנת ותמונה באותו אזור. (ב) שרטוט סכמטי של התעלה הדרושה לדימות SEM של הסעיפים שהוסרו על-ידי ה-פרפור. (ג) תמונה נלקח עם קרן שקר מראה פלטינה התצהיר על התשואה, סרגל בקנה מידה 5 μm. (ד) תמונה נלקח עם קרן שקר מראה את הקווים המשמשים למיקוד אוטומטי ו-3d מעקב. הקווים באמצע משמשים למיקוד אוטומטי והקווים החיצוניים מספקים מעקב תלת-ממדי. הפחמן בתצהיר על גבי הקווים מספק את הניגודיות הנדרשת (פלטינה לעומת פחמן) כדי לבצע משימות אלה, scalebar 5 μm. (E) תמונה נלקח עם קרן פרפור לאחר כרסום של התעלה, scalebar 5 μm. (F) תמונה צולמה עם קרן SEM מראה את ה אזור התמונה של הריבית במהלך הפעלת פרפור-SEM, סרגל בקנה מידה 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig4.jpg"> איור 4: SBF-sem ו פרפור-sem תוצאות לפני ואחרי פילוח. (A) צפיית תלת מימד של קבוצת נתונים של sbf-SEM (100 x 100 x 40 יקרומטר, סרגל בקנה מידה = 10 יקרומטר), (ב) תצוגה תלת ממדית של קבוצת הנתונים של פרפור-SEM (17 x 10 x 5.4 יקרומטר, סרגל קנה מידה = 2 יקרומטר), (ג) שניתנו לאורך הנתונים מחולקת מנתוני sbf-sem על ידי סף, סרגל קנה מידה = 2 יקרומטר D. מעבד גרגירים שעברו מ פרפור-SEM נתונים על ידי סף, סרגל קנה מידה = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="10">פרוטוקול לעיבוד מיקרוגל</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">תוכנית #</td>
			<td rowspan="2">תיאור/</td>
			<td rowspan="2">בקשת משתמש (הופעל/כבוי)</td>
			<td rowspan="2">זמן (שעה: דקות: שניות)</td>
			<td rowspan="2">כוח (ווטס)</td>
			<td rowspan="2">טמפ ' (° צ')</td>
			<td rowspan="2">טען מצנן (כבוי/אוטומטי/on)</td>
			<td rowspan="2">ואקום/משאבה בובלר (off/bubb/מחזור vac/vac on/vap)</td>
			<td>טמפ ' קבועה</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>משאבה (הלאה/כיבוי)</td>
			<td>טמפ ' (° צ')</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">8</td>
			<td rowspan="3">כשפות</td>
			<td>את</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>את</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>את</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">9</td>
			<td rowspan="5">אוסמיום</td>
			<td>את</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>את</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>את</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>את</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>את</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">10</td>
			<td>50%</td>
			<td>על</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>את</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>70%</td>
			<td>על</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>את</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>90%</td>
			<td>על</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>את</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>100%</td>
			<td>על</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>את</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>100%</td>
			<td>על</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>את</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">15</td>
			<td>0.1 מטרים לשעה</td>
			<td>על</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>0.1 מטרים לשעה</td>
			<td>על</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">15</td>
			<td>ddH2O</td>
			<td>על</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>על</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="7">16</td>
			<td rowspan="7">Uranyl אצטט</td>
			<td>את</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>את</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>את</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>את</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>את</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>את</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>את</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>את</td>
			<td>מחזור ואקום</td>
			<td>על</td>
			<td>30</td>
		</tr></tbody></table>. שולחן 1 . פרוטוקול מפורט לעיבוד מיקרוגל
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>צעד</td>
			<td>נוכחי</td>
			<td>זמן משוער</td>
		</tr>
<tr>
<td>פלטינה תצהיר</td>
			<td>3n א</td>
			<td>10-15 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>כרסום אוטומטי וסימני מעקב</td>
			<td>50-100</td>
			<td>4-6 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>התצהיר של פחמן</td>
			<td>שלושה מבעלי מבנה</td>
			<td>5-10 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>שקע כרסום גס</td>
			<td>15-30 nA</td>
			<td>30-50 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>משטח ליטוש</td>
			<td>1.5-3 נה</td>
			<td>15-20 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>הדמיה-הפעלה</td>
			<td>700 הרשות הפלסטינית-1.5 nA</td>
			<td>שעות ימים</td>
		</tr>
</tbody></table>. שולחן 2 זרמים הטחינה המשמשים להכנת דגימה והדמיה לרוץ

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשילוב יעיל של פנים בלוקים סדרתיים וקרן יון ממוקדת סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני כדי למקד את אזור העניין. זה מאפשר חיפוש יעיל, בשלושה ממדים, ואיתור אירועים נדירים בתחום השקפה גדול.

