לימודי ממוקדות באמצעות פנים בלוק טורי וקרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ

כל פרויקט מדעי החיים הדורש חקירה אולטרה-מבנית תלת-מימדית של אזור מסוים של עניין במדגם ביולוגי מורכב יכול לעשות שימוש בטכניקה זו. הליך ההכנה לדוגמה זהה עבור שתי דרכים הדמיה להיות SBF / SEM ו FIB-SEM. השימוש במיקרוגל מאיץ באופן משמעותי את חלק העיבוד לדוגמה.

למרות המוצג כאן עבור טיפים שורש, פרוטוקול זה יכול לשמש עבור כל מערכת מודל ביולוגי עם התאמות מינימליות. לפני השימוש בזרימת עבודה זו לתכנות SBF/SEM ו- FIB-SEM, יש להכיר את הטכנולוגיות הבודדות. ביצוע שלבים מסוימים מוכח בקלות אך קשה לתאר בטקסט כתוב.

הדגמת ההליך תהיה פיטר בורגגריף שהוא טכנאי במעבדה שלנו. כדי להתחיל, לחתוך את קצות השורש של שתילים thaliana Arabidopsis קבוע על צלחות אגר ולשים שניים עד שלושה טיפים צינורות Eppendorf המכילים את אותו תיקון לילה בארבע מעלות צלזיוס. בבוקר, עם פיפטה, החלף את התיקון עם חיץ פוספט טוחן 0.1 ב pH 6.8 בצינורות עם הצינורות על שולחן מסתובב ב 100 סל"ד ולשטוף במשך 10 דקות.

לאחר מכן חזור על הכביסה באמצעות חיץ פוספט טרי חמש פעמים. במכסה המנוע אדים, לאחר לתקן את קצות השורש על ידי החלפת חיץ פוספט עם 2%osmium tetroxide ו 0.2% רותניום אדום ב 0.1 מאגר פוספט טוחנת ב pH 6.8 עם צינורות עם מכסים פתוחים במיקרוגל ולהתחיל את התוכנית. ואז להשליך את הפתרון בצינורות ולשטוף את טיפים השורש פעמיים עם מים מזוקקים כפול במשך חמש דקות כל אחד.

לשטיפת המים המזוקקת הכפולה השלישית והרביעית, יש להשתמש במיקרוגל כדי לסייע בכביסה. לאחר 40 השניות הראשונות של שטיפת מים מזוקקת כפולה, מוציאים את דגימות קצה השורש מהמיקרוגל ומחליפים את המים המזוקקים הכפולים במים מזוקקים כפולים טריים. תחזיר את הדגימות למיקרוגל ותמשיך בתוכנית.

הבא, להכין פתרון TCH על ידי הוספת 0.1 גרם של thiocarbohydrazide ל 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים בצינור 15 מיליליטר. מניחים את הצינור בתנור ומחממים ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה כדי להתמוסס. לאחר מכן סנן את פתרון TCH באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר 0.22.

החלף מיד את הפתרון בצינורות לדוגמה בפתרון TCH המסונן והמשך בפרוטוקול. עכשיו לטבול את הדגימות באתנול ולכניס אותם לתוך המיקרוגל להתייבש בשלבים מדורגים של 50%70%90% ולאחר מכן פעמיים של 100% טיפול אתנול. לאחר טיפול התייבשות תחמוצת פרופילן, להוסיף 50% שרף של Spurr לתוך הצינורות כדי להתחיל לחדור של טיפים השורש במשך מינימום של שעתיים.

לאחר הדגירה הסופית בשרף של 100% Spurr, מניחים את קצות השורש בתבניות הטבעה וממלאים את התבניות בשרף טרי של 100% Spurr ומפלילים בתנור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 36 עד 48 שעות. ראשית, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך בערך את הדגימה המפולגת לבלוק דק. כאשר הצד חשף רקמות הפונות כלפי מטה, חבר את הדגימה למרכז סיכת מתכת עם שרף אפוקסי מוליך כדי שהרקמות יגעו בפין המתכת.

מניחים את הדגימה בתנור ב 65 מעלות צלזיוס כדי לרפא את אפוקסי לילה. בבוקר, לטעון את סיכת המתכת לתוך המוביל ולהשתמש סכין גילוח כדי להסיר כל אפוקסי עודף מהדגימה. כדי להחליק עוד יותר את פני המדגם, טען את המנשא עם סיכת המתכת במחזיק עבור האולטרה-מיקרוטום.

