הערכה של השפות הגרעין של העדשה Zebrafish ושלמות הsutural

הפרוטוקולים שלנו מספקים נקודת התחלה למחקרים פונקציונליים של התפתחות עדשות ופיזיולוגיה ולהקרנה גנטית הפוכה של פנוטיפים של עדשות בזברה- דגי זברה. הפרוטוקולים שלנו מגשרים במבחנה וב-vivo מנתחים את המורפולוגיה של עדשת הזברה ומספקים שיטה חדשה וישירה לכמת את התפתחות האופטיקה של עדשות הזברה. ניתוח מורפולוגיה ואופטיקה של עדשות זברה מוביל לתובנות על מנגנונים השולטים בפיתוח העדשות, פיזיולוגיה תקינה ופתופיזיולוגיה.

תובנות אלה יכולות בתורן להוביל ליכולת לעכב או למנוע קטרקט. לא היו דיווחים על מינים אחרים מלבד דגי זברה של גרעיני עדשה מקומיים א-סימטריים. זיהוי תפרים של העדשה הוא קריטי לכוון נכון את העדשה כדי למדוד לוקליזציה של גרעין.

לאחר אישור של סם מספיק עם Tricaine, להשתמש מספריים microdissection מיד excise שתי העיניים ממבוגר או זברה-דג זחל ולמקם את שתי העיניים לתוך צלחת פטרי 35 מילימטר בהתאמה אישית עם תבנית ניתוח סיליקון מלא PBS. כדי לקצור את העדשה דג זברה בוגר, מניחים את צד העין האחורי למעלה ומכניסים מדפים בזווית של פחות מ-45 מעלות דרך הדיסק האופטי. השתמש מספריים ניתוח לעשות שניים או שלושה חתכים רדיאליים דרך הרשתית וסקלרה מן הדיסק האופטי לאזור ciliary בעין משותקת לקלף בחזרה את הרשתית ואת sclera כמו עלי כותרת של פרחים.

להפוך את העין, קרנית בצד למעלה, ולהשתמש בצד השטוח של המספריים כדי לשתק את העדשה בעקיפין באמצעות מניפולציה של sclera ו קרנית באמצעות מלקחיים כדי למשוך את הרשתית ואת הרקמות המחוברות, ואז בזהירות לקצץ כל רקמה עודפת מן העדשה. עבור קציר עדשות זברה זחל, מניחים צד אחורי עין זחל על החלק השטוח של צלחת סיליקון של PBS ולהשתמש במחט טונגסטן מחודדת לעשות חתכים רדיאליים דרך הרשתית וסקלרה תוך קיבוע העין עם מחט אחרת או מלקחיים, ואז בעדינות לגרוף את העדשה מן העין המנושלת עם הצד הקהה של מחט חוט טונגסטן בהתאמה אישית בזהירות למשוך את הרקמה כדי למדוד את לוקליזציה של עדשת הציר הקדמי-אחורי, כוון את העדשות הטריות באופן אקסיאלי ב- PBS בצלחת של 35 מילימטר עם תחתית זכוכית כיסוי עם הקטבים והתפרים המכוונים במקביל למישור המיקוד.

כדי לזהות את גרעין העדשה, חפשו הבדל במדד השבר, המתרחש בדרך כלל בממשק של קליפת המוח של העדשה וגרעין העדשה. אם התפרים העדשה אינם גלויים, ללקק קל עם מלקחיים לכמוסת העדשה מגלה את התפרים ואת גרעין העדשה, עוזר לכוון את העדשה למדידה. מניחים את המנה על הבמה של מיקרוסקופ ניתוח מצויד במצלמה ולצלם את העדשות עם גרעין העדשה בפוקוס תחת תאורת שדה בהיר או עם אופטיקה ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית.

תדמיין מיקרומטר תחת אותה הגדלה לכיול ולחץ על תצוגה חיה. לחצו על 'תמונה' כדי להשיג תמונה ולשמור את התמונה כקובץ TIFF. כדי לכייל את תמונות העדשה שנרכשו, בתוכנה מתאימה לעיבוד תמונה, בחר בכלי הקו הישר וצייר קו באורך ידוע על תמונת המיקרומטר.

לחץ על נתח והגדר קנה מידה והזן את המרחק והיחידות הידועים ולאחר מכן בחר כיול כללי ולחץ על אישור. כדי למדוד את המרחק ממרכז גרעין העדשה לקוטב הקדמי, זהה את מיקום תפר העדשה ולהשתמש בכלי הקו הישר כדי למתוח קו לאורך מרכז התמונה של גרעין העדשה בכיוון אקסיאלי. מרכז הקו הזה הוא מרכז גרעין העדשה. צייר קו נוסף מנקודה זו לקוטב הקדמי של העדשה ובחר למדוד בתפריט ניתוח כדי למדוד את המרחק.

צייר קו נוסף מהקוטב הקדמי לקוטב האחורי ולמדוד מרחק זה כמו קוטר העדשה, ולאחר מכן להעתיק אורכים אלה מחלון התוצאות לגיליון אלקטרוני ולחשב את לוקליזציה מנורמל של גרעין העדשה ביחס לרדיוס העדשה. על ידי שלושה ימים לאחר ההפריה, תפרים לפני הקוטב הראשון ואת ההתכנסות הבולטת של תאים הוא דמיין בבירור על ידי הכתמת פאלואין של קרום התא סיבים צרים בעוברים קבועים. תיוג חזק יותר של תאים בעלי סיבים רחבים בממברנה של עדשה mApple מהויר מאפשר הדמיה חיה של תת-דומיין של קרום, אך חסר התכנסות סוטורית.

תפרים אחוריים ניתן לדמיין הן במבחנה והן במבחנה בשלושה ימים לאחר ההפריה. במישור קו המשווה, פאלודין מתייג בחוזקה את תאי הסיבים קליפתיים החיצוניים, וחושף צורת משושה שטוחה. פאלודין אינו נכלל בגרעין העדשה הדחוס וסוג הבר ועדשת המוטנטים נראים בלתי ניתנים להבחנה.

התיוג החזק של תאי סיבים רחבים בפסיפסים mApple מקומיים עדשה לחשוף שיבושים בנפח התא בתוך העדשה מוטציה. כמו ביטוי מהודק אינו מוגבל על ידי חדרות, כמה פסיפסים לחשוף תיוג גרעין העדשה. בבעלי חיים מסוג בר, גרעין העדשה מתחיל קרוב יותר לקוטב העדשה לפני תחילת ההתפתחות לפני הריכוז במהלך הבגרות.

ביטוי של חלבונים מתויגים בירוק במארח מהונדס שבו קרום התא פלואורסצנטי אדום מאפשר לוקליזציה של חלבון בו זמנית, כמו גם הערכה של מורפולוגיה של תאי סיבים ב vivo. דגי זברה מתאימים במיוחד למחקרי ויוו. באמצעות הכלים המתוארים כאן, אנו יכולים לחקור מנגנוני עדשה, נחקרו בעיקר במבחנה, במערכת in vivo.