מלנומה מטופלת-נגזר מודל Xenograft

PDX חוללה מהפכה במחקרים הקדם-קליניים הניסיוניים לסרטן. עכשיו אנחנו יכולים לחקות, במעבדה, את מה שקורה בחולים. ועכשיו אנחנו יכולים לעבוד על איך להתגבר על ההתנגדות ואיך, על הקדנציה הארוכה, אנחנו יכולים להגדיל את ההישרדות של חולים.

הדגמת ההליך תהיה מין שיאו. כדי להתחיל, להעביר רקמת מלנומה שנאספו בעבר לצלחת פטרי סטרילית. עבודה עם מספריים כירורגיים, להב אזמל, מדפים, תחילה להסיר רקמה נורמלית מן הרקמה הרגילה ככל האפשר.

ואז להסיר את הרקמה הנקרוטית מזוהה על ידי רקמה לבנה חיוורת הממוקמת במרכז בתוך הגידול. לאחר מכן השתמש אזמל כדי subdivide נתח הגידול הראשוני לתוך חתיכות שוות בקירוב עבור השתלת עכבר כירורגית. אם רקמת הגידול קשה מדי עבור דיסוציאציה מכנית, להשתמש באזמל כדי לטחון את נתחי הגידול דק ככל האפשר כדי ליצור תרחיף.

מעבירים את התבלינים לצינור של 50 מיליליטר עם תווי מלח מאוזנים קרים של האנק ללא יוני סידן ומגנזיום. צנטריפוגה ב 220 פעמים g במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת supernatant, להשעות מחדש את תרחיף ב 10 מיליליטר של מחומם, טרי לעכל מדיה לכל גרם אחד של רקמת הגידול.

מניחים את הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ומערבבים במרץ כל חמש דקות עם פיפטה חד פעמית. לשטוף את תרחיף באמצעות עד 50 מיליליטר של HBSS, צנטריפוגה ב 220 פעמים g במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להסיר את העל טבעי. מוסיפים חמישה מיליליטר של חיץ TEG מחומם מראש לגרם אחד של רקמת הגידול, לנער כדי להשעות מחדש בעדינות, ולמקום את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות, ללא ערבוב.

כדי להתרווה טריפסין, להוסיף לפחות נפח שווה אחד של מדיה מכתים קר צנטריפוגה ב 220 פעמים g במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת supernatant, להוסיף 10 מיליליטר של מדיה מכתים לכל גרם אחד של רקמת הגידול, ולהשעות מחדש את גלולה על ידי צינור למעלה ולמטה. לסנן אותו דרך מסננת תא 40 מיקרומטר כדי לקבל השעיה תא יחיד להזרקת עכבר.

כדי להשתיל כריתה כירורגית או רקמת ביופסיה כירורגית, ראשית לגלח את השיער מהגב התחתון של NSG שישה עד שמונה שבועות עכברים הרדמה, משאיר כ 1.5 ס"מ עד שלושה סנטימטרים שטח ללא שיער. הכינו נתחי גידול, וחלקו תרחיף גידולים בפטרי לתלים בודדים להשתלה כירורגית. באמצעות להב אזמל, לבצע חתך באורך כחמישה מילימטרים על מרכז החלק האחורי של העכבר.

עם זוג אחד של מדפים, חיים את העור בצד החתך מול המפעיל. עם מספריים ביד השנייה, להפריד את העור משכבת השריר על ידי חיתוך בעדינות את קרום fascial עם חתכים מספריים קטנים, ובכך ליצור כיס עבור רקמת הגידול. השתמש בלהב אזמל להרים צ'אק גידול אחד, כמו גם תל אחד בודדים של רקמת תרחיף הגידול, בעדינות למקם את הרקמה לתוך הכיס שנוצר.

לאחר מכן להוסיף 100 microliters של מטריצה חוץ תאית מלאכותית על התל רקמת הגידול בכיס. באמצעות שני זוגות של מעצורים, למשוך את החתך בשני הקצוות, כך קצוות הפצע להתקרב זה לזה. לאחר מכן להחיל אחד או שניים פצע קליפים כדי לסגור את הפצע.