באולטרה-מיקרוטום, השתמש בסכין זכוכית או יהלום כדי להחליק את פני הצדדים של הבלוק ויוצרים פירמידה. ודא כי לפחות חלק מהרקמות כבר חשוף על פני הבלוק. לאחר מכן מניחים את בלוק הדגימה החתוך במעיל sputter ולהתאים את ההגדרות פלטינה ב 2 עד 5 ננומטר כדי לצפות את המדגם עם שכבה דקה.

הכנס את המוביל למיקרוסקופ SBF-SEM. קרב את סכין היהלום למשטח הדגימה וחתוך את החלק העליון של הדגימה כדי להסיר את שכבת הפלטינה ולחשוף חלק מהרקמות. לאחר מכן הגדר את המתח המואצת ל- 1.5 עד 2 קילו-וולט.

לכוד תמונה של הרקמה והגדר רצף הדמיה. באמצעות תוכנת פיג'י, בחר קובץ, ייבוא, רצף תמונות ואתר את מחסנית התמונות כדי לטעון את התמונות. לאחר התאמת התמונה לפי כתב היד, בדוק את היישור על-ידי גלילה לאורך ערכת הנתונים.

השתמש בפקודת השמירה תחת תפריט הקובץ כדי לשמור את ערכת הנתונים המיושרת כקובץ TIFF תלת-מימדי. נתח את ערכת הנתונים בקפידה כדי לראות אם ROI כלול ומכיל את המידע הדרוש לשאלה הביולוגית. בתמונה האחרונה של הערימה, שהיא פני הבלוק הנוכחיים במיקרוסקופ SBF-SEM, בחר ROI חדש עבור FIB-SEM.

לאחר ציפוי עם פלטינה שוב, לטעון את המדגם לתוך FIB-SEM ולהשתמש גלאי אלקטרונים משני ב 15 קילובולטס ננו-אמפ אחד כדי לאתר את ROI מזוהה SBF-SEM על פני הבלוק. להזיז ולהטות את הבמה כדי להביא את ROI על המדגם לתוך נקודת צירוף מקרים של קרני FIB ו- SEM, באמצעות קרן FIB מערכת הזרקת גז. הפקד שכבת מגן מיקרומטר אחת של פלטינה על פני השטח מעל החזר ההשקעה.

לאחר מכן, באמצעות זרם כרסום נמוך הנע בין 50 ל -100 פיקואמפים, טחנה קווים דקים לתוך תצהיר פלטינה עבור פוקוס אוטומטי ומעקב 3D במהלך הריצה הדמיה. לאחר מכן באמצעות זרם כרסום גבוה של 30 ננואמפ, טחנה תעלה של 30 מיקרומטר מול ROI יצירת משטח ההדמיה עבור קרן SEM. לאחר החלקת משטח התמונה, התחל את הפעלת ההדמיה ונטר את יציבות התהליך במהלך 50 עד 100 החלקים הראשונים.

ברגע שהמערכת פועלת בצורה חלקה, לעזוב את החדר ולוודא כי יש הפרעה קטנה בחדר ככל האפשר. תמונות מ- SBF-SEM מספקות סקירה כללית של הרקמה המעניקה תובנה לגבי הכיוון המרחבי של תאים וחיבורים תאיים. הדמיית FIB-SEM שבאה לאחר מכן באזור חדש מוסיפה פירוט ברזולוציה גבוהה של תאים ומבנים ספציפיים.

נתוני SBF-SEM מראים עיבוד שונה של הווקסלים שאינם איזוטרופיים מנתוני ה- FIB-SEM של הווקסל איזוטרופי. SBF-SEM מציג אפקט גרם מדרגות על פני השטח בעוד שנתונים FIB-SEM בעל חמשת מקטעי ננומטר מבטיח כי העיבוד נראה הרבה יותר חלק וחלקים בודדים להתמזג לתוך פני השטח לחלוטין. פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של אזור ייחודי בדגימה אחת בודדת וכל סטייה מזרימת העבודה עלולה לגרום נזק לדגימה, כך שלא ניתן להעביר את אזור העניין.