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

כל פרויקט מדעי החיים הדורש חקירה אולטרה-מבנית תלת-מימדית של אזור מסוים של עניין במדגם ביולוגי מורכב יכול לעשות שימוש בטכניקה זו. הליך ההכנה לדוגמה זהה עבור שתי דרכים הדמיה להיות SBF / SEM ו FIB-SEM. השימוש במיקרוגל מאיץ באופן משמעותי את חלק העיבוד לדוגמה.למרות המוצג כאן עבור טיפים שורש, פרוטוקול זה יכול לשמש עבור כל מערכת מודל ביולוגי עם התאמות מינימליות. לפני השימוש בזרימת עבודה זו לתכנות SBF/SEM ו- FIB-SEM, יש להכיר את הטכנולוגיות הבודדות. ביצוע שלבים מסוימים מוכח בקלות אך קשה לתאר בטקסט כתוב.הדגמת ההליך תהיה פיטר בורגגריף שהוא טכנאי במעבדה שלנו. כדי להתחיל, לחתוך את קצות השורש של שתילים thaliana Arabidopsis קבוע על צלחות אגר ולשים שניים עד שלושה טיפים צינורות Eppendorf המכילים את אותו תיקון לילה בארבע מעלות צלזיוס. בבוקר, עם פיפטה, החלף את התיקון עם חיץ פוספט טוחן 0.1 ב pH 6.8 בצינורות עם הצינורות על שולחן מסתובב ב 100 סל"ד ולשטוף במשך 10 דקות.לאחר מכן חזור על הכביסה באמצעות חיץ פוספט טרי חמש פעמים. במכסה המנוע אדים, לאחר לתקן את קצות השורש על ידי החלפת חיץ פוספט עם 2%osmium tetroxide ו 0.2% רותניום אדום ב 0.1 מאגר פוספט טוחנת ב pH 6.8 עם צינורות עם מכסים פתוחים במיקרוגל ולהתחיל את התוכנית. ואז להשליך את הפתרון בצינורות ולשטוף את טיפים השורש פעמיים עם מים מזוקקים כפול במשך חמש דקות כל אחד.לשטיפת המים המזוקקת הכפולה השלישית והרביעית, יש להשתמש במיקרוגל כדי לסייע בכביסה. לאחר 40 השניות הראשונות של שטיפת מים מזוקקת כפולה, מוציאים את דגימות קצה השורש מהמיקרוגל ומחליפים את המים המזוקקים הכפולים במים מזוקקים כפולים טריים. תחזיר את הדגימות למיקרוגל ותמשיך בתוכנית.הבא, להכין פתרון TCH על ידי הוספת 0.1 גרם של thiocarbohydrazide ל 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים בצינור 15 מיליליטר. מניחים את הצינור בתנור ומחממים ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה כדי להתמוסס. לאחר מכן סנן את פתרון TCH באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר 0.22.החלף מיד את הפתרון בצינורות לדוגמה בפתרון TCH המסונן והמשך בפרוטוקול. עכשיו לטבול את הדגימות באתנול ולכניס אותם לתוך המיקרוגל להתייבש בשלבים מדורגים של 50%70%90% ולאחר מכן פעמיים של 100% טיפול אתנול. לאחר טיפול התייבשות תחמוצת פרופילן, להוסיף 50% שרף של Spurr לתוך הצינורות כדי להתחיל לחדור של טיפים השורש במשך מינימום של שעתיים.לאחר הדגירה הסופית בשרף של 100% Spurr, מניחים את קצות השורש בתבניות הטבעה וממלאים את התבניות בשרף טרי של 100% Spurr ומפלילים בתנור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 36 עד 48 שעות. ראשית, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך בערך את הדגימה המפולגת לבלוק דק. כאשר הצד חשף רקמות הפונות כלפי מטה, חבר את הדגימה למרכז סיכת מתכת עם שרף אפוקסי מוליך כדי שהרקמות יגעו בפין המתכת.