באופן תת עורי להזריק אחד עד חמישה מיליגרם לקילוגרם של משכך כאבים. כאשר הריפוי הוא לחלוטין, לאחר כשבעה ימים, להסיר את קליפים הפצע. לפקח על עכברים פעם בשבוע כדי לבדוק גידולים מוחשיים.

לאחר גידולים להגיע לנפח הרצוי, להשתמש מדפים כירורגיים כדי להרים את העור סמוך לגידול של העכבר המתת דם ולעשות חתך אופקי באמצעות מספריים מעוקל. השתמש בטכניקת הפרדה בוטה כדי לגייס את העור משני צידי הגידול ועל הגידול, חושף את הגידול. השתמש מספריים להב אזמל כדי להפריד את הגידול מן fascia.

חותכים את הגידול ומעבירים אותו לצלחת פטרי סטרילית. חותכים את הגידול לחתיכות קטנות ולהסיר רקמה נמקית מהגידול. כדי לבנק רקמת הגידול להשתלה עתידית, לקחת שתיים עד שלוש חתיכות גידול קטנות טחון אותם לחתיכות קטנות יותר מאחד על אחד מילימטר.

מעבירים את כל הרקמה הטחון לתועבה קריוגנית של שני מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של מדיה קפואה ומערבבים היטב. מניחים את הבקבוקונים לתוך מיכל הקפאת תאים מקורר מראש על קרח יבש, מאחסנים את המיכל במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס לילה, ולאחר מכן מעבירים את הבקבוקונים לאחסון חנקן נוזלי.

כדי לשבור את רקמת ההקפאה עבור assays במורד הזרם, למקם את חתיכות רקמת הגידול לתוך בקבוקון קריוגני, לשים את הנתעב קריוגניים בחנקן נוזלי מיד, ולאחסן את הבקבוקונים במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. כאשר שלוש שיטות שונות של גידול רקמת הגידול הושוו, השעיה של תא יחיד של תאים סרטניים עם השימוש בעיכול אנזימטי היה מוצלח ביותר. מלבד מתן אפשרות לצמיחה מהירה יותר של הגידול, זה היה גם מספיק עבור גידול ראשוני אחד להיות מורחב לתוך 10 עד 20 עכברים, ואילו צ'אק הגידול שיטת תרחיף ניתן להרחיב רק לתוך חמישה עד 10 עכברים.

מודלים קסנוגרפט שמקורם במלנומה המטופל לעתים קרובות משקפים את הרגישות לתרופות שהמטופל הפגין בעת הטיפול. קסנוגרפט שמקורו בחולה מלנומה שהגיב בתחילה למעכב BRAF, אך בסופו של דבר התדרדר, הפגין גם רגישות ראשונית לעיכוב חלבון BRAF, בתוספת מעכבי קינאז MEK, אך הגידולים בסופו של דבר התדרדרו. זה קריטי לטפל בעת הכנת רקמת PDX לבנקאות, כמו זה יבטיח הצלחה הרחבות PDX בעתיד, ניסויים טיפוליים, כמו גם אפיון.

עם חומר PDX, רצף RNA של תא יחיד, רצף exome שלם, ואפיון פרוטומי, הם בין השיטות הרבות שהמעבדה שלנו ממנפת כדי לנתח התנגדות לטיפול. טכניקת PDX מאפשרת לחוקרים לחקור עמידות טיפולית באמצעות תאים סרטניים אשר טוב יותר לסכם את הביולוגיה הגידול בחולה אנושי יחסית מודלים סרטניים מסורתיים גדל על פלסטיק. יתרון זה מאפשר תובנות חזויות יותר.

החוקרים צריכים תמיד לטפל ולהשתמש באבטחה ביולוגית רמה שני אמצעי זהירות בעת טיפול רקמת הגידול נגזר חולה אנושי.