מניחים את הדגימה בתנור ב 65 מעלות צלזיוס כדי לרפא את אפוקסי לילה. בבוקר, לטעון את סיכת המתכת לתוך המוביל ולהשתמש סכין גילוח כדי להסיר כל אפוקסי עודף מהדגימה. כדי להחליק עוד יותר את פני המדגם, טען את המנשא עם סיכת המתכת במחזיק עבור האולטרה-מיקרוטום.באולטרה-מיקרוטום, השתמש בסכין זכוכית או יהלום כדי להחליק את פני הצדדים של הבלוק ויוצרים פירמידה. ודא כי לפחות חלק מהרקמות כבר חשוף על פני הבלוק. לאחר מכן מניחים את בלוק הדגימה החתוך במעיל sputter ולהתאים את ההגדרות פלטינה ב 2 עד 5 ננומטר כדי לצפות את המדגם עם שכבה דקה.הכנס את המוביל למיקרוסקופ SBF-SEM. קרב את סכין היהלום למשטח הדגימה וחתוך את החלק העליון של הדגימה כדי להסיר את שכבת הפלטינה ולחשוף חלק מהרקמות. לאחר מכן הגדר את המתח המואצת ל- 1.5 עד 2 קילו-וולט.לכוד תמונה של הרקמה והגדר רצף הדמיה. באמצעות תוכנת פיג'י, בחר קובץ, ייבוא, רצף תמונות ואתר את מחסנית התמונות כדי לטעון את התמונות. לאחר התאמת התמונה לפי כתב היד, בדוק את היישור על-ידי גלילה לאורך ערכת הנתונים.השתמש בפקודת השמירה תחת תפריט הקובץ כדי לשמור את ערכת הנתונים המיושרת כקובץ TIFF תלת-מימדי. נתח את ערכת הנתונים בקפידה כדי לראות אם ROI כלול ומכיל את המידע הדרוש לשאלה הביולוגית. בתמונה האחרונה של הערימה, שהיא פני הבלוק הנוכחיים במיקרוסקופ SBF-SEM, בחר ROI חדש עבור FIB-SEM.לאחר ציפוי עם פלטינה שוב, לטעון את המדגם לתוך FIB-SEM ולהשתמש גלאי אלקטרונים משני ב 15 קילובולטס ננו-אמפ אחד כדי לאתר את ROI מזוהה SBF-SEM על פני הבלוק. להזיז ולהטות את הבמה כדי להביא את ROI על המדגם לתוך נקודת צירוף מקרים של קרני FIB ו- SEM, באמצעות קרן FIB מערכת הזרקת גז. הפקד שכבת מגן מיקרומטר אחת של פלטינה על פני השטח מעל החזר ההשקעה.לאחר מכן, באמצעות זרם כרסום נמוך הנע בין 50 ל -100 פיקואמפים, טחנה קווים דקים לתוך תצהיר פלטינה עבור פוקוס אוטומטי ומעקב 3D במהלך הריצה הדמיה. לאחר מכן באמצעות זרם כרסום גבוה של 30 ננואמפ, טחנה תעלה של 30 מיקרומטר מול ROI יצירת משטח ההדמיה עבור קרן SEM. לאחר החלקת משטח התמונה, התחל את הפעלת ההדמיה ונטר את יציבות התהליך במהלך 50 עד 100 החלקים הראשונים.ברגע שהמערכת פועלת בצורה חלקה, לעזוב את החדר ולוודא כי יש הפרעה קטנה בחדר ככל האפשר. תמונות מ- SBF-SEM מספקות סקירה כללית של הרקמה המעניקה תובנה לגבי הכיוון המרחבי של תאים וחיבורים תאיים. הדמיית FIB-SEM שבאה לאחר מכן באזור חדש מוסיפה פירוט ברזולוציה גבוהה של תאים ומבנים ספציפיים.נתוני SBF-SEM מראים עיבוד שונה של הווקסלים שאינם איזוטרופיים מנתוני ה- FIB-SEM של הווקסל איזוטרופי. SBF-SEM מציג אפקט גרם מדרגות על פני השטח בעוד שנתונים FIB-SEM בעל חמשת מקטעי ננומטר מבטיח כי העיבוד נראה הרבה יותר חלק וחלקים בודדים להתמזג לתוך פני השטח לחלוטין. פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של אזור ייחודי בדגימה אחת בודדת וכל סטייה מזרימת העבודה עלולה לגרום נזק לדגימה, כך שלא ניתן להעביר את אזור העניין.

targeted-studies-using-serial-block-face-focused-ion-beam-scan

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד מוטבע שרף רקמת המוח יכול להיות מוכן צילמו בשלושת המימדים אלומת יונים ממוקדת, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

מקור: Mukherjee, K., et. al. ניתוח המיטוכונדריה במוח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פנים סדרתית. J. Vis. exp. (2016){סרטון זה מדגים את ההכנה,  הדמיה וניתוח של רקמת מוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוק-פנים סדרתי (SBFSEM) כדי להמחיש אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי, המאפשר מיפוי מדויק של המורפולוגיה וההתפלגות המרחבית שלהם בתאים עצביים אקסונליים ודנדריטיים.

 הדמיה של מיטוכונדריה עצבית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק-פנים סדרתי

הדמיה וניתוח מיטוכונדריאלי מרקמת מוח של יונקים היא משימה מאתגרת. כאן, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בניתוח שחזור תלת מימדי (תלת מימד) ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוק סדרתי (SBFSEM) כדי לקבל תובנות על הניתוח המורפולוגי והנפחי של אברון ייצור אנרגיה קריטי זה.

ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק

דוח זה מתאר פרוטוקול הכנת דגימה ותנאי הדמיה ספציפיים לביצוע טומוגרפיה אלקטרונית של שידור סריקה של דגימות ביולוגיות עבות.

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

מחקר זה מציג אמין וקל נהלי קבלת טורי ודק במיוחד חלקים מיקרואורגניזם ללא ציוד יקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

פרוטוקול זה מטרות תאים ספציפיים ברקמות עבור הדמיה ברזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). תחילה עם תמונה של מספר גדול של טורי מקטעים של שרף-מוטבע בחומר ביולוגי במיקרוסקופ אור כדי לזהות את המטרה ולאחר מכן באופן היררכי ב- SEM.

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

אנו מתארים את הכנת רצועות של מקטעים טוריים ואת האוסף שלהם על תמיכה בהעברה גדולה לשימוש כדגימות טומוגרפיה של מערך, יחד עם הליכי הדמיה אוטומטיים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. הפרוטוקול מאפשר סינון, אחזור והדמיה ממוקדת של אירועים מקומיים ונדירים ורכישת אמצעי אחסון גדולים של נתונים.

זרימת עבודה טומוגרפיה של מערך לרכישה ממוקדת של מידע אודות אמצעי אחסון באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר שיטה שגרתית לשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פנים טורי (SBF-SEM), טכניקת הדמיה תלת-ממדית רבת עוצמה. יישום מוצלח של צירי SBF-SEM על קיבוע נאות וטכניקות כתמי רקמות, כמו גם שיקול זהיר של הגדרות הדמיה. פרוטוקול זה מכיל שיקולים מעשיים לממותו של תהליך זה.

סריקת בלוק-פנים טורית מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) של דגימות רקמה ביולוגית

אנו מציגים מדריך מקיף להכנת מדגם יעד קבוע, איסוף נתונים ועיבוד נתונים עבור קריסטלוגרפיה סינכרוטרון סדרתית בקו קרן יהלום I24.

איסוף נתונים טוריים של יעד קבוע במקור אור יהלום

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתית (SBEM) מוחלת על תמונה ולנתח קוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס המורין.

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פרצוף בלוק (SBEM) לחקר קוצים דנדריטים

זרימת עבודה זו מאפשרת ייצור למלה המכוון למבנים ביולוגיים בעלי תווית פלואורסצנטית שהם קטנים (&lt;1 מיקרומטר בהיקף צירי) ונדירים (עותק אחד לתא) באמצעות פלטפורמת הדמיה תלת-צירית קריוגנית. פלטפורמה זו משלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כרסום קרן יונים ממוקדת ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק במיקום מוקד יחיד ומאפשרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בו זמנית בזמן הכרסום.

זרימת עבודה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אלקטרונים וקרן יונים קריוגני לכרסום ממוקד של תאים

למד פרוטוקול משולב לזיהוי אזורים ייחודיים בדגימות ביולוגיות מורכבות באמצעות מיקרוסקופיית סריקה אלקטרונית תלת-ממדית. השיטה מדגימה שורשי Arabidopsis thaliana לחקר מבנים תאיים מורכבים.

לימודי ממוקדות באמצעות פנים בלוק טורי וקרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ

גלה סרטונים נוספים